Summary
Se describen métodos para la fabricación de grandes volúmenes de microburbujas de oxígeno a base de lípidos (LOM) diseñados para la administración intravenosa de oxígeno usando homogeneización de alta cizalladura y la concentración de serie.
Abstract
Microburbujas rellenas con gas que se han desarrollado como agentes de contraste de ultrasonidos y de administración de fármacos. Las microburbujas se pueden producir mediante el procesamiento de tensioactivos usando sonicación, agitación mecánica, dispositivos de microfluidos, o la homogeneización. Recientemente, las microburbujas de oxígeno a base de lípidos (LOM) han sido diseñados para suministrar oxígeno por vía intravenosa durante las emergencias médicas, revirtiendo la hipoxemia en peligro la vida, y la prevención de lesiones posteriores de órganos, paro cardíaco y muerte. Se presentan métodos para la producción a escala de microburbujas altamente oxigenados usando un homogeneizador de alta cizalla en bucle cerrado. El proceso puede producir 2 L de LOM concentrado (90% en volumen) en 90 min. Burbujas resultantes tienen un diámetro medio de ~ 2 m, y un perfil reológico compatible con la de la sangre cuando se diluye al 60% en volumen. Esta técnica produce LOM en alta capacidad y con una alta pureza de oxígeno, lo que sugiere que esta técnica puede ser útil para los laboratorios de investigación traslacional.
Introduction
Las microburbujas compuestas de la proteína, polímero, y cáscaras de lípidos se han desarrollado como vectores para la administración de fármacos, la terapia génica, y agentes de contraste de ultrasonido 1-5. Debido a que estos usos terapéuticos requieren persistencia intravascular de microburbujas, tales microburbujas son comúnmente llenos con gases inertes, de alto peso molecular, tales como los perfluorocarbonos 6, que tienen baja solubilidad en sangre y estabilizan la burbuja de 3,4.
Recientemente, las microburbujas de oxígeno a base de lípidos (LOM) se han diseñado para administrar dosis terapéuticas de oxígeno, lo que puede preservar el suministro de oxígeno de los órganos diana y evitar la inestabilidad hemodinámica durante periodos de obstrucción de la vía aérea o la hipoxemia 7. Emulsiones diseñados para la administración intravenosa de gas requieren diferentes características de diseño que los utilizados para los agentes de contraste de ultrasonido o la entrega de fármacos. En primer lugar, debido a que el cuerpo consume grandes volúmenes de gas de oxígeno (~ 200 ml / min), LOM deben ser producidos yinyectado a gran escala. Esto requiere que el proceso de fabricación sea eficiente. En segundo lugar, el proceso de fabricación debe ser de circuito cerrado con el fin de evitar la contaminación de nitrógeno a través de la exposición de LOM (que debe ser llenado con 100% de oxígeno) al aire ambiente. En tercer lugar, porque el propósito de LOM es la entrega de gas por vía intravenosa, la fracción de gas de LOM se debe maximizar, reconociendo las limitaciones impuestas por la viscosidad de la emulsión 7. Finalmente, como con cualquier inyectable intravenosa, un control preciso sobre la distribución del tamaño de partícula es esencial para evitar la obstrucción microvascular 8.
Hay varios métodos establecidos para la fabricación de microburbujas. La sonicación utiliza de alta intensidad, ultrasonido de baja frecuencia aplicada a la interfaz aire-líquido de una emulsión que incluye un agente tensioactivo, tal como un fosfolípido anfipático, en la presencia de un espacio de cabeza de gas para producir microburbujas 7,9. Este proceso se puede controlar mediante la variación de ultrala frecuencia del sonido, la potencia y duración del pulso, y la distribución del tamaño resultante se pueden adaptar para producir microburbujas de una distribución de tamaño específica, aunque sonicación rara vez se utiliza en la fabricación de microburbujas utilizados clínicamente. Fusión es la intensa agitación mecánica de un agente tensioactivo y gas en un sistema cerrado, que es también difícil de escalar para acomodar grandes volúmenes 2. Microfluídica basada en la gotita permite un control preciso de la distribución del tamaño de microburbujas 10-13. Aunque tradicionalmente difícil de escalar, multicanal, microfluidos de alta velocidad se han descrito lo que aumenta la eficiencia de producción de microburbujas 13. Las microburbujas fabricados utilizando cualquiera de estos métodos pueden requerir procesos de reducción de tamaño post-producción, tales como el fraccionamiento centrífuga 14,15 y microburbujas de flotación 16,17.
