Summary
Wir beschreiben Methoden zur Herstellung großer Mengen von Lipid-basierten Sauerstoffmikrobläschen (LOMs) zur intravenösen Sauerstoffzufuhr ausgebildet mit hoher Scherung homogenisiert und serielle Konzentration.
Abstract
Gasgefüllte Mikrobläschen haben als Ultraschallkontrast und Drug-Delivery-Agenten entwickelt. Mikrobläschen können durch Verarbeiten Tenside mit Beschallung, mechanischer Agitation, mikrofluidischen Vorrichtungen oder Homogenisierung hergestellt werden. Kürzlich, Lipid-basierten Sauerstoff-Mikrobläschen (LOMs) wurden entwickelt, um Sauerstoff während der medizinischen Notfällen intravenös zu liefern, Rückfahrlebensbedrohlichen Hypoxämie und verhindert spätere Organschäden, Herzstillstand und Tod. Wir stellen Methoden für die vergrösserte Produktion von stark mit Sauerstoff-Mikrobläschen mit einem Closed-Loop-High-Shear Homogenisator. Das Verfahren kann 2 l konzentrierter LOMs (90 Vol.%) in 90 min zu erzeugen. Resultierende Blasen einen durchschnittlichen Durchmesser von ~ 2 um, und eine rheologische Profil in Übereinstimmung mit der von Blut, wenn sie 60 Vol.% verdünnt. Diese Technik erzeugt LOMs in hoher Kapazität und hoher Sauerstoffreinheit, was darauf hindeutet, dass diese Technik kann für die translationale Forschungslabors sein.
Introduction
Mikrobläschen von Protein-, Polymer-und Lipidschalen zusammengesetzt sind als Vektoren für die Arzneimittelabgabe, Gentherapie, und Ultraschall-Kontrastmitteln 1-5 entwickelt. Da diese therapeutische Anwendungen erfordern intravaskulären Mikroblasen-Persistenz, werden solche Mikroblasen häufig mit inerten, molekulare Gase hoch wie perfluorierte Kohlenwasserstoffe 6, die geringe Löslichkeit im Blut haben und Stabilisierung der Blase 3,4 gefüllt.
Kürzlich, Lipid-basierten Sauerstoff-Mikrobläschen (LOMs) wurden entwickelt, um therapeutische Dosen von Sauerstoff, der Endorgane Sauerstoffversorgung zu erhalten und hämodynamische Instabilität in Zeiten der Obstruktion der Atemwege oder Hypoxämie 7 verhindern können, zu liefern. Emulsionen zur intravenösen Gaszufuhr ausgelegt erfordern unterschiedliche Design-Merkmale als die für Ultraschallkontrastmittel oder gezielten Verabreichung von Medikamenten verwendet. Erstens, weil der Körper verbraucht große Mengen an Sauerstoffgas (~ 200 ml / min), ist LOMs erzeugt werden undim großen Maßstab injiziert. Dies erfordert, dass der Herstellungsprozess effizient. Zweitens sollte das Herstellungsverfahren mit geschlossener Schleife, um Stickstoffverunreinigung durch die Belichtung LOMs (die mit 100% Sauerstoff gefüllt werden soll) zu vermeiden, um die Umgebungsluft sein. Drittens, da der Zweck LOMs intravenös Gaszufuhr sollte der Gasanteil LOMs maximiert werden, wobei die Einschränkungen, die durch Emulsionsviskosität 7 auferlegt. Schließlich, wie bei jedem intravenös injizierbare ist eine genaue Kontrolle über die Partikelgrößenverteilung wesentlich zur Vermeidung mikrovaskuläre Obstruktion 8.
