Introduction
I batteri si sono evoluti per rispondere a molte condizioni di stress. Una caratteristica generale di adattamento allo stress è un cambiamento nelle dinamiche di crescita 1,2. Dinamiche di crescita sono caratterizzati per lo più da due parametri: il tasso di crescita esponenziale e il tempo di ritardo, vale a dire il tempo necessario per adattarsi alle nuove condizioni. Considerando che un gran numero di metodi high throughput concentrarsi su misurazioni del tasso di crescita, il ritardo è spesso un parametro di fronte, anche se è il parametro fondamentale per la caratterizzazione di adattamento alle nuove condizioni. Quantificazione del adattamento alle mutevoli condizioni è stata tradizionalmente eseguita con metodi manuali laboriosi 3,4. Più recentemente, sono state sviluppate tecniche avanzate per l'analisi delle singole cellule 5,6. Tuttavia, è ancora difficile distinguere la crescita normale dopo un ritardo di crescita (ossia un ritardo) 2,3 dalla crescita lenta. Un metodo automatizzato è stato costruito, ScanLag 7, perdiscriminare tra queste due fenotipi simili.
Un esempio lampante dell'importanza dello studio della distribuzione del tempo di ritardo viene rivelato sotto trattamento antibiotico. Antibiotici e altri stress Molti uccidere solo le cellule in attiva crescita, e, quindi, cellule che sono "ritardo" sono protetti 8. Per monitorare ritardo, si può osservare singole cellule al microscopio e monitorare il tempo alla prima divisione. Un grave inconveniente di questo metodo è che l'intervallo di tempo dinamico è limitato; quelle cellule che crescono precoce coprono la superficie a velocità esponenziale, riducendone la crescita delle cellule con ritardo più lungo. L'utilizzo di camere di flusso aggira alquanto questa 5, ma un numero limitato di cellule possono essere monitorati e la frazione di batteri che esce dalla fase di ritardo dopo la maggior parte della popolazione ha cominciato a crescere non può essere osservato. Nonostante queste limitazioni, diversi studi hanno valutato l'influenza del livello di different insiste sulla distribuzione ritardo utilizzando la microscopia singola cellula 9-12. Un altro modo per monitorare la distribuzione ritardo è attraverso misure di torbidità 13,14. Molte colture in parallelo, ciascuno iniziato da una singola cellula, sono coltivate in un lettore di densità ottica che misura il numero di batteri in coltura nel tempo. Questo metodo è limitata dalla precisione del estrapolazione e al numero di pozzetti in una piastra.
Un metodo automatizzato è stato sviluppato, chiamato ScanLag, che consente tempi di latenza e le distribuzioni di tempo la crescita deve essere valutata, anche per la piccola percentuale di batteri in una popolazione che hanno tempi di latenza molto lunghi. Il metodo si basa sulla rilevazione di colonie su piastre di agar nutriente convenzionale 15 (Figura 1). Per automatizzare il rilevamento 16,17 una matrice di scansione commerciali 18 che sono diretti dal software in casa di acquisire immagini periodicamente delle piastre, è stato progettato. Software eraprogettato per analizzare automaticamente le immagini ed estrarre parametri quantitativi 19,20, come il tempo di comparsa di ogni colonia e la crescita tempo di ogni colonia, che è qui definito come il tempo di crescere da 20 pixel per 80 pixel. Presentiamo qui il metodo in dettaglio, compresa la configurazione del sistema e l'uso del software di analisi delle immagini automatizzata che è stato migliorato con una migliore interfaccia utente.
Questo metodo può essere adattato per misurare altre caratteristiche di colonie, come la morfologia e colore. Misurazione di questi tipi di parametri consentirà l'uso del sistema in fenomica multidimensionali. Come il metodo rileva colonie da singole cellule, il sistema può rivelare nuovi fenotipi che non possono essere misurati da misure del livello di popolazione. La tecnica consente il rilevamento e il recupero di varianti rare, e facilita lo screening per tratti desiderati.