Otro método establecido para la fabricación de microburbujas altamente estables es homogeniz cizallamientoación 6, que puede resultar en un patrón hexagonal de fosfolípido estabilizador sobre la superficie de microburbujas 18. Sobre la base de este concepto, se describe la incorporación de un homogeneizador de alto cizallamiento en línea para crear auto-montaje de LOM 19. En este proceso, el homogeneizador utiliza cuchillas que gira rápidamente en estrecha proximidad a finas pantallas duales emulsor de malla, la creación de alto cizallamiento mecánico e hidráulico para la creación de microburbujas. Concentración de serie de la emulsión de lípidos a través de este sistema se obtiene una fracción de gas cada vez más concentrada, que puede ser incluso concentra adicionalmente por centrifugación.
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Protocol
1. Sistema de Configuración
El sistema consta de una explotación y concentrando tanque (HCT) equipado con un único mezclador etapa, un homogeneizador de alta cizalla en línea, una bomba de rodillo para mover fluido entre el HCT y el homogeneizador, y un intercambiador de calor (Figura 1).
- Coloque una esterilizados, de boca ancha 4 L recipiente de recogida de vidrio equipado con 2 puertos base y 3 puertos laterales debajo de la mesa de mezclas de una sola etapa. Bajar el cabezal mezclador a la boca del recipiente y asegurar un ajuste estanco a los gases con juntas de goma o cinta (con el fin de evitar que el aire ambiente a partir de la contaminación del espacio de cabeza).
- Coloque uno de los puertos base (Figura 1, # puerto 1) del HCT con 3/8 estéril "(ID) tubo transparente, aproximadamente 10" de largo, provista de una llave de 3 vías en la punta para la recolección de la emulsión concentrada .
- Montar el segundo puerto base (Figura 1, # puerto 2) con estériles de 3/8 "(ID) tubos, approximately 36 "de longitud. Alimentar este tubo a través de una bomba de rodillos. Coloque la entrada del homogeneizador de alta cizalla con una pieza en T que incluye dos puertos y conectar de la siguiente manera: conectar la tubería desde el puerto # 2, a través de la bomba de rodillos y conectar con el puerto lateral de la pieza en T. Conecte el otro puerto para un tanque de oxígeno utilizando un medidor de flujo de gas de oxígeno de bajo flujo.
- Conectar el puerto de salida del homogeneizador de alto cizallamiento al puerto de entrada de un intercambiador de calor en línea se mantiene a 4 ° C. Conectar el puerto de salida del intercambiador de calor para el puerto de retorno de la HCT (Figura 1, el puerto # 3), la creación de un sistema de bucle cerrado.
- Adjuntar un tanque de oxígeno (a través de un medidor de flujo) a la HCT (Figura 1, el puerto # 4). Conectar un monitor de la composición del gas que está abierto a la atmósfera para el puerto superior de la HCT (Figura 1, el puerto # 5).
- Si se desea la esterilidad, esterilizar los componentes de vidrio y de metal antes de cada uso por autoclave. Esterilizar los componentes de tubos y co plásticonnectors por óxido de etileno antes de cada uso. Esto es especialmente importante si el producto va a ser probado in vivo.
2. LOM Fabricación
- Colocar 20 g de GMP 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) y 10 g de colesterol en la base de la HCT. Añadir 1 l de plasma-Lyte A a la HCT y agitar la mano durante 1 min, la integración tanto de lípidos como sea posible en la fase acuosa.