Es gibt mehrere etablierte Methoden für die Herstellung von Mikrobläschen. Beschallung hoher Intensität verwendet, um die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche einer Emulsion, die ein Tensid, wie ein amphipathisches Phospholipid in Gegenwart eines Gasraum auf 7,9 Mikrobläschen erzeugen beinhaltet aufgebracht niederfrequenten Ultraschall. Dieses Verfahren ist durch Variieren UltraSchallfrequenz, Leistung und Impulsdauer, und die resultierende Größenverteilung hergestellt werden, um Mikrobläschen aus einem bestimmten Größenverteilung zu erzeugen, wenn der Beschallung nur selten bei der Herstellung von klinisch verwendeten Mikrobläschen verwendet werden. Verschmelzung ist die intensive mechanische Bewegung eines Tensids und Gas in einem geschlossenen System, das auch schwierig zu skalieren, um große Mengen 2 aufzunehmen. Tröpfchenbasierte Mikrofluidik ermöglicht die präzise Steuerung der Mikroblasengrößenverteilung 10-13. Obwohl traditionell schwierig zu skalieren, Multi-Channel-, High-Speed-Mikrofluidik beschrieben worden, die Effizienz in der Produktion von Mikrobläschen 13 zu erhöhen. Mikrobläschen mit einer dieser Methoden hergestellt wurden, können nach der Herstellung Zerkleinerungsprozesse, wie Zentrifugalfraktionierung 14,15 und Mikroblasen-Flotation 16,17 erforderlich.
Eine weitere etablierte Methode für die Herstellung von hochstabilen Mikrobläschen Scher homogenization 6, die in einem Stabilisierungs Phospholipid hexagonalen Muster auf der Mikroblasenoberfläche 18 führen kann. Aufbauend auf diesem Konzept beschreiben wir den Einbau eines In-Line-Homogenisator mit hoher Scher zu selbstorganisierenden LOMs 19 erstellen. In diesem Prozess nutzt der Homogenisator schnell rotierenden Klingen in unmittelbarer Nähe zu Dual feinmaschigen Emulsor Bildschirme, wodurch hohe mechanische und hydraulische Schere für die Schaffung von Mikrobläschen. Serien Konzentration der Lipidemulsion durch dieses System liefert eine zunehmend konzentrierte Gasfraktion, die noch weiter durch Zentrifugation konzentriert werden kann.
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Protocol
1. System Set-up
Das System besteht aus einer Halte-und Konzentrationstank (HCT) mit einem Einzelstufen-Mischer, einem In-line-Homogenisator mit hoher Scherkraft, einer Walzenpumpe, um Fluid zwischen der HCT und dem Homogenisator zu bewegen, und einen Wärmetauscher (1) angebracht ist.
- Legen Sie ein sterilisiert, Weithals 4 l Glassammlung mit 2 Basisanschlüsse und 3 Seitenöffnungen unterhalb der einstufigen Mischgefäß montiert. Senken Sie den Mischkopf bis zur Mündung des Schiffes und sorgen für eine gasdichte Montage mit Gummidichtungen oder Band (um Umgebungsluft verunreinigen den Kopfraum zu verhindern).
- Setzen Sie einen der Basisanschlüsse (Abbildung 1, Port 1) der HCT mit steriler 3/8 "(ID) klare Schlauch, ca. 10" lang, mit einem 3-Wege-Hahn an der Spitze für die Sammlung der konzentrierten Emulsion versehen .
- Setzen Sie den zweiten Basishafen (Abbildung 1, Port # 2) mit steriler 3/8 "(ID) Schläuche, approximately 36 "in der Länge. Ziehen Sie diese Schläuche durch eine Rollenpumpe. Setzen Sie den Eingang der Hochscher Homogenisator mit einem T-Stück mit zwei Ports und wie folgt anschließen: Verbinden Schlauch von Port # 2, durch die Rollenpumpe und eine Verbindung zu der Seite Port der T-Stück. Befestigen Sie den anderen Anschluss an ein Sauerstofftank mit einem Low-Flow-Sauerstoff-Gasdurchflussmesser.
- Verbinden der Auslassöffnung des Homogenisators mit hoher Scherkraft mit der Einlassöffnung einer in-line-Wärmetauscher bei 4 ° C gehalten, Verbinden den Auslaß des Wärmetauschers zu dem Rücklaufanschluß des HCT (Fig. 1, Port Nr. 3), wodurch ein geschlossenes Schleifensystem.
- Befestigen eines Sauerstofftank (über einen Durchflussmesser) an den HCT (Fig. 1, Port # 4). Bringen Sie einen Monitor, der Gaszusammensetzung der Atmosphäre offen in die obere Öffnung des HCT (Abbildung 1, Port # 5) ist.
- Wenn Sterilität gewünscht wird, sterilisieren die Glas-und Metallkomponenten vor jeder Verwendung von Autoklaven. Sterilisieren Sie die Rohrkomponenten und Kunststoff Connectors von Ethylenoxid vor jeder Verwendung. Dies ist besonders wichtig, wenn das Produkt in vivo getestet werden.