Protocol
1. Costruire il Setup
- Scegli uno scanner piano con risoluzione ottica: 4.800 dpi; Risoluzione Hardware: 4.800 x 9.600 dpi; bit di profondità colore: 48 bit, in grado di operare ai relativi livelli di temperatura e umidità.
- Capsule di Petri hanno un volume significativo, a differenza della carta di solito usato su scanner commerciali. Le colonie si trovano sulla parte superiore dello strato di agar, circa 5 mm dalla superficie dello scanner. Nota: Per la maggior parte degli scanner le colonie saranno a fuoco.
- Alcune aziende scanner non consentono il collegamento di più istanze di scanner dello stesso tipo allo stesso computer. Assicurarsi che più di uno scanner può essere collegato e identificato in modo univoco.
- Preparare gli accessori, come specificato di seguito:
- Preparare pezzi di feltro nero sterile panno per coprire le piastre (Figura 1 punto 2).
- Per tenere le capsule di Petri in luogo, preparare gli imprenditori piatto bianco (Materiali e metodi) che si adattano gli scanner e che hanno 6 Holes la dimensione delle antenne (Figura 1 punto 3).
- Se necessario per la crescita dei microrganismi, mettere gli scanner in un ambiente a temperatura controllata. Collegare gli scanner al computer.
- Opzionale: Collegare il relè al computer e bypassare l'interruttore on / off dello scanner per superare gradiente di temperatura.
NOTA: L'unità relè è di microrganismi estremamente sensibili alla temperatura. Si spegne lo scanner in modo che l'elettronica non scaldano la superficie non uniforme. Utilizzando solo parte della superficie dello scanner può ottenere risultati simili.
2. Installare il Gestore di scansione
- Copiare tutti i file dell'applicazione "Scanning agenzia 'in una directory designata da http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html.
- Configurare il file ScanningManager.exe.config secondo i nomi scanner come appaiono in Gestione Computer-> Gestione periferiche-> Dispositivi di imaging (
- Per la risoluzione dei problemi dell'applicazione 'Scanning Manager', vedere il file Leggimi.
- Per ulteriore documentazione relativa all'applicazione 'Scanning Manager', vedi documentation.html.
3. Eseguire un esperimento
- Preparare le piastre di Petri (Figura 1):
- Diluire la cultura a circa 2.000 CFU / ml. Piatto 0.1 ml di coltura uniformemente sulla superficie della lastra.
- Per ottenere un buon contrasto tra le colonie e il piatto e per assorbire l'umidità, coprire il piatto con un pezzo di feltro nero sterile panno. Mettere coperchio sulla piastra.
- Posizionare le piastre nei supporti sui scanner.
- Avviare il Gestore di scansione (Figura 3): Scegliere gli scanner partecipanti dalla lista degli scanner collegati. Scegliere il numero di immagini da prendere (ripetizioni), l'intervallo di tempo tra le immagini successive (Time gap), e il ritardo di tempo prima di iniziare tegli esperimento (Start After).
4. Analisi delle immagini
NOTA: Cenni di metodi computazionali è previsto per analizzare le immagini in MATLAB con "ScanLag", che è liberamente disponibile per uso non commerciale a http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications. html. Altre funzioni disponibili sono descritti nel manuale del software, e un esempio di codice, siano completati.
- Ordinare le immagini da ogni scanner in cartelle separate.
- Utilizzando la finestra di comando di Matlab, eseguire le seguenti procedure. I parametri necessari per eseguire queste procedure sono definite nel manuale del software.
- Eseguire PreparePictures effettuare la pre-elaborazione: in pre-elaborazione, le immagini da uno scanner sono allineate. Ogni piatto di Petri è ritagliata da ogni sequenza di immagini. Il momento in cui ciascuna immagine è stato raccolto viene recuperato dal timestamp.
- TLAllPlates Run per eseguire il rilevamento e il monitoraggio in each piatto di Petri separatamente, le colonie vengono rilevati e assegnato un numero di identificazione.
