Introduction
Bakterier har utviklet seg til å svare på mange stressende forhold. Et generelt trekk ved tilpasning til stress er en endring i vekstdynamikk 1,2. Vekst dynamikk kjennetegnes hovedsakelig av to parametre: den eksponentielle veksten rente og lag tid, nemlig tiden det tar å tilpasse seg nye forhold. Mens et stort antall av høy gjennomstrømning metoder fokuserer på målinger av veksthastigheten, er lag tid ofte en oversett parameter, selv om det er den avgjørende parameter for karakterisering av tilpasningen til nye betingelser. Kvantifisering av tilpasning til endrede forhold har tradisjonelt blitt utført ved hjelp av arbeidskrevende manuelle metoder 3,4. Mer nylig har avanserte teknikker blitt utviklet for analyse av enkeltceller 5,6. Imidlertid er det fremdeles vanskelig å skille normal vekst etter en forsinkelse i vekst (dvs. en oppholdstid) 2,3 fra langsom vekst. En automatisert metode ble bygget, ScanLag 7, tilskjelne mellom disse to lignende fenotyper.
Et slående eksempel på viktigheten av studiet av lag tid fordelingen er avslørt etter antibiotikabehandling. Mange antibiotika og andre påkjenninger drepe bare aktivt voksende celler, og derfor celler som er "lagging" er beskyttet 8.. For å overvåke lag tid, kan man observere enkeltceller under et mikroskop og overvåke tiden til første divisjon. En stor ulempe med denne metoden er at den dynamiske tidsområde er begrenset; de celler som vokser tidlig dekke overflaten på en eksponentiell hastighet, effektivt redusere veksten av celler med lengre oppholdstid. Bruk av strømningskamrene noe omgår denne 5, men et begrenset antall celler kan bli sporet og den del av bakterier som kommer ut fra følgefase etter at størstedelen av befolkningen har begynt å vokse, kan ikke observeres. Til tross for disse begrensninger har flere studier evaluert påvirkning av nivået av different streker på lag tid distribusjon med enkelt celle mikros 9-12. En annen måte å overvåke oppholdstid fordelingen er ved turbiditetsmålinger 13,14. Mange parallelle kulturer, hver gang fra en enkelt celle, ble dyrket i en optisk densitet leser som måler antallet bakterier i kultur over tid. Denne metoden er begrenset av nøyaktigheten av den ekstrapolering og til antallet brønner i en plate.
En automatisert metoden ble utviklet, kalt ScanLag, som gjør det mulig for lag ganger og vekst tids distribusjoner som skal vurderes, selv for den lille prosentandelen av bakterier i en befolkning som har svært lange etterslep ganger. Fremgangsmåten er basert på deteksjon av kolonier på konvensjonelle nærings agarplater 15 (figur 1). For å automatisere deteksjon 16,17 en rekke kommersielle skannere 18 som er rettet av i huset programvaren regelmessig hente bilder av platene, ble konstruert. Programvare varutformet for automatisk å analysere bildene og ekstraher kvantitative parametre 19,20, slik som tidspunktet for opptreden av hver koloni og veksttiden for hver koloni, som er definert her som den tid til å vokse fra 20 piksler til 80 piksler. Her presenterer vi metoden i detalj, inkludert oppsett av systemet, og bruken av det automatiserte bildeanalyse-programvare som er blitt forbedret med en bedre brukergrensesnittet.
Denne metoden kan være tilpasset for å måle andre egenskaper av kolonier, som morfologi og farge. Måling av disse typer parametere vil tillate systemets bruk i flerdimensjonale phenomics. Ettersom metoden detekterer kolonier fra enkeltceller, kan systemet avsløre nye fenotyper som ikke lar seg måle ved populasjonsnivå-målinger. Teknikken gjør det mulig å oppdage og gjenfinning av sjeldne varianter, og legger til rette for screening for ønskede egenskaper.
Protocol
En. Bygg Setup
- Velg en planskanner med optisk oppløsning: 4800 dpi; Hardware oppløsning: 4800 x 9600 dpi; farge bitdybde: 48 bit, som kan operere på de aktuelle temperatur og luftfuktighet.
- Petriskåler har betydelig volum, i motsetning til papir vanligvis brukes på kommersielle skannere. Koloniene ligge på toppen av agar lag, omtrent 5 mm over skannerens overflate. Merk: For de fleste skannere koloniene vil være i fokus.