2. LOM Herstellung
- Platzieren von 20 g GMP 1,2-Distearyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC) und 10 g Cholesterin in der Basis des HCT. 1 l Plasma-Lyte A zu der HCT und Hand Rühren für 1 min, zu integrieren, so viel wie möglich in die Lipid wässrigen Phase.
- Senken Sie den einstufigen Mischer in die wässrige Phase, so dass die gesamte Mischkopf wird von der wässrigen Phase bedeckt. Stellen Sie sicher, dass die Spitze des HCT ist gasdicht (siehe Schritt 1.1) und dass es keine offenen Seite Ports. Schalten Sie die Gasquelle an Port # 4 befestigt und warten, bis der Sauerstoffanteil der HCT Headspace erreicht> 95%. Bei 10 L / min (LPM), sollte diese nehmen ~ 10 min.
- Mit dem einstufigen Mixer, mischen Sie die Ausgangsemulsion für 5 min bei 5.000 Umdrehungen pro Minute. Die resultierende Mischung sollte blass weiß erscheinen und enthalten keine sichtbaren lipid Klumpen. Einmal gemischt, kann ungenutzt Lipid-Wasser-Mischung bei 4 º C für bis zu 30 Tage vor einmaligen Gebrauch gespeichert werden.
- Prime das gesamte System mit geschlossener Schleife mit der Vorstufen-Emulsion, indem der Rollenpumpe bei 1,3 LPM. Sobald das System grundiert, halten Sie die Pumpe auf 1,3 LPM.
- Zur Herstellung der LOMs beginnen, schalten Sie die In-Line-Homogenisator mit hoher Scher zu 7.500 Umdrehungen pro Minute. Unmittelbar danach schalten Sauerstofffluss zu dem Einlassabschnitt der Homogenisator bei 0,5 LPM. Halten Sie die stufigen Mixer-Single (in der HCT) auf 3.500 Umdrehungen pro Minute. LOMs sind an der Schnittstelle der Rotorschaufeln und den Emulsor Abschirmung innerhalb des in-line-Homogenisator (Fig. 2) ausgebildet. Innerhalb weniger Minuten sollte Flüssigkeit sichtbar mehr viskos werden. Ein strengerer Ansatz ist, um die Viskosität als Funktion der Zeit, die durch Entfernen von Aliquoten aus Port 1 während der Herstellung und Analyse mit einem Viskosimeter durchgeführt werden können, zu bestimmen.
Hinweis: Bei sichtbaren Luftblasen im Schlauch Verlassen des Mischers, Sauerstoff vorhanden sindfließen, um die in-line-Homogenisator ist zu hoch. Titriert Gasstrom nach unten, bis die Flüssigkeit ist undurchsichtig und enthält keine sichtbaren Gasblasen. - Führen Sie das System für 15 Minuten, und schalten Sie dann den hohen Scher Homogenisator und der Sauerstoffeingang zu. Fahren Sie mit dem einstufigen Mischer in der HCT laufen, bis die Emulsion entfernt wird; Dies mildert Phasentrennung und hält das Produkt im HCT relativ einheitlich.
Hinweis: Das Volumen des gasgefüllten Emulsion sollte ca. 2-3x in der Serienphase Konzentration zu erhöhen. Wenn es nicht, zu überprüfen, um sicherzustellen, daß Sauerstoff in den Homogenisator mit hoher Scher fließt und dass Lipid-Konzentrationen in der Ausgangsemulsion korrekt sind. Effizienz der Produktion nimmt mit Lipid-Konzentration abnimmt.
3. Sammlung, Konzentration, Bewertung, Lagerung von LOMs
- Bringen Sie eine sterile, modifizierte 140 ml Luer-Lock-Spritze, um den Hahn zu Basis-Port # 1 auf dem Sammelgefäß angebracht. Zeichnen bis 100 ml Flüssigkeit. Verschließe Spritze und Wiederholen, bis alle Flüssigkeit entfernt wurde.
- Ändern Spritzen durch Entnahme von 100 ml Luft in die Spritze und dann sägen Sie das überschüssige Kolben und Spritzenmaterial über der 140-ml-Marke. Füllen und leere Spritzen mit Zahnzangen für die Erstellung des Kolbens. Diese Modifikation ermöglicht eine einfachere Zentrifugieren.