- Analisi dei dati estratti: Le dimensioni di ogni colonia rilevati sono misurati in funzione del tempo. Per estrarre la distribuzione comparsa delle colonie utilizzare le seguenti funzioni nella finestra di comando di Matlab (ulteriori informazioni sono disponibili nel manuale del software):
- Eseguire ScanLagApp per visualizzare l'analisi di un determinato piatto Petri insieme con il grafico delle colonie dimensionare in funzione del tempo (Figura 4).
- Utilizzare il cursore per modificare l'ora corrente della piastra. I tempi altresì indicato da una linea verticale sul grafico corrispondente zona colonie.
- Clicca su una colonia per vedere la sua curva associato, e viceversa, fare clic su una curva per trovare la sua colonia associato. Dopo aver identificato la colonia, il fenotipo può essere recuperato scegliendo la colonia dalla piastra di Petri identificato.
- Filtra i difetti di analisi automatica da choocantare una colonia e cliccando sul pulsante escludere. Cliccando esclude il numero della colonia diventa giallo.
- Dopo aver attraversato i risultati dell'analisi di ciascuna piastra, riassumere i risultati:
- Eseguire AddHistograms per creare un istogramma dei tempi di comparsa.
- Eseguire plotDeathCurve per creare una rappresentazione curva di sopravvivenza della distribuzione.
- Eseguire GetAppearanceTimes per ottenere il tempo di comparsa di tutte le colonie nell'esperimento.
- Eseguire ScanLagApp per visualizzare l'analisi di un determinato piatto Petri insieme con il grafico delle colonie dimensionare in funzione del tempo (Figura 4).
Representative Results
Come esempio di estrazione distribuzione ritardo, la Figura 5 mostra la capacità di ScanLag di identificare e tracciare ogni colonia con caratteristiche specifiche in un'unica piastra nel tempo, come avverrebbe in un saggio di screening.
Quando la coltura del microorganismo è eterogeneo, le diverse sottopopolazioni potrebbero si rivelano durante il dosaggio. Ad esempio, la Figura 6 mostra la quantificazione aspetto e mostra una distribuzione bimodale ritardo in un ceppo mutante di E. così coli.
Il tasso di crescita delle cellule influenza il tempo di comparsa della colonia. Quando le colonie crescono alla stessa velocità, il ritardo aspetto può essere attribuito al ritardo (Figura 7).
Per convalidare che il metodo effettivamente misura il tempo di ritardo di singole cellule, abbiamo confrontato i risultati ScanLag con quelli ottenuti usando la microscopia a cella singola; questa convalida è discribed in dettaglio in una pubblicazione precedente 7. Questo metodo consente il monitoraggio di molte più celle che possono essere valutati con microscopia. Le distribuzioni ottenute mediante microscopia e ottenuti con ScanLag in gran parte si sovrappongono. La distribuzione ScanLag è leggermente più ampio; analisi teoriche prevedono ampliare essere dell'ordine della deviazione standard del tempo di divisione. Se il tempo di crescita è diverso per ogni ceppo, l'origine del ritardo nella comparsa deve essere ulteriormente studiata utilizzando altri metodi.
L'influenza dei primi, che appare colonie l'aspetto delle colonie più tardi è stato esaminato. Esperimenti di controllo 7 confermato che successiva comparsa non è stata influenzata purché il numero totale di colonie per piastra non superava 200 (Figura 8). Un altro esperimento di controllo ha confermato che la posizione della colonia sulla piastra non influenzava il suo tempo aspetto 7.
L'analisi della ptardive è tarato per soglie specifiche che potrebbero aver bisogno di modifiche a seconda delle sostanze nutritive presenti nel terreno di coltura o il tipo di microrganismo. Tuttavia, l'analisi è molto robusto per una vasta gamma di soglie, come mostrato nella Figura 9.
Figura 1. Un diagramma schematico dei passi necessari per creare una distribuzione aspetto colonia.
Figura 2. Una schermata di Gestione periferiche mostra i nomi degli scanner collegati, e del file di configurazione. cliccate qui per vedere una più grandeversione di questa figura.
