Introduction
Las bacterias han evolucionado para responder a muchas de las condiciones estresantes. Una característica general de adaptación al estrés es un cambio en la dinámica de crecimiento de 1,2. La dinámica del crecimiento se caracterizan principalmente por dos parámetros: la tasa de crecimiento exponencial y el tiempo de retardo, es decir, el tiempo necesario para adaptarse a las nuevas condiciones. Considerando que un gran número de métodos de alto rendimiento se centran en las mediciones de la tasa de crecimiento, el tiempo de retardo es a menudo un parámetro de vecinos, aunque es el parámetro crucial para la caracterización de la adaptación a las nuevas condiciones. La cuantificación de la adaptación a las condiciones cambiantes que tradicionalmente se ha realizado utilizando métodos manuales laboriosas 3,4. Más recientemente, las técnicas avanzadas se han desarrollado para el análisis de células individuales 5,6. Sin embargo, todavía es difícil distinguir el crecimiento normal después de un retraso en el crecimiento (a saber, un tiempo de retraso) 2,3 de crecimiento lento. Un método automático se construyó, ScanLag 7, adiscriminar entre estos dos fenotipos similares.
Un ejemplo notable de la importancia del estudio de la distribución del tiempo de retardo se revela bajo tratamiento con antibióticos. Antibióticos y otros factores de estrés Muchos matan células sólo crecen activamente, y, por lo tanto, las células que están "quedando" están protegidos 8. Para controlar el tiempo de retardo, se puede observar células individuales bajo un microscopio y supervisar el tiempo hasta la primera división. Un inconveniente importante de este método es que el intervalo de tiempo dinámico es limitada; aquellas células que están creciendo temprana cubren la superficie a un ritmo exponencial, disminuyendo eficazmente el crecimiento de las células con un mayor tiempo de retardo. El uso de cámaras de flujo evita algo esta 5, pero un número limitado de células puede ser rastreado y la fracción de bacterias que salen de la fase de latencia después de la mayoría de la población ha comenzado a crecer no puede ser observada. A pesar de estas limitaciones, varios estudios han evaluado la influencia del nivel de diferente hincapié en la distribución del tiempo de demora mediante microscopía de células individuales 9-12. Otra manera de controlar la distribución del tiempo de retraso es a través de las mediciones de turbidez 13,14. Muchas culturas paralelas, cada uno comenzó a partir de una sola célula, se cultivan en un lector de densidad óptica que mide el número de bacterias en la cultura a través del tiempo. Este método está limitado por la precisión de la extrapolación y al número de pozos en una placa.
Un método automático fue desarrollado, llamado ScanLag, que permite tiempos de retardo y las distribuciones del tiempo de crecimiento que deben evaluarse, incluso para el pequeño porcentaje de bacterias en una población que tiene tiempos de retardo muy largos. El método se basa en la detección de colonias en placas de agar de nutrientes convencionales 15 (Figura 1). Para automatizar la detección de 16,17 una serie de escáneres comerciales 18 que son dirigidas por el software en casa para adquirir periódicamente las imágenes de las placas, fue diseñado. Software fuediseñado para analizar automáticamente las imágenes y extraer parámetros cuantitativos 19,20, tales como el tiempo de aparición de cada colonia y el crecimiento de tiempo de cada colonia, que se define aquí como el tiempo para crecer a partir de 20 píxeles a 80 píxeles. Aquí presentamos el método en detalle, incluyendo la configuración del sistema y la utilización del software de análisis de imagen automatizado que ha sido mejorado con una mejor interfaz de usuario.
Este método puede ser adaptado para medir otras características de colonias, tales como la morfología y color. La medición de estos tipos de parámetros que permitirá el uso del sistema en fenómica multidimensionales. Como el método detecta colonias de células individuales, el sistema puede revelar nuevos fenotipos que no pueden ser medidas por las mediciones de nivel de población. La técnica permite la detección y recuperación de variantes raras, y facilita la detección de rasgos deseados.