- Centrifuge Spritzen mit der bedeckten Ende nach unten in einem gekühlten (4 º C) Becherzentrifuge bei 225 g für 10 min ausgerichtet.
- Drei Schichten von Material nach dem Zentrifugieren erscheinen. Vertreibt die untere Schicht der Über bewölkt wässrige Phase und entsorgen. Die zweite Schicht ist hell weiß und enthält konzentrierte LOMs. Übertragen konzentrierter Schaum zu einer gasundurchlässigen Spritze mit einem Drei-Wege-Hahn auf Umgebungsgaskontamination zu vermeiden. Entsorgen Sie die letzte Schicht, die freie Sauerstoffgas aus geplatzten LOMs enthält.
- Schaumqualität kann durch das Erreichen ≥ 90% Gas konzentrierter Schaum beurteilt werden. Calculaß Gaskonzentration, wie folgt:
Volume% Gas = [(Foam Gewicht / Volumen-Schaum) - 1] x 100- Als zweite Qualitätskontrolle, der Größe von Mikrobläschen Lichttrübung festzustellen, ob Partikelgröße innerhalb des erwarteten Bereichs. Es sei darauf hingewiesen, dass eine Änderung in der Zeit der Homogenisierung oder Formulierung kann die Blasengröße zu verändern.
- Verschließe das Glasspritze mit Luer-Lock-Montage. Konzentrierte LOMs mit Plasma-Lyte A zum Zeitpunkt der Verwendung verdünnt werden. Spritzen bei 22, 4 gespeichert werden, oder -20 º C; kälteren Temperaturen kann eine verbesserte Lagerstabilität 7.
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Representative Results
Hohe Scher Homogenisierung ermöglicht die effiziente (dh innerhalb eines Nachmittags) die Produktion von ausreichend LOMs für eine Tierstudie und nicht technisches Know-how erfordern. Sobald beherrschen, bis 2 l konzentrierter LOMs in 90 min hergestellt werden.
Mikroblasen-Größe und Morphologie wurde durch Lichtmikroskopie und durch Lichttrübung bewertet. Wenn ein 10 &mgr; l-Probe von LOMs visualisiert wurde, wurden kugelförmige LOMs erwähnt, sowie eine relativ geringe Menge an Lipid Schutt (Abbildung 3A). Dies gilt insbesondere, wenn GMP Produkt verwendet wird. Wenn die gleiche Probe LOMs wurde durch Lichttrübung beurteilt, war der mittlere Teilchendurchmesser 2,624 ± 0,332 um (SD). Mehr als 90% der LOMs waren <10 um im Durchmesser, und die Bevölkerung war polydisperse (3B).
Emulsion Viskosität stark abhängig von Gasanteil (und damit auf Mikroblasen-Konzentration). Zwei ml Aliquotsvon LOMs unterschiedlichen Gaskonzentrationen wurden mit Hilfe eines stationären Strömungs Sweep mit einem 40 mm Parallelplattengeometrie wie Stress wurde von 0,1 bis 10.000 &mgr; N · m variiert sucht. Alle LOM Gasanteile aufweisen scherentzähende Verhalten, und dieses Phänomen wurde am meisten bei höheren Gasanteile ausgeprägt. LOMs mit 60 Vol.% Gas zeigte eine rheologische Profil ähnlich wie Blut (Abbildung 4A).
Schließlich wurde der Sauerstoffgehalt (einschließlich Gasfraktion und fraktionierte Sauerstoffkonzentration) des LOMs durch Zugabe variierender Mengen von Sauerstoff innerhalb von 60 Volumen-% LOMs Aliquoten entsättigt menschlichem Blut mit einem bekannten Sauerstoffdefizit enthalten getestet. Wie zuvor beschrieben, kann der Sauerstoffgehalt des LOMs aus der Erhöhung der Oxyhämoglobin-Konzentration 7 berechnet werden. Die Beziehung zwischen Volumen von Sauerstoff in LOMs hinzugefügt und der volumetrischen Anstieg der Sauerstoffgehalt des Blutes war 1,053 ± 0,03025 (SD) (95% CI = 0,9865 bis 1,120) (Abb.Abbildung 4B), was darauf hindeutet, dass die getesteten LOMs enthalten nahezu 100% Sauerstoff, zeigten einige gefangen Gastaschen (die nicht effizient Sauerstoff übertragen, um Blut, sondern schweben heraus schnell) und effektiv ihre gesamte Sauerstoff Nutzlast Menschenblut in vitro zu übertragen.