- Bajar el mezclador de una sola etapa en la fase acuosa, asegurándose de que todo el cabezal de la batidora está cubierta por la fase acuosa. Asegúrese de que la parte superior de la HCT es tight gas (véase el paso 1.1 anterior) y que no hay puertos laterales abiertos. Encienda la fuente de gas conectado al puerto # 4 y esperar hasta que la fracción de oxígeno del espacio de cabeza HCT alcanza> 95%. A 10 L / min (LPM), esto se llevará ~ 10 min.
- Uso del mezclador de una sola etapa, mezclar la emulsión precursora durante 5 min a 5000 rpm. La mezcla resultante debería aparecer de color blanco pálido y no contienen lipi visibled grumos. Una vez mezclado, mezcla lípido-agua no utilizada se puede almacenar a 4 º C durante un máximo de 30 días antes de un solo uso.
- Primer el sistema de circuito cerrado con toda la emulsión precursora mediante la activación de la bomba de rodillos a 1.3 LPM. Una vez que el sistema está preparado, mantenga la bomba al 1,3 LPM.
- Para comenzar la fabricación de las LOM, encienda el homogeneizador de alto cizallamiento en línea a 7.500 rpm. Inmediatamente después, gire en el flujo de oxígeno a la parte de entrada del homogeneizador a 0.5 LPM. Mantenga el mezclador de una sola etapa (en el HCT) sobre a 3.500 rpm. LOM se forman en la interfase de las palas del rotor y las pantallas de emulsor en el homogeneizador en línea (Figura 2). En cuestión de minutos, el líquido debe convertirse visiblemente más viscoso. Un enfoque más riguroso es determinar la viscosidad como una función del tiempo, lo que puede hacerse mediante la eliminación de partes alícuotas desde el puerto 1 durante la fabricación y el análisis con un viscosímetro.
Nota: Si las burbujas de aire visibles están presentes en el tubo que sale de la mezcladora, de oxígenofluir al homogeneizador en línea es demasiado alto. Se valora por el flujo de gas hasta que el líquido es opaco y no contiene burbujas de gas visibles. - Ejecute el sistema durante 15 minutos, y luego apague la alta homogeneizador de cizallamiento y la entrada de oxígeno a la misma. Continuar para ejecutar el mezclador de una sola etapa en el HCT hasta que se retire la emulsión; Esto mitiga la separación de fases y mantiene el producto relativamente uniforme dentro de la HCT.
Nota: El volumen de la emulsión lleno de gas debería aumentar aproximadamente 2 a 3 veces durante la fase de concentración de serie. Si no es así, compruebe para asegurarse de que el oxígeno está fluyendo hacia el homogeneizador de alta cizalla y que las concentraciones de lípidos en la emulsión precursora son correctas. Eficiencia de la producción disminuye a medida que disminuye la concentración de lípidos.
3. Colección, Concentración, evaluación y almacenamiento de LOM
- Adjunte una estéril, modificado 140 ml jeringa luer-lock a la llave de paso de puerto base # 1 en el recipiente de recogida. Elaborar 100 ml de líquido. Estrechamente tapa de la jeringa y repetir hasta que todo el líquido se ha eliminado.
- Modificar jeringas mediante la retirada de 100 ml de aire en la jeringa y luego cortar la exceso de material de la jeringa de émbolo y por encima de la marca de 140 ml. Llenar y jeringas vacías utilizando fórceps dentadas para elaborar el émbolo. Esta modificación permite la centrifugación más fácil.
- Jeringas centrífuga con el extremo tapado orientada hacia abajo en una refrigerada (4 º C) centrífuga cucharón a 225 g durante 10 min.
- Tres capas de material aparecerán después de la centrifugación. Expulsar a la capa inferior de exceso de la fase acuosa turbia y deseche. La segunda capa es de color blanco brillante y contiene LOM concentrados. Transferencia de espuma concentrada a una jeringa impermeable a los gases usando una llave de paso de tres vías para evitar la contaminación gas ambiente. Desechar la capa final, que contiene gas oxígeno libre de LOM rotos.
