تصنيع المركزة، الأوكسجين القائم على الدهون Microbubble المستحلبات بواسطة High القص التجانس والتركيز المسلسل
Summary
نحن تصف أساليب لتصنيع كميات كبيرة من الدهون على أساس microbubbles الأكسجين (LOMs) مصممة للتسليم الأوكسجين عن طريق الوريد باستخدام التجانس عالية القص وتركيز المسلسل.
Abstract
وقد وضعت microbubbles مليئة بالغاز مثل الموجات فوق الصوتية وكلاء النقيض تسليم المخدرات. يمكن أن تنتج عن طريق معالجة Microbubbles السطحي باستخدام صوتنة، والإثارة الميكانيكية، وأجهزة ميكروفلويديك، أو التجانس. مؤخرا، تم تصميمها على أساس الدهون microbubbles الأكسجين (LOMs) لتسليم الأكسجين عن طريق الوريد أثناء حالات الطوارئ الطبية، وعكس نقص الأكسجة التي تهدد الحياة، ومنع الإصابة اللاحقة الجهاز، وتوقف القلب والموت. نقدم طرق لإنتاج مصغرة تتكون من microbubbles الاوكسيجين للغاية باستخدام حلقة مغلقة عالية القص الخالط. عملية يمكن أن تنتج 2 L من LOMs المركزة (90٪ من حيث الحجم) في 90 دقيقة. فقاعات الناتجة لديها قطر متوسط ~ 2 ميكرون، والتشكيل rheologic يتفق مع الدم عندما تضعف إلى 60٪ حجم. هذه التقنية تنتج LOMs في قدرة عالية وعالية النقاء مع الأكسجين، مما يشير إلى أن هذه التقنية قد تكون مفيدة لمختبرات البحوث متعدية.
Introduction
وقد وضعت Microbubbles تتكون من البروتين، والبوليمر، وقذائف الدهون كذلك ناقلا لتسليم المخدرات، والعلاج الجيني، وعوامل التباين الموجات فوق الصوتية 1-5. لأن هذه الاستخدامات العلاجية تتطلب استمرار microbubble داخل الأوعية الدموية، وتمتلئ هذه microbubbles عادة مع الخاملة، الغازات عالية الوزن الجزيئي مثل الهيدروكربونات المشبعة بالفلور 6، والتي لها قدرة منخفضة على الذوبان في الدم واستقرار 3،4 فقاعة.
مؤخرا، تم تصميمها على أساس الدهون microbubbles الأكسجين (LOMs) لتقديم الجرعات العلاجية من الأكسجين، والذي حفظه نهاية الجهاز تسليم الأوكسجين والدورة الدموية منع عدم الاستقرار خلال فترات انسداد مجرى الهواء أو نقص الأكسجة 7. المستحلبات مصممة للتسليم الغاز في الوريد تتطلب ميزات تصميم تختلف عن تلك المستخدمة لعوامل التباين الموجات فوق الصوتية أو تسليم المخدرات المستهدفة. أولا، لأن الجسم يستهلك كميات كبيرة من غاز الأكسجين (~ 200 مل / دقيقة)، يجب أن تنتج LOMs وحقن على نطاق واسع. هذا يتطلب أن عملية التصنيع تكون فعالة. ثانيا، ينبغي أن تكون عملية التصنيع حلقة مغلقة من أجل تجنب التلوث النيتروجين من خلال التعرض لLOMs (التي ينبغي أن تملأ مع 100٪ من الأكسجين) إلى الهواء المحيط. الثالثة، وذلك لأن الغرض من LOMs هو تسليم الغاز في الوريد، يجب أن يكون الحد الأقصى جزء من الغاز LOMs، مع الاعتراف القيود التي تفرضها مستحلب اللزوجة 7. أخيرا، كما هو الحال مع أي حقن في الوريد، مراقبة دقيقة على توزيع حجم الجسيمات هو ضروري لتجنب انسداد الاوعية الدموية الدقيقة 8.