Abbildung 1. Herstellung Setup schematisch. LOMs werden unter Verwendung eines in-line-Homogenisator mit hoher Scherkraft in einem geschlossenen System hergestellt. LOMs innerhalb einer Halteeinrichtung gehalten und konzentriert Tank (HCT) unter ständiger Durchmischung. Die Emulsion wird durch das System unter Verwendung einer Rollenpumpe bewegt. Wärme, die durch den Homogenisator erzeugt wird über einen Wärmetauscher entfernt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. </ A>
Abbildung 2. Selbstorganisation von LOMs innerhalb eines feinmaschigen Emulsorsieb. A) Eine schnell drehenden Klinge läuft über ein feinmaschiges Emulsorsieb, die Schaffung eines Siphon-Effekt, der in der wässrigen und der Gasphase zieht. Winzige Sauerstoffbläschen durch Scher ausgebildet und werden schnell durch die hydrophoben Schwänze der amphipathischen Lipid Phospholipiden umgeben, wodurch eine selbstorganisierende gasgefüllte Blase (B).
Abbildung 3. Charakterisierung von LOMs. A) Eine repräsentative Mikrophotographie von sphärischen LOMs zeigt eine polydisperse Größenverteilung. Maßstabsbalken =10 &mgr; m. B) Die Größenverteilung der LOMs wie durch Lichttrübung bewertet. Data = meine, error = SEM.
Abbildung 4. Eigenschaften zentrifugiert und konzentrierte LOMs. A) Das rheologische Profil einer LOM-Emulsion bei 60, 70 und 90 Vol.% Gas. Verdünnung des konzentrierten Schaum bis 60 Vol.% Gasausbeute ein rheologisches Profil ähnlich dem menschlichen Blut (Hämatokrit 40%). Data = meine, error = SEM. B) Das Verhältnis zwischen der Sauerstoffgehalt LOMs hinzugefügt menschlichem Blut und der gemessenen Zunahme der Sauerstoffgehalt des Blutes. Data = meine, error = SEM, Linie = lineare Regression mit 95% CI des Best-Fit-Linie.
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Discussion
Die wichtigsten Schritte zur Schaffung konzentrierte, hoch sauerstoffhaltigen LOMs gehören: 1) sicherzustellen, dass der Kopfraum in der HCT bleibt voll mit Sauerstoff angereichert; 2) sicherstellen, dass die Reinheit der Lipidträger optimal ist (einschließlich Lagerbedingungen und Verwendung von GMP-Produkte); 3) die Gewährleistung, dass die pulverförmigen Lipiden mischen vollständig mit der wässrigen Phase vor, um die System Grundierung; und 4) aufmerksam auf die Erhöhung der Gasfraktion im HCT zu gewährleisten, dass der Volumenanteil des Gases 70% nicht überschreiten.
Die Methode, die wir hier beschreiben, nutzt hohe Scher Homogenisierung zu hohlen Mikrobläschen zu schaffen. Amphipathische Lipide mit der wässrigen Phase, die verwendet wird, um die Lipide in die in-line-Homogenisator suspendiert tragen. GMP-Grade-Lipide für die in vivo-Studien verwendet werden, und sind im Allgemeinen bevorzugt, weil sie weniger Lipidaggregate und Verunreinigungen enthalten. Lipide sind ebenfalls Gegenstand der Lipidoxidation (vor allem bei der Lagerungin einer sauerstoffhaltigen Flüssigkeit) und bakterielle Verunreinigung. LOMs entstehen, wenn die hydrophoben Schwänze arrangieren um kleine Sauerstoff-Gas-Mikrobläschen in der in-line-Homogenisator (Abbildung 2) erstellt. LOMs Homogenisieren bei 7500 UpM unterwirft die Mikrobläschen zu zusätzlichen mechanischen Beanspruchungen, wie sie zwischen den Spitzen der Laufschaufeln und der Innenwand des Stators gemahlen. LOMs auch unterziehen hydraulischen Schere, wie sie mit hoher Geschwindigkeit durch die ultra-feinen Maschen Emulsorsieb gezwungen, weiter zu reduzieren Partikelgröße. Scherkräfte erzeugen Wärme innerhalb der in-line-Homogenisator und lokal an der einstufigen Mischer; ein In-line-Wärmetauscher vor der Rückkehr in die HCT ist erforderlich, um diese Wärme zu entfernen. Fehlen eines Wärmetauschers können Temperaturen oberhalb der Phasenübergangstemperatur des Lipids (55 º C für DSPC), die die Fluidität der Lipid und führt Produktverlust erhöht erhöhen. Erstellung der Emulsion in einem geschlossenen, Inline-Gerät sorgt dafür, dass reine oxygen durch die Luftverschmutzung zu verhindern, in der LOM-Kern eingebaut. Ferner LOMs kontinuierlich mit dem gasförmigen Kopfraum des HCT ausgesetzt. Es ist daher unerlässlich, um sicherzustellen, dass die Sogwirkung im HCT durch den Labor-Mischer hat eine Umkehr der Luftstrom nicht schaffen aus der Atmosphäre in den HCT (über die Gaszusammensetzung Monitor, der zur Atmosphäre offen ist Druckbeaufschlagung des HCT zu verhindern) . Die hier beschriebenen Sauerstoffgas-Strömungsraten sollten ausreichen, um dieses Phänomen zu verhindern.