Figura 3. Un'immagine del Gestore Scanning.
Figura 4. Un'immagine del ScanLagApp. Un'immagine della piastra sia nel riquadro di sinistra, e le curve di crescita di ogni colonia sono nel riquadro di destra, come indicato nel manuale. Le punte in alcune delle curve zona colonie si verificano quando due o più colonie si fondono. Quando la fusione di colonie accade, l'area di queste colonie è considerata come la zona del giunto.
Figura 5. Un risultato rappresentativo dell'analisi di una piastra. (A) Un'immagine del output dell'applicazione rilevamento alla fine dell'esperimento. Ogni area colonia è identificata, colorata e assegnato un numero ID univoco. Le frecce indicano le colonie rappresentative misurato in B. viene rilevata La colonia basata sulla soglia d'intensità (per colonie di E. coli su LB agar agar o M9 questa soglia è 0,03. Per altri supporti o batteri, questa soglia può essere regolato in funzione ProcessPictures ). Solo gli oggetti superiori a 10 pixel sono contati (questa soglia può essere modificata nei MatchColonies funzione). Rilevamento di una colonia inizia a circa 10 5 batteri. (B) Lotto di zona in pixel in funzione del tempo di quattro colonie di rappresentanza in questo piatto. Il 'tempo di comparsa' di ogni colonia è quando viene rilevata la colonia. Il 'tempo di crescita' di ogni colonia è qui definito come il tempo di crescere indietrom 20 pixel a 80 pixel (quei confini sono regolabili mediante la funzione getAppearanceGrowthByVec). Il software esclude le colonie che fuse prima di raggiungere il limite superiore. Identificazione di una colonia specifica in base alle sue caratteristiche è facile grazie al numero di identificazione e il colore assegnato ad ogni colonia. Per esempio COLONIE # 1, 56, 77 e 124 sono evidenziate in entrambi i grafici.
Figura 6. Aspetto quantificazione può rivelare bimodale distribuzione del tempo di ritardo. Confronto tra analisi ScanLag istogrammi dei tempi di presenza per i due ceppi diversi. Linea blu: ceppo selvatico in crescita esponenziale (totale: 1.320 colonie); line-alta rossa persistenza mutante arricchito con batteri in ritardo di sviluppo (totali: 1.529 colonie). (A) istogrammi aspetto normalizzate. Il piccodi comparsa di cellule in crescita esponenziale è il tempo tipico di crescere per una colonia rilevabile. Inserto: stesso istogramma del ceppo mutante dopo aver sottratto il tempo del picco della cultura esponenziale per ottenere il tempo di ritardo reale sul bidoni log-distanziati mostrano la distribuzione bimodale ritardo. (B) Funzione di sopravvivenza degli stessi dati come in (A) su una scala logaritmica. Questa rappresentazione migliora l'aspetto coda tardiva del ceppo mutante.
Figura 7. Distribuzione Aspetto e distribuzione del tempo di crescita. (A) e (B) mostrano due istogrammi dimensionali del tempo aspetto e il tempo di crescita delle due condizioni diverse (il software esclude colonie che si sono fuse prima di raggiungere il limite superiore). (C) Confrontando gli istogrammidei due ceppi mostrano la differenza di tempo aspetto, considerando che i tempi di sviluppo (D) sono simili. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8. L'aspetto delle prime colonie non interferisce con la comparsa di colonie successive. (A) lag distribuzione temporale delle cellule wild-type placcati solo. (B) lag distribuzione temporale di un ceppo sensibile a freddo da sola, dopo il trasferimento alla temperatura permissiva. (C) lag distribuzione temporale dei due ceppi intrecciate fra loro alle stesse condizioni. La linea nera rappresenta la distribuzione prevista sulla base dei dati ottenuti durante la misurazione ogni ceppo separatamente. Un buongreement tra distribuzioni attesi e misurati è ottenuto purché il numero totale di colonie per piastra è inferiore a 200.