- Calidad de la espuma se puede evaluar por alcanzar ≥ 90% de gas de espuma concentrada. Calculcomió concentración de gas de la siguiente manera:
Gas = Volumen% [(peso volumen de la espuma / espuma) - 1] x 100- Como un control de segunda calidad, las microburbujas de tamaño por oscurecimiento de luz para determinar si el tamaño de partícula está dentro del rango esperado. Cabe señalar que un cambio en el tiempo de homogeneización o formulación podría alterar el tamaño de burbuja.
- Estrechamente tapar la jeringa de vidrio con un racor Luer. LOM concentrados se pueden diluir con plasma-Lyte A en el momento de uso. Las jeringas se pueden almacenar a 22, 4, o -20 º C; temperaturas más frías pueden proporcionar una mayor estabilidad en el almacenamiento 7.
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Representative Results
Homogeneización de alta cizalladura permite la producción eficiente (es decir, dentro de una tarde) de LOM suficientes para un estudio en animales y no requiere conocimientos técnicos. Una vez hábil, hasta 2 litros de LOM concentradas se puede fabricar en 90 min.
Tamaño de microburbujas y morfología se evaluó mediante microscopía óptica y por oscurecimiento de luz. Cuando se visualizó una muestra de 10 l de LOM, se observaron LOM esféricas, así como una relativa escasez de restos de lípidos (Figura 3A). Esto es especialmente cierto cuando se usa el producto GMP. Cuando la misma muestra de LOM fue evaluada por oscurecimiento de luz, el diámetro medio de partícula fue de 2.624 ± 0.332 micras (SD). Mayor que 90% de LOM fueron <10 m de diámetro, y la población era polidisperso (Figura 3B).
Viscosidad de la emulsión era dependiente en gran medida de la fracción de gas (y por lo tanto, de la concentración de microburbujas). Dos alícuotas mlde LOM de las concentraciones de gases diferentes fueron estudiadas mediante un barrido de flujo en estado estacionario utilizando un 40 mm geometría de placas paralelas como el estrés se varió de 0,1 a 10.000 μN · m. Todas las fracciones de gas LOM presentan un comportamiento reofluidificante, y este fenómeno fue más pronunciado en las fracciones de gas más altas. LOM que contienen 60% de volumen de gas mostraron un perfil reológico similar a la sangre (Figura 4).
Finalmente, el contenido de oxígeno (incluyendo fracción de gas y la concentración fraccional de oxígeno) de LOM fue probada mediante la adición de volúmenes variables de oxígeno contenidas dentro de 60% en volumen de LOM a alícuotas de sangre humana desaturado con un déficit de oxígeno conocido. Como se ha descrito anteriormente, el contenido de oxígeno de LOM puede calcularse a partir del aumento en la concentración de oxihemoglobina 7. La relación entre el volumen de oxígeno añadido dentro de LOM y el incremento volumétrico en el contenido de oxígeno de la sangre fue de 1.053 ± 0.03025 (SD) (IC 95% = 0,9865 a 1,120) (Fig.ure 4B), lo que sugiere que las LOM probadas contenían casi 100% de oxígeno, exhibió algunas bolsas de gas atrapadas (que no transfiera eficientemente el oxígeno a la sangre, pero flotar rápidamente), y transferir eficazmente toda su carga de oxígeno a la sangre humana in vitro.
Figura 1. Fabricación esquemática de configuración. LOM se producen utilizando un homogeneizador de alta cizalla en línea en un sistema de circuito cerrado. LOM se llevan a cabo dentro de la explotación y la concentración del tanque (HCT) bajo agitación constante. La emulsión se mueve a través del sistema usando una bomba de rodillos. El calor generado por el homogeneizador se elimina mediante un intercambiador de calor. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. </ A>
Figura 2. Auto-ensamblaje de los LOM dentro de un tamiz emulsor de malla fina. A) Una cuchilla que gira rápidamente pasa sobre un tamiz emulsor de malla fina, creando un efecto de sifón que se basa en las fases acuosa y de gas. Pequeñas burbujas de oxígeno se forman por cizallamiento, y están rodeados rápidamente por las colas de lípidos hidrófobos de fosfolípidos anfipáticos, la creación de una burbuja de gas lleno de auto-montaje (B).