Protocol
1. Crear el programa de instalación
- Elija un escáner de superficie plana con resolución óptica: 4800 dpi; Resolución del hardware: 4800 x 9600 dpi; color de la profundidad de bits: 48 bits, que puede operar en los niveles de temperatura y humedad pertinentes.
- Placas de Petri tienen volumen significativo, a diferencia del papel generalmente utilizado en escáneres comerciales. Las colonias se encuentran en la parte superior de la capa de agar, unos 5 mm por encima de la superficie del escáner. Nota: Para la mayoría de los escáneres de las colonias estarán enfocados.
- Algunas empresas del escáner no permiten la conexión de más de una instancia de escáner del mismo tipo para el mismo equipo. Asegúrese de que más de un escáner se puede conectar y se identifica de forma única.
- Prepare los accesorios que se detallan a continuación:
- Preparar piezas de negro estéril sentían paño para cubrir las placas (figura 1, paso 2).
- Para sostener las placas de Petri en el lugar, preparar a los propietarios de placas blancas (Materiales y Métodos) que se ajustan a los escáneres y que tienen 6 holES el tamaño de los platos (Figura 1 paso 3).
- Si es necesario para el crecimiento del microorganismo, poner los escáneres en un entorno de temperatura controlada. Conecte el escáner a la computadora.
- Opcional: Conecte el relé al ordenador sin pasar por el interruptor de encendido / apagado del escáner para superar gradiente de temperatura.
NOTA: La unidad de relé es de extremadamente sensibles a la temperatura microorganismos. Se apaga el escáner para que la electrónica no calientan la superficie desigual. El uso de sólo una parte de la superficie del escáner, pueden lograr resultados similares.
2. Instale el Gestor de Escaneado
- Copie todos los archivos de la aplicación "Gestor de escaneado" en un directorio designado por http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html.
- Configurar archivo ScanningManager.exe.config según los nombres escáneres como aparecen en Gestión->-> Administrador de Dispositivos de Captura de Imagen de dispositivos (
- Para solucionar problemas de la aplicación "Gestor de escaneado ', veo el archivo Léame.
- Encontrará la documentación de la aplicación 'Escaneo Administrador', ver Documentation.html.
3. Lleve a cabo un experimento
- Preparar las placas de Petri (Figura 1):
- Diluir la cultura hasta aproximadamente 2000 CFU / ml. Placa 0,1 ml de cultivo de manera uniforme sobre la superficie de la placa.
- Para obtener un buen contraste entre las colonias y el plato, y para absorber la humedad, cubra el plato con un pedazo de negro estéril sintió tela. Ponga la tapa en la placa.
- Coloque las placas en los titulares de los escáneres.
- Inicie el Administrador de Análisis (figura 3): Seleccione el escáner que participan desde la lista de escáneres conectados. Elija el número de imágenes que se deben tomar (repeticiones), el intervalo de tiempo entre las imágenes siguientes (La distancia de tiempo), y el retardo de tiempo antes de comenzar tque experimentar (inicia después).
4. Análisis de las Imágenes
NOTA: Se proporciona un resumen de los métodos computacionales para el análisis de las imágenes en MATLAB utilizando "ScanLag", que está disponible gratuitamente para uso no comercial en http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications. HTML. Otras funciones disponibles se indican en el manual de software, y se complementa un código de ejemplo.
- Ordena las imágenes de cada escáner en carpetas separadas.
- Usando la ventana de comandos del Matlab, ejecute los siguientes procedimientos. Los parámetros necesarios para ejecutar estos procedimientos se definen en el manual del software.
- Ejecute PreparePictures para realizar el preprocesamiento: En pre-procesamiento, las imágenes desde un escáner están alineados. Cada placa de Petri se recorta de cada secuencia de imágenes. El momento en que se recogió cada imagen se recupera de la marca de tiempo.
- TLAllPlates de ejecución para realizar la detección y seguimiento En each plato Petri por separado, las colonias se detectan y se le asigna un número de identificación.