هناك العديد من الطرق التي أنشئت لتصنيع microbubble. صوتنة يستخدم كثافة عالية، وتطبيق الموجات فوق الصوتية ذات التردد المنخفض إلى واجهة الهواء السائل من مستحلب الذي يتضمن السطحي، مثل فوسفورية متقابلة الزمر، في وجود فراغ الرأس الغاز لإنتاج microbubbles 7،9. هذه العملية يمكن السيطرة عليها من خلال تغيير فائقةتردد الصوت والقوة ومدة النبضة، وتوزيع حجم الناتج يمكن أن تكون مصممة لإنتاج microbubbles لتوزيع حجم معين، على الرغم من صوتنة ونادرا ما يستخدم في صناعة microbubbles المستخدمة سريريا. الدمج هو التحريض الميكانيكية مكثفة من السطحي والغاز في نظام مغلق، والذي هو أيضا من الصعب زيادة لاستيعاب كميات كبيرة 2. استنادا على microfluidics الحبرية، يسمح بالتحكم الدقيق في توزيع حجم microbubble 10-13. وإن كان من الصعب تقليديا لزيادة، متعدد القنوات، وقد وصفت على microfluidics عالية السرعة التي تزيد microbubble كفاءة الإنتاج 13. Microbubbles تصنيعها باستخدام أي من هذه الأساليب قد تتطلب عمليات تصنيع للحد من حجم آخر، مثل تجزئة الطرد المركزي و14،15 16،17 microbubble التعويم.
آخر بالطريقة المحددة لتصنيع microbubbles درجة عالية من الاستقرار هو homogeniz القصأوجه 6، والذي يمكن أن يؤدي إلى وجود نمط فوسفورية سداسية استقرار على سطح microbubble 18. بناء على هذا المفهوم، ونحن تصف التأسيس من القص عالية الخالط في خط لخلق LOMs الذاتي تجميع 19. في هذه العملية، ويستخدم الخالط الدورية بسرعة ريش على مقربة من غرامة شاشات شبكة emulsor المزدوج، وخلق عالية القص الميكانيكية والهيدروليكية لإنشاء microbubbles. تركيز المسلسل من مستحلب الدهون من خلال هذا النظام ينتج عن جزء الغاز تتركز على نحو متزايد، والتي يمكن حتى تتركز المزيد بواسطة الطرد المركزي.
Protocol
Representative Results
Discussion
أهم الخطوات لخلق المركزة، LOMs الاوكسيجين للغاية وتشمل: 1) التأكد من أن فراغ الرأس داخل كليات التقنية العليا لا تزال الاوكسيجين تماما؛ 2) ضمان نقاء السواغات الدهون هو الأمثل (بما في ذلك ظروف التخزين واستخدام منتجات GMP)؛ 3) ضمان أن الدهون مسحوق مزيج تماما مع المرحلة المائي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
التمويل: الجيش الأمريكي البحوث الطبية وقيادة العتاد (USAMRMC) ويديره التطبيب عن بعد ومركز بحوث تكنولوجيا متقدمة. ساهم Shunxi جي التعديل من الحقن كما هو موضح هنا.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 770365 | Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080) |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C75209 | |
| Plasma-Lyte A | VWR | 80089-818 | Alternatively can use NaCl |
| Glass collection vessel | Specialty Glass, Inc. | Custom | Contact: Pam Zurbrick – 281-595-2210 |
| Gas composition (oxygen) monitor | Precision Medical | PM5900L | |
| Sarns 8000 roller pump | Calicut Medical | 16407 | Part of a modular perfusion system |
| BIOtherm Heat Exchanger | Medtronic | ECMOtherm-II | |
| Verso laboratory in-line mixer | Silverson Machines, Inc | TH-IL-102-VERSO | Use multistage workheads and front-end extension with T piece |
| T-piece for Silverson Verso inlet port | Process Innovations | Custom | Contact: Brian Leavitt – 508-423-2266 |
| L5M-A laboratory mixer | Silverson Machines, Inc | NC0136483 | Use mesh emulsor screen (fine) |
| Rochester-Ochsner toothed forceps | Fisher Scientific | 13-812-18 | |
| 140 mL syringe | Kendall Healthcare Monoject | 8881114030 | Ensure there is a luer lock. |
| IX71 Inverted light microscope | Olympus | IX71 | |
| Retiga-2000R microscope camera | QImaging | RET-2000R-F-M-12 | |
| Accusizer 780A Autodilution | PSS-NICOMP Particle Sizing Systems | Out of production |
References
- Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5 (11), 2161-2170 (2009).