.. Figura 9 La soglia di rivelazione non influisce sulla forma della distribuzione comparsa colonia La distribuzione comparsa colonia è stata analizzata per lo stesso insieme di dati utilizzando due diverse dimensioni di soglia; (A) dimensione di soglia è di 10 pixel; (B) dimensione di soglia è di 50 pixel. Numero di celle per dell'istogramma: ca. 1.500. La soglia di rilevamento risultati differenti solo in uno spostamento del tempo di rilevamento.
Figura 10. Temperatura misure di stabilità across superficie dello scanner. (A) immagine di una targa con colonie di subtillis Bacillus coltivati sullo scanner senza Power Management. La superficie è più calda sul fondo e quindi le colonie crescono più velocemente. La linea progressiva accanto al piatto è una rappresentazione schematica del gradiente termico. (B) La stabilità della temperatura è stata misurata con due termocoppie poste sulla superficie dello scanner. Lo scanner si riscalda durante ciascuna scansione e nel tempo. (C) Con Power Management, la temperatura è uniforme e le colonie crescono a tassi simili. (D) Come (B) con il modulo Power Management. Stabilità di temperatura di ± 0,2 ° C.
Figura 11. Differenze nella distribuzione apparenza possono essere dovute a differences di volumi di terreno solido. La stessa coltura batterica è stata piastrata su piastre con diversi volumi di LB agar, risultante in una diversa altezza della superficie agar. Le diverse altezze portato a diversi opacità delle piastre, e quindi un tempo di rilevamento diverso. La differenza tra le piastre è stata controllata e la differenza tra diverse condizioni altezza. (A) le differenze tipiche tra le lastre di volumi uguali di 30 ± 0,5 ml di LB Agar. (B) Differenza tra differenti condizioni di altezza: la distribuzione apparizione è stata misurata per piatti con volumi di 20 ± 0,5 ml (rosso), di 30 ± 0,5 ml (verde) e di 40 ± 0,5 ml (blu). Ogni condizione è la media di 6 piatti differenti. Fintanto che il volume delle piastre è entro ± gamma 5 ml, l'opacità è simile e porta a tempo aspetto simile distribuzione.
Discussion
Metodi microscopici basati sull'osservazione diretta sono spesso considerati come il "golden standard" per studiare il comportamento della singola cellula. ScanLag, che permette di misurare la distribuzione dei tempi di ritardo in popolazioni batteriche, fornisce dati in buon accordo con la distribuzione ottenuta dall'analisi unicellulare e raggiunge statistiche molto più elevate.
Diversi passaggi critici devono essere eseguiti per questo metodo di lavorare bene: in primo luogo, non compromesso sulla risoluzione dello scanner, che dovrebbe essere 4.800 x 9.600 a ottenere buone immagini. In secondo luogo, essere consapevoli del fatto che senza il modulo di gestione di potenza (fase 1.6), gradiente di temperatura può svilupparsi sulla superficie del piano e sulla crescita. Un altro passo importante è la filtrazione di difetti quali polvere che possono essere stati erroneamente contati come colonie dal software. La sottrazione del fondo built-in del software di solito supera questi difetti, ma le colonie a volte "falsi" devonofiltrare manualmente.
Le principali operazioni di troubleshooting potrebbero affrontare variazione inter-plate nel setup, a causa di diversi motivi: (a) Il tasso di crescita dei microrganismi è influenzato dalla temperatura. Temperatura e umidità diverse condizioni possono verificarsi a causa di ventilazione irregolare o la località del piatto in incubatrice. (B) L'elettronica dello scanner potrebbero surriscaldarsi e causare un gradiente di temperatura attraverso la superficie dello scanner. Figura 10 mostra l'influenza di tale gradiente termico spaziale sui batteri Bacillus, insieme alle misurazioni della temperatura sulla superficie scanner prima e dopo l'attuazione del modulo di gestione di potenza (punto 1.6). Si noti che questo modulo potrebbe non essere necessario per scanner più recenti, e se viene utilizzata solo una parte della superficie dello scanner, gestione dell'alimentazione può essere superflua. (C) Piastre con diverse opacità del nutriente agar potrebbero portare a diversi livelli di rilevamento. Figura 11 mostra the la tolleranza per i diversi volumi di agar nutriente che si traducono in diverse opacità.