- Análisis de los datos extraídos: Los tamaños de todas las colonias detectadas se mide como una función del tiempo. Para extraer la distribución aparición de las colonias utilizar las siguientes funciones en la ventana de comandos del Matlab (más información está disponible en el manual del software):
- Ejecutar ScanLagApp para mostrar el análisis de un cierto plato de Petri junto con el gráfico de las colonias dimensionar en función del tiempo (Figura 4).
- Utilice el control deslizante para cambiar la hora actual de la placa. El momento también se indicará mediante una línea vertical correspondiente en el gráfico de áreas colonias.
- Haga clic en una colonia para ver su curva asociada y, viceversa, haga clic en una curva para encontrar su colonia asociada. Después de la identificación de la colonia, el fenotipo puede ser recuperada recogiendo la colonia de la placa de Petri identificado.
- Filtrar los defectos en el análisis automático por choocantar una colonia y haciendo clic en el botón de exclusión. Al hacer clic excluye el número de la colonia se vuelve amarillo.
- Después de pasar por los resultados del análisis de cada placa, resumir los resultados:
- Ejecutar AddHistograms para crear un histograma de tiempos de aparición.
- Ejecutar plotDeathCurve para crear una curva de supervivencia representación de la distribución.
- Ejecute GetAppearanceTimes para obtener el tiempo de aparición de todas las colonias en el experimento.
- Ejecutar ScanLagApp para mostrar el análisis de un cierto plato de Petri junto con el gráfico de las colonias dimensionar en función del tiempo (Figura 4).
Representative Results
Como un ejemplo de extracción de distribución del tiempo de retardo, la Figura 5 muestra la capacidad de ScanLag para identificar y realizar un seguimiento de cada colonia con características específicas en una placa con el tiempo, como se haría en un ensayo de cribado.
Cuando el cultivo del microorganismo es heterogénea, las diferentes subpoblaciones podrían manifiestan durante el ensayo. Por ejemplo, la Figura 6 muestra la cuantificación apariencia y por lo tanto revela la distribución de tiempo de retardo bimodal en una cepa mutante de E. coli.
La tasa de crecimiento de las células influye en el tiempo de aparición de la colonia. Cuando las colonias crecen a la misma tasa, la aparición tardía se puede atribuir a el tiempo de retraso (Figura 7).
Para validar que el método de hecho mide el tiempo de retardo de células individuales, se compararon los resultados con los obtenidos ScanLag usando microscopía de una sola célula; esta validación es described en detalle en una publicación previa 7. Este método permite el control de muchas más células que pueden ser evaluadas con el microscopio. Las distribuciones obtenidas mediante microscopía y obtenido usando ScanLag se superponen en gran medida. La distribución ScanLag es ligeramente más amplio; análisis teóricos predicen la ampliación a ser del orden de la desviación estándar de la división de tiempo. Si el tiempo de crecimiento es diferente para cada cepa, el origen del retraso en la aparición debe investigarse más a fondo el uso de otros métodos.
Se examinó la influencia de las colonias-primeros que aparecen en la aparición de colonias posteriores. Los experimentos de control 7 confirmaron que el aspecto más adelante no se vio afectada, siempre y cuando el número total de colonias por placa no excedió de 200 (Figura 8). Otro experimento de control confirmó que la ubicación de la colonia en la placa no estaba afectando a su tiempo de aparición 7.
El análisis de la pLates está calibrado para umbrales específicos que podrían necesitar modificación dependiendo de los nutrientes presentes en el medio de crecimiento o el tipo de microorganismo. Sin embargo, el análisis es bastante robusto para una gran gama de umbrales tal como se muestra en la Figura 9.
Figura 1. Un diagrama esquemático de los pasos necesarios para crear una distribución aparición de colonias.
Figura 2. Una captura de pantalla del Administrador de dispositivos con los nombres de los escáneres conectados, y del archivo de configuración. Haga clic aquí para ver una mayorversión de esta figura.