- Ren, J. L., et al. A Novel Ultrasound Microbubble Carrying Gene and Tat Peptide: Preparation and Characterization. Academic Radiology. 16 (12), 1457-1465 (2009).
- Tinkov, S., et al. Microbubbles as Ultrasound Triggered Drug Carriers. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (6), 1935-1961 (2009).
- Hernot, S., Klibanov, A. L. Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (10), 1153-1166 (2008).
- Lanza, G. M., et al. A novel site-targeted ultrasonic contrast agent with broad biomedical application. Circulation. 94 (12), 3334-3340 (1996).
- Cavalli, R., et al. Preparation and characterization of dextran nanobubbles for oxygen delivery. International Journal of Pharmaceutics. 381 (2), 160-165 (2009).
- Kheir, J. N., et al. Oxygen Gas-Filled Microparticles Provide Intravenous Oxygen Delivery. Science Translational Medicine. 4 (140), (2012).
- Lindner, J. R., et al. Microvascular rheology of definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration. Journal of the American Society of Echocardiography. 15 (5), 396-403 (2002).
- Zhao, Y. Z., et al. Preparation, characterization and in vivo observation of phospholipid-based gas-filled microbubbles containing hirudin. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (9), 1237-1243 (2005).
- Seo, M., et al. Microfluidic Assembly of Monodisperse, Nanoparticle-Incorporated Perfluorocarbon Microbubbles for Medical Imaging and Therapy. Langmuir. 26 (17), 13855-13860 (2010).
- Wan, J. D., Stone, H. A. Coated Gas Bubbles for the Continuous Synthesis of Hollow Inorganic Particles. Langmuir. 28 (1), 37-41 (2012).
- Duncanson, W. J., et al. Monodisperse Gas-Filled Microparticles from Reactions in Double Emulsions. Langmuir. 28 (17), 6742-6745 (2012).
- Kendall, M. R., et al. Scaled-Up Production of Monodisperse, Dual Layer Microbubbles Using Multi-Array Microfluidic Module for Medical Imaging and Drug Delivery. Bubble Science Engineering and Technology. 4 (1), 12-20 (2012).
- Szijjarto, C., et al. Effects of Perfluorocarbon Gases on the Size and Stability Characteristics of Phospholipid-Coated Microbubbles: Osmotic Effect versus Interfacial Film Stabilization. Langmuir. 28 (2), 1182-1189 (2012).
- Rossi, S., Waton, G., Krafft, M. P. Phospholipid-Coated Gas Bubble Engineering: Key Parameters for Size and Stability Control, as Determined by an Acoustical Method. Langmuir. 26 (3), 1649-1655 (2010).
- Swanson, E. J., et al. Phospholipid-Stabilized Microbubble Foam for Injectable Oxygen Delivery. Langmuir. 26 (20), 15726-15729 (2010).
- Kvåle, S., et al. Size fractionation of gas-filled microspheres by flotation. Separations Technology. 6 (4), 219-226 (1996).
- Dressaire, E., et al. Interfacial polygonal nanopatterning of stable microbubbles. Science. 320 (5880), 1198-1201 (2008).
- Kheir, J. N., et al. Bulk Manufacture of Concentrated Oxygen Gas-Filled Microparticles for Intravenous Oxygen Delivery. Advanced Healthcare Materials. , (2013).