Sperimentalmente la tecnica ScanLag è facile da eseguire e richiede solo alla piastra microrganismi su piatti standard Petri, e metterli sulla superficie dello scanner. Il software sviluppato controlla l'intera procedura. L'acquisizione dell'immagine avviene automaticamente, e l'analisi di immagine per l'inseguimento colonia è automatica. Inoltre, il sistema può essere scalata-up per misurare molte condizioni differenti allo stesso tempo. Infine, il metodo si basa su scanner uffici commerciali e, dunque, è a basso costo.
Questa tecnica può essere estesa allo studio dei microrganismi che differiscono da E. coli K-12, tuttavia diverse considerazioni devono essere fatte. In primo luogo, l'influenza di prime colonie appaiono su quelle successive deve essere valutato, come descritto in dettaglio in una pubblicazione precedente 7. Per E. Coli K-12, ladensità massima di UFC per piastra è 200. Altri ceppi con diverse dimensioni delle colonie, e di altri cross talk possibile tra le colonie, potrebbe richiedere una diversa densità. In secondo luogo, l'analisi delle piastre è tarato per specifiche soglie software basato che potrebbe aver bisogno di essere modificato, a seconda del contrasto tra il mezzo solido e le colonie. Il software può essere esteso anche ad estrarre altre caratteristiche colonie, al di là di ritardo e tasso di crescita. Il codice del software è aperto e può essere modificato per estrarre forma colonia, luminosità, morbidezza e colore.
Poiché misure sono effettuate su colonie che hanno origine da cellule singole, i dati rivelano nuovi fenotipi che non può essere misurata con misure del livello di popolazione. L'importanza della distribuzione del tempo di ritardo viene rivelato in presenza di antibiotici. Molti antibiotici sono noti per essere efficace solo contro cellule in crescita; Pertanto fintantoché cellule rimangono nella fase di latenza e non crescono, sono proprotetti dagli effetti di tali antibiotici 21. Quando il numero di batteri superstiti vengono valutate ad intervalli di tempo durante il trattamento antibiotico 15,22,23, una sottopopolazione di batteri, chiamato persistenti, è spesso rivelato. In taluni casi, immunità al trattamento antibiotico proviene dal ritardo prolungato. Usando questa configurazione, questo ritardo è rivelata e spesso ha un non banale distribuzione 24 (Figura 6). Questo metodo consente inoltre il recupero di mutanti rare. Ad esempio, dopo la placcatura una popolazione mutagenizzato, i mutanti possono essere identificati sulla base di fenotipo e isolato direttamente, senza selezione. La configurazione potrebbe anche monitorare le interazioni cellula-cellula misurando la crescita di colonie in funzione della densità di colonie vicine e quantificare fenomeni come quorum sensing o la diffusione dei batteri brulicanti. Informazioni multidimensionali scoperto da futuri esperimenti con questo metodo porterà ad una migliore caratterizzazione della popolazione microbicas e ai progressi della ricerca medica e ambientale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Difco LB broth | BD | 240230 | |
| Petri dish 90 mm | Miniplast | 20090-01 | |
| Epson Perfection v37 | Epson | B11B207201 | Flatbed Scanner with Optical resolution: 4,800 dpi, Hardware Resolution: 4,800 x 9,600 dpi, color bit depth 48-bit. |
| Epson Perfection v200 | Epson | B11B188011 | |
| Epson Perfection 3490 | Epson | B11B177011 | |
| ADU200 USB Relay | ONTRAK | ||
| Pieces of sterile black felt cloth | Custom made | Approximatly 100 x 100 mm | |
| White plate holders | Custom made | Surface size, with 6 x 99 mm diameter hole | |
| Delerin rings the size of the Petri dish | Custom made | Inner diameter: 72 mm Outer diameter: 86 mm Top outer diameter: 90 mm |
References
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