Figura 3. Una captura de pantalla del Gestor de Escaneado.
Figura 4. Una captura de pantalla de la ScanLagApp. Una imagen de la placa está en el panel de la izquierda, y las curvas de crecimiento de cada colonia se encuentran en el panel de la derecha, tal como se detalla en el manual. Los picos en algunas de las curvas de la zona de las colonias se producen cuando dos o más colonias se fusionan. Cuando la fusión de colonias sucede, el área de estas colonias es considerado como el área de la articulación.
Figura 5. Un resultado representativo del análisis de una placa. (A) Una imagen de la salida de la aplicación de detección al final del experimento. Cada área de la colonia se identifica, coloreado y le asigna un número de identificación único. Las flechas apuntan a las colonias representativas mide en B. La colonia se detecta basándose en el umbral de intensidad (para colonias de E. coli en agar LB o agar M9 este umbral es de 0,03. Para otros medios de comunicación o las bacterias, este umbral se puede ajustar en función de las ProcessPictures ). Sólo los objetos de más de 10 píxeles se cuentan (este umbral se puede modificar en los MatchColonies de función). La detección de una colonia comienza a las aproximadamente 10 5 bacterias. (B) Parcelas de la zona en píxeles frente al tiempo de cuatro colonias representativas en esta placa. El "tiempo de aparición 'de cada colonia es cuando se detecta la colonia. El "tiempo de crecimiento 'de cada colonia se define aquí como el tiempo para crecer lado a otrom 20 píxeles a 80 píxeles (esos límites se pueden ajustar mediante la función getAppearanceGrowthByVec). El software no incluye las colonias que se fusionaron antes de alcanzar el límite superior. Identificación de una colonia específica de acuerdo con sus características es fácil gracias al número de identificación y el color asignado a cada colonia. Por ejemplo colonias de # 1, 56, 77 y 124 están destacados en los dos gráficos.
Figura 6. Apariencia cuantificación puede revelar la distribución del tiempo de retraso bimodal. Comparación de histogramas de análisis ScanLag de tiempos de aparición de dos cepas diferentes. Línea azul: cepa de tipo salvaje que crece exponencialmente (Total: 1.320 colonias); línea de alta roja mutante persistencia enriquecido con bacterias rezagadas (Total: 1.529 colonias). (A) histogramas normalizados de apariencia. El picode aparición de células de crecimiento exponencial es el tiempo típico para crecer a una colonia detectable. Recuadro: mismo histograma de la cepa mutante después de restar el tiempo del pico de la cultura exponencial para obtener el tiempo de retraso real en contenedores logarítmicamente espaciados que muestran la distribución del tiempo de retardo bimodal. (B) Función de supervivencia de los mismos datos que en (A) en una escala logarítmica. Esta representación mejora la cola de aparición tardía de la cepa mutante.
Figura 7. Distribución Apariencia y distribución del tiempo de crecimiento. (A) y (B) muestran dos histogramas dimensionales de la tiempo de aparición y el tiempo de crecimiento de las dos condiciones diferentes (El software excluye colonias que se fusionaron antes de alcanzar el límite superior). (C) comparar los histogramasde las dos cepas muestran la diferencia en el tiempo de aparición, mientras que los tiempos de crecimiento (D) son similares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8. La aparición de las primeras colonias no interfiere con la aparición de colonias posteriores. (A) lag distribución del tiempo de las células de tipo salvaje chapados solo. (B) la zaga distribución del tiempo de una cepa sensible frío solo, después de la transferencia a la temperatura permisiva. (C) lag distribución del tiempo de ambas cepas chapados juntos en las mismas condiciones. La línea de color negro representa la distribución esperada sobre la base de los datos obtenidos en la medición de cada cepa por separado. Un buengreement entre distribuciones esperados y medidos se obtiene siempre y cuando el número total de colonias por placa está por debajo de 200.