- Enkelte skanner selskaper ikke tillater tilkobling av mer enn én forekomst av skanner av samme type til samme datamaskin. Sørg for at mer enn en scanner kan festes og identifiseres unikt.
- Forbered tilbehøret som beskrevet nedenfor:
- Forbered stykker av sterile svart følte klut til å dekke platene (Figur 1 trinn 2).
- For å holde petriskåler på plass, forberede hvite plateholdere (Materialer og metoder) som passer skannerne og som har seks holes størrelsen av rettene (figur 1 trinn 3).
- Hvis det er nødvendig for vekst av mikroorganismen, sette skannere i et temperaturkontrollert miljø. Koble skannerne til datamaskinen.
- Valgfritt: Koble releet til datamaskinen og hoppe på / av-bryteren på skanneren for å overvinne temperaturgradient.
MERK: Reléenheten er for ekstremt temperaturfølsomme mikroorganismer. Den slås av skanneren, slik at elektronikken ikke varme overflaten ujevnt. Ved hjelp av bare en del av skanneren overflaten kan oppnå samme resultat.
2. Installer skanneansvarlig
- Kopier alle 'Scanning manager' applikasjonsfiler til en utpekt katalog fra http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html.
- Konfigurer ScanningManager.exe.config filen i samsvar med skannere navnene slik de vises i Datamaskinbehandling-> Enhetsbehandling-> Imaging Devices (
- For feilsøking av "Scanning Manager", se Les meg-filen.
- For ytterligere dokumentasjon på "Scanning Manager", se Documentation.html.
Tre. Utføre et eksperiment
- Klargjør petriskåler (figur 1):
- Fortynn kulturen til omtrent 2.000 CFU / ml. Plate 0,1 ml av kulturen jevnt på plateoverflaten.
- For å få god kontrast mellom koloniene og fatet og til å absorbere fuktighet, dekker plate med et stykke steril svart følte klut. Sett lokket på tallerkenen.
- Plasser platene i holderne på skannerne.
- Start Scanning Behandling (figur 3): Velg de deltakende skannere fra listen over tilknyttede skannere. Velg antall bilder som skal tas (gjentakelser), tidsintervallet mellom etterfølgende bilder (Time gap), og tidsforsinkelsen før du starter than eksperimentere (starte etter).
4. Analyse av Images
MERK: Et omriss av beregningsmetoder er gitt for å analysere bildene i MATLAB ved hjelp av "ScanLag", som er fritt tilgjengelig for ikke-kommersiell bruk på http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications. html. Flere funksjoner som er tilgjengelige er beskrevet i programvarehåndboken, og et eksempel kode er supplert.
- Sortere bildene fra hver skanner i egne mapper.
- Matlab kommando vinduet, kjøre følgende prosedyrer. Parametrene som kreves for å kjøre disse prosedyrene er definert i programvarehåndboken.
- Kjør PreparePictures å utføre forbehandling: I forbehandling, er bildene fra en skanner justert. Hver petriskål beskjæres fra hver sekvens av bilder. Den tiden hvor hvert bilde ble samlet hentes fra tidsstempel.
- Kjør TLAllPlates å utføre gjenkjenning og sporing I each petriskål separat, er kolonier registrert og tildelt et identifikasjonsnummer.
- Analyse av det ekstraherte data: Størrelsene på hver detektert koloni blir målt som en funksjon av tid. Hvis du vil trekke utseendet fordelingen av kolonier bruke følgende funksjoner i Matlab kommandovinduet (ytterligere informasjon er tilgjengelig i programvarehåndboken):
- Løpe ScanLagApp å vise analyse av en viss petriskål sammen med grafen koloniene størrelse versus tid (figur 4).
- Bruk glidebryteren for å endre gjeldende tid av platen. Tidspunktet vil også angis med en tilsvarende vertikal linje på koloniene området grafen.
- Klikk på en koloni for å se tilhørende kurve, og vice versa, klikk på en kurve for å finne den tilhørende koloni. Etter å identifisere kolonien, kan fenotypen hentes ved å plukke kolonien fra den identifiserte petriskål.
- Filtrer mangler ved automatisk analyse av choosynge en koloni, og klikke på utelukke knappen. Når du klikker utelukke antall kolonien blir gul.
- Etter å ha gått gjennom resultatene av analysen av hver plate, oppsummere resultatene:
- Kjør AddHistograms å opprette et histogram av utseende ganger.
- Kjør plotDeathCurve å lage en overlevelseskurve representasjon av fordelingen.