Figura 3. Caracterización de LOM. A) Una microfotografía representativa de LOM esféricas que presentan una distribución de tamaño polidispersa. Barra de escala =10 micras. B) La distribución de tamaño de LOM según la evaluación de oscurecimiento de luz. Datos = significan, error = SEM.
Figura 4. Propiedades de LOM centrifugó y concentradas. A) El perfil reológico de una emulsión de LOM a 60, 70 y 90% en volumen de gas. La dilución de espuma concentrada a 60% en volumen de gas se obtiene un perfil reológico similar a la sangre humana (hematocrito 40%). Datos = significan, error = SEM. B) La relación entre el contenido de oxígeno de los LOM añadió a la sangre humana y el incremento medido en el contenido de oxígeno de la sangre. Datos = significan, error = SEM, línea = regresión lineal con IC del 95% de la línea de mejor ajuste.
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Discussion
Los pasos más importantes para la creación de LOM concentrados, altamente oxigenados son: 1) asegurarse de que la cámara de aire dentro de la HCT sigue plenamente oxigenada; 2) asegurarse de que la pureza de los excipientes lipídicos es óptima (incluyendo las condiciones de almacenamiento y uso de productos GMP); 3) asegurar que los lípidos en polvo se mezclan completamente con la fase acuosa antes de imprimar el sistema; y 4) prestando mucha atención al aumento de la fracción de gas dentro de la HCT para asegurarse de que la fracción de volumen de gas no exceda 70%.
El método se describe aquí utiliza alta homogenización cizalla para crear microburbujas huecos. Lípidos anfipáticos se suspenden con la fase acuosa, que se utiliza para llevar a los lípidos en el homogeneizador en línea. Lípidos GMP grado se utilizan para los estudios in vivo, y en general se prefieren debido a que contienen un menor número de agregados de lípidos e impurezas. Los lípidos también están sujetos a la oxidación de lípidos (especialmente cuando se almacenadentro de un fluido oxigenado) y la contaminación bacteriana. LOM se forman cuando las colas hidrofóbicas organizan alrededor de pequeñas microburbujas de gas oxígeno creados dentro del homogeneizador en línea (Figura 2). La homogeneización de LOM a 7.500 rpm somete las microburbujas a las tensiones mecánicas adicionales a medida que se muelen entre las puntas de las palas del rotor y la pared interna del estator. LOM también se someten a cizallamiento hidráulico, ya que se ven obligados a alta velocidad a través de la malla de tamiz emulsor ultra-fino, lo que reduce aún más el tamaño de partícula. Las fuerzas de corte generan calor dentro del homogeneizador en línea y el destino, en el mezclador de una sola etapa; un intercambiador de calor en línea antes del regreso a la HCT es necesario eliminar este calor. Ausencia de un intercambiador de calor puede elevar la temperatura por encima de la temperatura de transición de fase del lípido (55 ° C durante DSPC), lo que aumenta la fluidez de los lípidos y los resultados en la pérdida de producto. Creación de la emulsión dentro de una cerrada, en la línea de dispositivo asegura que oxyge puran se incorpora en el núcleo de LOM mediante la prevención de la contaminación del aire. Además, LOM están continuamente expuestas a con el espacio de cabeza gaseoso de la HCT. Por lo tanto, es imperativo para asegurar que el efecto de succión creado por el mezclador de laboratorio dentro de la HCT no crea una inversión del flujo de aire de la atmósfera en el HCT (a través del monitor de la composición del gas, que está abierto a la atmósfera para evitar la presurización de la HCT) . Las velocidades de flujo de gas de oxígeno descritos aquí deben ser suficientes para prevenir este fenómeno.