.. Figura 9 El umbral de detección no afecta a la forma de la distribución aparición de colonias Se analizó la distribución de aparición de colonias para el mismo conjunto de datos utilizando dos tamaños diferentes de umbral; (A) Tamaño de umbral es de 10 píxeles; (B) Tamaño de umbral es de 50 píxeles. Número de células por histograma: aprox. 1500. El umbral de detección resultados diferentes sólo en un cambio del tiempo de detección.
Figura 10. Temperatura mediciones de estabilidad ACRoss la superficie del escáner. (A) Imagen de un plato con colonias de Bacillus subtilis cultivadas en el escáner sin la administración de energía. La superficie es más caliente en la parte inferior y, por tanto, las colonias crecen más rápido. La línea gradual lado de la placa es una representación esquemática de la gradiente de calor. (B) La estabilidad de la temperatura se midió con dos termopares colocados sobre la superficie del escáner. El escáner se calienta durante cada exploración y en el tiempo. (C) Con la administración de energía, la temperatura es uniforme y las colonias crecen a tasas similares. (D) Igual que (B) con el módulo de gestión de energía. Estabilidad de la temperatura de ± 0.2 ° C.
Figura 11. Las diferencias en la distribución de la apariencia pueden ser debido a diferencias en los volúmenes de medio sólido. El mismo cultivo bacteriano se sembró en placas con diferentes volúmenes de agar LB, que resulta en una altura diferente de la superficie del agar. Las diferentes alturas llevado a diferentes opacidad de las placas, y por lo tanto un tiempo de detección diferente. Se comprobó la diferencia entre las placas y la diferencia entre diferentes condiciones de altura. (A) las diferencias típicas entre las placas de volúmenes iguales de 30 ± 0,5 ml de LB agar. (B) Diferencia entre las diferentes condiciones de altura: la distribución aspecto se midió para las placas con volúmenes de 20 ± 0,5 ml (rojo), de 30 ± 0,5 ml (verde) y de 40 ± 0,5 ml (azul). Cada condición es el promedio de 6 platos diferentes. Mientras el volumen de las placas está dentro de ± gama 5 ml, la opacidad es similar y da lugar a distribución del tiempo de apariencia similar.
Discussion
Métodos microscópicos basados en la observación directa se consideran a menudo como el "estándar de oro" para el estudio de la conducta de una sola célula. ScanLag, que permite la medición de la distribución de los tiempos de retardo en las poblaciones de bacterias, proporciona datos en buen acuerdo con la distribución obtenida a partir del análisis de una sola célula y alcanza estadísticas mucho más altas.
Varios pasos críticos tienen que ser realizadas para que este método funcione bien: primero, no ponen en peligro la resolución del escáner, que debe ser 4800 x 9600 para obtener buenas imágenes. En segundo lugar, ser conscientes de que sin el módulo de administración de energía (paso 1.6), gradiente de temperatura se puede desarrollar en la superficie plana y afectar el crecimiento. Otro paso importante es la filtración de defectos tales como polvo que puede haber sido contabilizado erróneamente como colonias por el software. La resta incorporado fondo del software generalmente supera estos defectos, pero las colonias a veces "falsas" quefiltrar manualmente.
Los principales pasos para solucionar problemas podrían abordar la variación entre placas en la configuración, debido a varias razones: (a) La tasa de crecimiento de los microorganismos se ve afectada por la temperatura. Las diferentes condiciones de temperatura y humedad pueden ocurrir debido a la ventilación desigual o ubicación de la antena en la incubadora. (B) La electrónica del escáner pueden calentarse y causar un gradiente de temperatura a través de la superficie del escáner. La Figura 10 muestra la influencia de tales gradiente de calor espacial sobre las bacterias Bacillus, junto con las mediciones de la temperatura en la superficie del escáner antes y después de la implementación del módulo de administración de energía (paso 1.6). Tenga en cuenta que puede no ser necesario para los nuevos escáneres de este módulo, y si se utiliza sólo una parte de la superficie del escáner, la administración de energía puede ser innecesario. (C) Las placas con diferente opacidad del nutriente agar pueden dar lugar a diferentes niveles de detección. Figura 11 muestra thtolerancia e para diferentes volúmenes de agar nutriente que resultan en diferentes opacidades.