- Løpe GetAppearanceTimes for å få utseende tiden av alle koloniene i forsøket.
- Løpe ScanLagApp å vise analyse av en viss petriskål sammen med grafen koloniene størrelse versus tid (figur 4).
Representative Results
Som et eksempel på lag tid fordelings ekstraksjon, figur 5 viser evnen hos ScanLag å identifisere og spore hver koloni med spesifikke egenskaper på en plate over tid, som vil bli gjort i en screeningsanalyse.
Når kulturen av mikroorganismen er heterogen, kan de forskjellige subpopulasjoner avsløre seg selv i løpet av analysen. For eksempel, figur 6 viser utseendet kvantifisering og derved avdekker bimodal oppholdstid fordeling i en mutant stamme av E. coli.
Veksten av cellene påvirker utseendet tid av kolonien. Når kolonier vokse i samme takt, kan den avdøde utseende tilskrives lag tid (figur 7).
For å validere at metoden faktisk måler lag tid av enkeltceller, vi sammenlignet ScanLag resultater med de som ble oppnådd ved hjelp av encellede mikroskopi; denne valideringen er synkenderibed i detalj i en tidligere publikasjon 7. Denne metoden muliggjør overvåking av mange flere celler enn det som kan evalueres med mikroskopi. Resultatene oppnådd ved hjelp av mikroskopi og oppnådd ved hjelp av ScanLag fordelinger i stor grad overlappende. Den ScanLag fordelingen er litt bredere; teoretiske analyser forutsi utvide å være i størrelsesorden av standardavviket til fordelingen tid. Hvis veksten er forskjellig for hver stamme, må opprinnelsen til forsinkelsen i utseende bli ytterligere undersøkt ved hjelp av andre metoder.
Påvirkningen av tidlige-vises kolonier på utseendet på senere kolonier ble undersøkt. Kontrollforsøk 7 bekreftet at senere utseende ikke ble påvirket så lenge som det totale antall kolonier per plate ikke oversteg 200 (figur 8). En annen kontrolleksperiment bekreftet at plasseringen av kolonien på plate ikke var påvirker utseendet time 7.
Analysen av plates er kalibrert til bestemte terskler som kan trenge modifisering avhengig av næringsstoffer til stede i vekstmediet eller den type mikroorganisme. Ikke desto mindre, er analysen ganske robust for et stort spekter av terskler, som vist i figur 9..
Figur 1. En skjematisk diagram av fremgangsmåten for å lage en koloni utseende fordeling.
Figur 2. Et skjermbilde av Enhetsbehandling viser navnene på de vedlagte skannere og på konfigurasjonsfilen. Vennligst klikk her for å se en størreversjon av dette tallet.
Figur 3. Et skjermbilde av skanne Manager.
Figur 4 Et skjermbilde av ScanLagApp.. Et bilde av platen er på ruten til venstre, og vekstkurver for hver koloni er på den høyre ruten, som beskrevet i manualen. Piggene i noen av koloniene i området kurvene oppstår når to eller flere kolonier fusjonere. Ved sammenslåing av kolonier skjer, er det området av disse koloniene betraktes som felles-området.
Figur 5. Et representativt resultat av analysen av en plate. (A) Et bilde av utgangssignalet fra deteksjonen anvendelse ved slutten av forsøket. Hver koloni område er identifisert, farget og tildeles med et unikt ID-nummer. Pilene peker representative kolonier målt i B. Kolonien oppdages basert på intensitet terskel (For E. coli kolonier på LB agar eller M9 agar denne terskelen er 0,03. For andre medier eller bakterier, denne terskelen kan justeres i funksjons ProcessPictures ). Kun objekter over 10 piksler telles (denne terskelen kan bli endret i funksjons MatchColonies). Påvisning av en koloni starter på cirka 10 5 bakterier. (B) plott over området i piksler versus tid for fire representative kolonier i denne plate. Den "utseende time 'av hver koloni er når koloni blir detektert. Den 'veksttid' i hver koloni er her definert som den tid til å vokse from 20 piksler til 80 piksler (disse grensene kan justeres ved hjelp av funksjonen getAppearanceGrowthByVec). Programvaren utelukker koloniene som fusjonerte før de når den øvre grensen. Identifikasjon av en bestemt koloni i henhold til dens egenskaper er enkel takket være identifikasjonsnummer og fargen tildelt hver koloni. For eksempel kolonier nr. 1, 56, 77 og 124 er uthevet i begge grafer.