Reciclaje de la emulsión a través del homogeneizador en línea durante la fase de concentración de serie crea LOM adicionales de fosfolípidos 'no utilizados' restantes en la fase acuosa, y también somete LOM intactas al corte repetido, lo que puede disminuir aún más el tamaño de partícula. Tamaño de las partículas y la concentración de gas se puede, por tanto, adaptar ajustando la velocidad del mezclador, emulsor pantallas, la luz de malla, y el tiempo de ejecución (es decir, la duración de la serie Concentration paso). La agitación mecánica produce una distribución de tamaño polidispersa. La amplia distribución de tamaños permite más apretado embalaje de microburbujas, lo que aumenta la fracción de gas encapsulado máximo en un volumen dado de espuma. La alteración de la química de la formulación por los agentes potenciadores de la viscosidad de inclusión puede ser utilizado para crear una distribución de tamaños más homogénea si se desea. Hemos encontrado que un tiempo de ejecución de 15 min es más ideal; a medida que aumenta la concentración de microburbujas, la emulsión se vuelve cada vez más viscoso. Una vez que se alcanza una viscosidad crítico, es ya no bombea eficazmente usando una bomba de rodillos. Esto hace que el gas libre de pasar a través del homogeneizador sin incorporarse a LOM y se puede ver en el tubo transparente. En esta etapa, por lo general, optar por dejar la etapa de concentración de serie, aunque si se desea, la velocidad de flujo de gas en el homogeneizador en línea y se puede disminuir el caudal de la bomba de rodillos se puede aumentar para crear fracciones de gas más altas. Sin embargo, altamente viscous emulsiones requieren más fuerza para retirar en jeringas para la etapa de centrifugación, y pueden disminuir el rendimiento de este proceso.
La etapa de centrifugación se ha facilitado mediante la modificación de 140 ml jeringas para truncar el émbolo y la base de la jeringa, de manera que forman un jeringas llenas incluso cilindro. Esto facilita en gran medida la carga y descarga de las jeringas en la centrífuga. Después de la centrifugación, jeringas contienen típicamente tres capas. La capa más densa (cerca de la punta de la jeringa cuando jeringas se cargan nariz hacia abajo) contiene fosfolípidos no utilizados y la mayor parte de la fase acuosa. En algunos casos, los 'escombros' soleado se puede ver dentro de la punta de la jeringa que normalmente contiene grumos de lípidos. Para los experimentos básicos, el contenido de esta "fase acuosa" se pueden reutilizar para posteriores experimentos, aunque hemos encontrado que esto disminuye sustancialmente la eficiencia del proceso. (Para mitigar este problema, excipientes fosfolípidos adicionales puedense añade a la emulsión de precursor de reciclado, teniendo cuidado de mantener la relación molar de cada excipiente.) La capa media dentro de cada jeringa es de color blanco brillante y contiene LOM concentradas. Normalmente hay una línea clara de demarcación entre la capa inferior y central. La capa media de cada jeringa se puede combinar para procesamiento adicional como se describe a continuación. La capa superior contiene espuma esponjosa que contiene gas libre de LOM rotos a lo largo del proceso de fabricación. Las capas superior e inferior son típicamente desechados. Durante la centrifugación, es importante asegurarse de que cada jeringa está cubierto por una tapa de la jeringa ajustada con el fin de evitar la extrusión de la emulsión en la centrífuga durante el procesamiento. La centrifugación a velocidades más altas se vio limitada por la resistencia al aplastamiento de las jeringas que utilizamos. Si es necesario para lograr una clara línea de demarcación entre las capas inferiores y medias (por lo general cuando se estaban centrifugan emulsiones que contienen fracción elevada de gas), el tiempo de centrifugación puede serextendido. El uso de una, de 3 vías llave de paso hermético al gas para combinar LOM concentradas es útil para prevenir la contaminación del aire. También es importante asegurarse de que LOM-que contienen jeringas se mantienen siempre nivelado y que cualquier aire ambiente es expulsado inmediatamente. Para limitar la contaminación del aire durante el almacenamiento, las jeringas se deben sellar con sólo tapas luer-lock. Las jeringas de plástico son conocidos por ser permeable a los gases, por lo que las jeringas de vidrio o de metal son preferibles para el almacenamiento a largo plazo.