Experimentalmente la técnica ScanLag es fácil de realizar y requiere sólo a la placa microorganismos en los platos de Petri estándar, y para colocarlos en la superficie del escáner. El software que fue desarrollado controla todo el procedimiento. La adquisición de imágenes se realiza automáticamente, y el análisis de imágenes para el seguimiento de colonia también es automática. Además, el sistema se puede escalar en marcha para medir muchas condiciones diferentes al mismo tiempo. Finalmente, el método se basa en escáneres de oficinas comerciales y, por lo tanto, es de bajo costo.
Esta técnica se puede ampliar para el estudio de los microorganismos que se diferencian a partir de E. coli K-12, sin embargo varias consideraciones tiene que ser hecho. En primer lugar, la influencia de las colonias que aparecen primeros en las posteriores tiene que ser evaluada, como se describe en detalle en una publicación previa 7. Para E. Coli K-12, lala densidad máxima de UFC por placa es 200. Otras cepas con diferentes tamaños de las colonias, y otra diafonía posible entre colonias, podría requerir una densidad diferente. En segundo lugar, el análisis de las placas está calibrado para software basado en umbrales específicos que podrían necesitar ser modificada, dependiendo del contraste entre el medio sólido y las colonias. El software se puede extender también para extraer otras características de las colonias, más allá de retardo y tasa de crecimiento. El código de software está abierto y se puede modificar para extraer la forma de colonias, el brillo, la suavidad y el color.
Debido a que las mediciones se realizan en las colonias que se originan a partir de células individuales, los datos revelan nuevos fenotipos que no pueden ser medidas por las mediciones de nivel de población. La importancia de la distribución del tiempo de retardo se revela en la presencia de antibióticos. Muchos antibióticos son conocidos por ser eficaces sólo contra células en crecimiento; Por lo tanto, siempre y cuando las células se mantienen en la fase de latencia y no crecen, son proprotegidos de los efectos de esos antibióticos 21. Cuando el número de bacterias sobrevivientes se evalúan a intervalos de tiempo durante el tratamiento antibiótico 15,22,23, una subpoblación de bacterias, llamado persisters, a menudo se reveló. En ciertos casos, la inmunidad al tratamiento con antibióticos se origina a partir de retraso prolongado. Utilizando esta configuración, este retraso se revela y con frecuencia tiene una distribución no trivial 24 (Figura 6). Este método también permite la recuperación de mutantes raros. Por ejemplo, después de la siembra de una población mutagenizada, mutantes pueden identificarse basándose en el fenotipo y aislar directamente, sin selección. La configuración también podría monitorear las interacciones célula-célula midiendo el crecimiento de las colonias como una función de la densidad de las colonias cercanos y para cuantificar fenómenos tales como la detección de quórum o la propagación de bacterias que pululan. Información Multidimensional descubierto por futuros experimentos utilizando este método dará lugar a una mejor caracterización de la población microbianas y a los avances en la investigación médica y ambiental.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Difco LB broth | BD | 240230 | |
| Petri dish 90 mm | Miniplast | 20090-01 | |
| Epson Perfection v37 | Epson | B11B207201 | Flatbed Scanner with Optical resolution: 4,800 dpi, Hardware Resolution: 4,800 x 9,600 dpi, color bit depth 48-bit. |
| Epson Perfection v200 | Epson | B11B188011 | |
| Epson Perfection 3490 | Epson | B11B177011 | |
| ADU200 USB Relay | ONTRAK | ||
| Pieces of sterile black felt cloth | Custom made | Approximatly 100 x 100 mm | |
| White plate holders | Custom made | Surface size, with 6 x 99 mm diameter hole | |
| Delerin rings the size of the Petri dish | Custom made | Inner diameter: 72 mm Outer diameter: 86 mm Top outer diameter: 90 mm |
References
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