Figur 6. Utseende kvantifisering kan avsløre bimodal lag tid distribusjon. Sammenligning av ScanLag analyse histogrammer av utseende ganger for to forskjellige stammer. Blå linje: vill type belastning eksponentielt voksende (Totalt: 1320 kolonier); rød linje-høy utholdenhet mutant beriket med lagging bakterier (Totalt: 1529 kolonier). (A) Normalisert utseende histogrammer. Toppenav utseendet av eksponentielt voksende celler er den typiske tid til å vokse til et detekterbart koloni. Innfelt: samme histogram av mutantstammen etter trekke tidspunktet for toppen av eksponensiell kultur for å få den faktiske oppholdstid på log-spaced binger som viser den bimodale oppholdstid fordeling. (B) Overlevelse funksjon av de samme dataene som i (A) på en logaritmisk skala. Denne representasjon forbedrer sen opptreden halen av mutantstammen.
Figur 7. Utseende fordeling og vekst tidsinndeling. (A) og (B) viser to dimensjonale histogrammer av utseendet tid og veksten tid av de to forskjellige forhold (Programvaren utelukker kolonier som flettes før de når den øvre grensen). (C) Sammenligning histogrammeneav de to stammene viser forskjellen i utseende tid, mens vekst ganger (D) er lik. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. Utseendet til tidlige kolonier ikke forstyrrer utseendet senere kolonier. (A) hylse tid fordeling av vill type celler belagt alene. (B) hylsetidsfordelingen av en kald følsom belastning alene, etter overføring til tillatelige temperatur. (C) hylsetidsfordelingen av begge stammer belagt sammen under de samme betingelser. Den svarte linjen representerer den forventede fordeling basert på dataene som oppnås ved måling av hver stamme for seg. En god enGreement mellom forventede og målte fordelinger oppnås så lenge som det totale antall kolonier per plate er under 200.
.. Figur 9 deteksjonsterskelen ikke påvirker formen på kolonien utseende fordeling Kolonien utseende fordeling ble analysert med hensyn på det samme datasettet ved hjelp av to forskjellige terskel størrelser; (A) terskel størrelse er 10 piksler; (B) terskel størrelse er 50 piksler. Antall celler per histogram: ca. 1500. Den annen deteksjonsterskelen resulterer bare i en forskyvning av deteksjonstiden.
Figur 10. Temperatur målinger stabilitets acrOss skannerens overflate. (A) Bilde av en plate med kolonier av Bacillus subtillis dyrket på skanneren uten strømstyring. Overflaten er varmere på bunnen og dermed kolonier vokse raskere. Den gradvise linje ved siden av platen er en skjematisk fremstilling av varmeovergangen. (B) Den temperaturstabilitet ble målt med to termoelementer plassert over overflaten på skanneren. Skanneren varmer opp under hver skanning og over tid. (C) Med Power Management, er temperaturen jevn og koloniene vokse med lignende priser. (D) Samme som (B) med Power Management modul. Temperaturstabilitet på ± 0,2 ° C.
Figur 11. Forskjeller i utseende fordelingen kan skyldes differences i volumene av solid medium. Den samme bakterie kulturen ble sådd ut på plater med forskjellige volumer av LB agar, noe som resulterer i en forskjellig høyde på agaroverflaten. De forskjellige høyder ført til forskjellige dekkevne av platene, og derfor en annen deteksjonstid. Den inter plater forskjellen ble sjekket og forskjellen mellom ulike høydeforhold. (A) Typiske forskjeller mellom plater av like volum av 30 ± 0,5 ml av LB-agar. (B) Forskjell mellom ulike høydeforhold: utseendet fordelingen ble målt for plater med volumer av 20 ± 0,5 ml (rød), på 30 ± 0,5 ml (grønn) og 40 ± 0,5 ml (blå). Hver tilstand er gjennomsnittet av seks forskjellige plater. Så lenge volumet av platene er innenfor ± 5 ml område Opasiteten er lik og fører til tilsvarende utseende tidsinndeling.
Discussion
Mikroskopiske metoder basert på direkte observasjon er ofte sett på som den "gylne standard" for å studere encellede atferd. ScanLag, som muliggjør måling av fordelingen av lag ganger i bakteriepopulasjoner, gir data i god overensstemmelse med den fordeling oppnådd fra enkeltcelleanalyse og oppnår mye høyere statistikk.