Como se describió anteriormente, emulsiones expuestas a la etapa de concentración de serie de 15 min exhiben típicamente 70% de gas por volumen y pueden concentrarse a 90% de gas por centrifugación. Incluso si el 70% de volumen de emulsión se desea, al final, hemos encontrado centrifugación para ser útil para eliminar los fosfolípidos que no estén incorporadas en LOM desde el concentrado. Esto también se puede lograr al permitir emulsiones reposar durante la noche para lograr la separación de fases. Para los experimentos in vivo, a menudo diluir el concentradoLOM con Plasma-Lyte A, mezclar suavemente, luego se centrifuga de nuevo para eliminar los fosfolípidos no utilizadas adicionales y otros desechos. Este paso puede repetirse varias veces como sea necesario para eliminar el exceso de residuos de lípidos. La inyección de los fosfolípidos que no estén incorporadas en LOM no es deseable debido a la carga adicional de los lípidos que imparten en el establecimiento de una alta tasa de infusión.
Hemos encontrado varios errores comunes a evitar en este proceso de fabricación. En primer lugar, los excipientes lipídicos deben ser frescos, se almacenan a -80 ° C, y no se utiliza si expirado. La solución del precursor no debe ser reutilizado para los estudios in vivo, en forma de emulsiones resultantes son incoherentes en su distribución de tamaño y de la fracción de gas máxima, y puede contener bacterias contaminantes, lípidos oxidados, o grumos de lípidos. En segundo lugar, una vez que la emulsión alcanza 'viscosidad crítico' durante la fabricación, que ya no se bombea a través del sistema de manera efectiva, y grandes bolsas de gas se formará dentro de la HCT. La alta viscosidad de la emulsión también hace que la emulsión difíciles de manipular y elaborar en jeringas. Estos problemas son mejor evitar midiendo el aumento en la fracción de gas dentro de la HCT (cuantificando el incremento en el volumen como la fracción de gas aumenta) y detener el proceso de concentración en serie una vez que los dobles volumen de partida.
Una limitación clave de esta técnica es la necesidad persistente de una etapa de centrifugación, lo que es indeseable, ya que crea el potencial para el aire y la contaminación bacteriana del producto final, e impide que esto sea un proceso continuo. En el futuro, la etapa de concentración de serie puede ser modificado en un sistema de un solo paso para la fabricación de drogas comercial mediante la utilización de un sistema de descarga hidráulico para obviar la necesidad de centrifugación por lotes. El homogeneizador en línea y mezcladores de laboratorio pueden ser fabricados con 3/16 de acero inoxidable y se esterilizaron en su lugar. La inclusión de otros gases en el sistema puede ampliar ªe utilidad de esta técnica aún más.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Financiación: Ejército de los EE.UU. de Investigación Médica y de Material Command (USAMRMC) y gestionado por el Centro de Investigación de Telemedicina y Tecnología Avanzada. Shunxi Ji contribuyó a la modificación de las jeringas como se describe aquí.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 770365 | Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080) |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C75209 | |
| Plasma-Lyte A | VWR | 80089-818 | Alternatively can use NaCl |
| Glass collection vessel | Specialty Glass, Inc. | Custom | Contact: Pam Zurbrick - 281-595-2210 |
| Gas composition (oxygen) monitor | Precision Medical | PM5900L | |
| Sarns 8000 roller pump | Calicut Medical | 16407 | Part of a modular perfusion system |
| BIOtherm Heat Exchanger | Medtronic | ECMOtherm-II | |
| Verso laboratory in-line mixer | Silverson Machines, Inc | TH-IL-102-VERSO | Use multistage workheads and front-end extension with T piece |
| T-piece for Silverson Verso inlet port | Process Innovations | Custom | Contact: Brian Leavitt - 508-423-2266 |
| L5M-A laboratory mixer | Silverson Machines, Inc | NC0136483 | Use mesh emulsor screen (fine) |
| Rochester-Ochsner toothed forceps | Fisher Scientific | 13-812-18 | |
| 140 ml syringe | Kendall Healthcare Monoject | 8881114030 | Ensure there is a luer lock. |
| IX71 Inverted light microscope | Olympus | IX71 | |
| Retiga-2000R microscope camera | QImaging | RET-2000R-F-M-12 | |
| Accusizer 780A Autodilution | PSS-NICOMP Particle Sizing Systems | Out of production |
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