Flere kritiske trinn må utføres for at denne metoden skal fungere godt: første, ikke kompromisser på skanneroppløsning, noe som bør være 4800 x 9600 for å få gode bilder. For det andre, være klar over at uten strømstyring modulen (trinn 1,6), kan temperaturgradient utvikle seg på plans overflaten og påvirker vekst. Et annet viktig skritt er filtrering av defekter som støv som kan ha blitt feilaktig regnes som kolonier av programvaren. Den innebygde bakgrunns subtraksjon av programvaren overvinner vanligvis disse feilene, men noen ganger "falske" kolonier måmanuelt filtrert.
De viktigste feilsøkingstrinn kan løse inter-plate variasjon i oppsettet, på grunn av flere grunner: (a) Veksttakten av mikroorganismer blir påvirket av temperatur. Forskjellige temperatur-og fuktighetsforhold kan oppstå på grunn av ujevn ventilasjon eller plassering av fatet i inkubatoren. (B) Elektronikken i skanneren kan varmes opp og forårsake en temperatur-gradient tvers over overflaten av skanneren. Figur 10 viser påvirkningen av en slik romlig varme gradient på Bacillus bakterier, sammen med målinger av temperaturen på skanneoverflaten før og etter å implementere strømstyring modulen (trinn 1,6). Legg merke til at denne modul ikke er nødvendige for at nyere skannere, og hvis bare en del av skannerens overflate blir brukt, kan strømstyring være unødvendig. (C) Plater med forskjellig tetthet av agar næringsstoff kan føre til ulike nivåer av gjenkjenning. Figur 11 viser the toleranse for forskjellige volumer av næringsagar som resulterer i forskjellige uklarheter.
Eksperimentelt den ScanLag teknikk er enkel å utføre og krever kun til platen mikroorganismer på standard petriskåler, og å plassere dem på overflaten skanneren. Programvaren som ble utviklet kontrollerer hele prosedyren. Bildet Kjøpet er gjort automatisk, og bildeanalyse for koloni sporing er også automatisk. Videre kan systemet bli skalert opp for å måle mange forskjellige forhold på samme tid. Til slutt, avhengig av metoden på kommersielle kontor skannere og derfor er billig.
Denne teknikken kan utvides til studiet av mikroorganismer som er forskjellige fra E. coli K-12, men en rekke betraktninger må gjøres. For det første har de innflytelse på tidlige vises kolonier på de senere meldinger som skal vurderes, som beskrevet i detalj i en tidligere publikasjon 7.. For E. Coli K-12, ermaksimal tetthet av CFU per plate er 200. Andre stammer med forskjellige størrelser av kolonier, og andre mulige krysstale mellom koloniene, kan kreve en annen tetthet. For det andre, er analysen av platene kalibrert til spesifikke programvarebasert terskler som kan trenge å bli endret, avhengig av kontrasten mellom det faste mediet og de kolonier. Programvaren kan utvides også til å trekke andre koloni kjennetegn, utover etterslep og vekst. Programvarekoden er åpen og kan bli endret for å trekke koloni form, lysstyrke, glatthet og farge.
Fordi målingene er gjort på kolonier som stammer fra enkeltceller, Dataene avdekker nye fenotyper som ikke kan måles med befolkningsnivå målinger. Betydningen av forsinkelsen fordelingen er åpenbart i nærvær av antibiotika. Mange antibiotika er kjent for å være effektivt bare mot voksende celler; derfor, så lenge cellene forbli i lag fasen og ikke vokse, er de probeskyttes fra virkningene av disse antibiotika 21. Når antallet overlevende bakterier blir evaluert ved tidsintervaller under antibiotikabehandling 15,22,23, er en subpopulasjon av bakterier, kalt persisters, ofte avdekket. I visse tilfeller, immunitet mot antibiotikabehandling stammer fra langvarig lag. Ved hjelp av dette oppsettet, er dette etterslepet avslørt og ofte har en ikke-triviell distribusjon 24 (figur 6). Denne metoden gjør det også henting av sjeldne mutanter. For eksempel, etter å ha belagt en mutageniserte populasjon, mutanter kan bli identifisert basert på fenotype og isolert direkte, uten markering. Installasjonen kan også overvåke celle-celle interaksjoner ved å måle veksten av kolonier som en funksjon av tettheten av nærliggende kolonier og for å kvantifisere fenomener som bakteriekommunikasjon eller spredning av svermende bakterier. Flerdimensjonal informasjon avdekket av fremtidige eksperimenter ved hjelp av denne metoden vil føre til bedre karakterisering av tarmfloraens og til fremskritt innen medisinsk og miljøforskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Difco LB broth | BD | 240230 | |
| Petri dish 90 mm | Miniplast | 20090-01 | |
| Epson Perfection v37 | Epson | B11B207201 | Flatbed Scanner with Optical resolution: 4,800 dpi, Hardware Resolution: 4,800 x 9,600 dpi, color bit depth 48-bit. |
| Epson Perfection v200 | Epson | B11B188011 | |
| Epson Perfection 3490 | Epson | B11B177011 | |
| ADU200 USB Relay | ONTRAK | ||
| Pieces of sterile black felt cloth | Custom made | Approximatly 100 x 100 mm | |
| White plate holders | Custom made | Surface size, with 6 x 99 mm diameter hole | |
| Delerin rings the size of the Petri dish | Custom made | Inner diameter: 72 mm Outer diameter: 86 mm Top outer diameter: 90 mm |
References
- Bochner, B. R.
- Monod, J.
- Penfold, W. J.
- Powell, E. O. Growth rate and generation time of bacteria, with special reference to continuous culture. J Gen Microbiol. 15, 492-511 (1956).
- Elfwing, A., LeMarc, Y., Baranyi, J., Ballagi, A. Observing growth and division of large numbers of individual bacteria by image analysis. Applied and Environmental Microbiology. 70, 675-678 (2004).
- Hertog, A., et al. Simplified automated image analysis for detection and phenotyping of Mycobacterium tuberculosis on porous supports by monitoring growing microcolonies. PloS one. 5, (2010).
- Levin-Reisman, I., et al. Automated imaging with ScanLag reveals previously undetectable bacterial growth phenotypes. Nature Methods. 7, (2010).
- Lewis, K.
- Metris, A., George, S. M., Baranyi, J. Use of optical density detection times to assess the effect of acetic acid on single-cell kinetics. Applied and Environmental Microbiology. 72, 6674-6679 (2006).
- Niven, G. W., Fuks, T., Morton, J. S., Rua, S. A. C. G., Mackey, B. M. A novel method for measuring lag times in division of individual bacterial cells using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 65, 311-317 (2006).
- Niven, G. W., Morton, J. S., Fuks, T., Mackey, B. A. Influence of environmental stress on distributions of times to first division in Escherichia coli populations, as determined by digital-image analysis of individual cells. Applied and Environmental Microbiology. 74, 3757-3763 (2008).
- Pin, C., Baranyi, J. Single-cell and population lag times as a function of cell age. Applied and Environmental Microbiology. 74, 2534-2536 (2008).
- Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. Influence of stress on individual lag time distributions of Listeria monocytogenes. Applied and Environmental Microbiology. 71, 2940-2948 (2005).
- Metris, A., George, S. M., Peck, M. W., Baranyi, J. Distribution of turbidity detection times produced by single cell-generated bacterial populations. Journal of Microbiological Methods. 55, 821-827 (2003).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Glaser, D. A., Wattenburg, W. H. An automated system for the growth and analysis of large numbers of bacterial colonies using an environmental chamber and a computer-controlled flying-spot scanner. Ann N Y Acad Sci. 139, 243-257 (1966).
- Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. Automated image analysis of bacterial colony growth as a tool to study individual lag time distributions of immobilized cells. Journal of Microbiological Methods. 65, 324-334 (2006).
- Michel, J. B., Yeh, P. J., Chait, R., Moellering, R. C., Kishony, R. Drug interactions modulate the potential for evolution of resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14918-14923 (2008).
- Ernebjerg, M., Kishony, R. Distinct Growth Strategies of Soil Bacteria as Revealed by Large-Scale Colony Tracking. Applied and Environmental Microbiology. 78, 1345-1352 (2012).
- Rotem, E., et al. Regulation of phenotypic variability by a threshold-based mechanism underlies bacterial persistence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12541-12546 (2010).
- Bigger, J. The bactericidal action of penicillin on staphylococcus pyogenes. Irish Journal of Medical Science. 19, 585-595 (1944).
- Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli. BMC Microbiol. 13, 25 (2013).
- Moyed, H. S., Bertrand, K. P. Hipa a Newly Recognized Gene of Escherichia-Coli K-12 That Affects Frequency of Persistence after Inhibition of Murein Synthesis. Journal of Bacteriology. 155, 768-775 (1983).
- Balaban, N. Q. Persistence: mechanisms for triggering and enhancing phenotypic variability. Current Opinion in Genetics & Development. 21, 768-775 (2011).