Recycling der Emulsion durch die In-Line-Homogenisator bei der seriellen Konzentrationsphase schafft zusätzliche LOMs von 'unbenutzte' Phospholipide in der wässrigen Phase verbleiben und unterzieht intakt LOMs wiederholt Scher, die Partikelgröße weiter verringern kann auch. Partikelgrößen-und Gaskonzentration kann daher durch Anpassung Mischerdrehzahlen angepasst werden, Emulsor Bildschirme, Maschengröße und Laufzeit (dh Dauer des seriellen concentration Schritt). Mechanische Bewegung erzeugt eine polydisperse Größenverteilung. Die breite Größenverteilung ermöglicht engere Packung der Mikrobläschen, wodurch die maximale eingekapselten Gasfraktion Erhöhung in einem gegebenen Volumen des Schaums. Ändern Formulierungschemie durch Einschluss viskositätserhöhende Mittel verwendet werden, um eine homogene Größenverteilung erzeugen, wenn gewünscht. Wir haben gefunden, dass eine Laufzeit von 15 min ist die ideale; als Mikrobläschen-Konzentration zunimmt, wird die Emulsion immer viskoser. Sobald es eine kritische Viskosität erreicht, ist es nicht mehr mit einer Rollenpumpe effektiv gepumpt. Dies bewirkt, dass freies Gas durch den Homogenisator ohne in LOMs eingebaut und kann im durchsichtigen Schlauch gesehen werden passieren. In diesem Stadium wählt man im allgemeinen auf die Serienkonzentrationsschritt zu beenden, obwohl, wenn gewünscht, kann die Gasströmungsrate in dem in-line-Homogenisator verringert werden und die Rollenpumpenströmungsrate erhöht werden, um höhere Gasfraktionen zu erzeugen. Jedoch stark viscous Emulsionen erfordern mehr Kraft in Spritzen zur Zentrifugationsschritt zurückzuziehen, und kann die Ausbeute dieses Prozesses zu verringern.
Der Zentrifugationsschritt wurde durch Modifikation 140 ml Spritze, um den Kolben und der Basis der Spritze erleichtert abgeschnitten wurde, so daß Spritzen bilden eine gerade Zylinder. Dies erleichtert das Be-und Entladen von Spritzen in die Zentrifuge. Nach der Zentrifugation Spritzen enthalten typischerweise drei Schichten. Die dichteste Schicht (in der Nähe der Spitze der Spritze, wenn Spritzen Nase eingelegt wurde) enthält ungenutzte Phospholipide und den Großteil der wässrigen Phase. In einigen Fällen kann trübe "Schmutz" in der Spitze der Spritze, der typischerweise Fettklumpen sichtbar. Für grundlegende Experimente kann der Inhalt dieses "wässrige Phase" für nachfolgende Experimente wiederverwendet werden, obwohl wir festgestellt haben, dass dies im Wesentlichen verringert die Effizienz des Verfahrens. (Um dieses Problem zu mildern, können zusätzliche Phospholipid Hilfsstoffeauf die Recycling-Vorläufer Emulsion zugesetzt werden, wobei darauf zu achten das Molverhältnis von jeder Hilfsstoff zu erhalten.) Die Mittelschicht in jeder Spritze ist hell weiß und enthält konzentrierte LOMs. Es ist typischerweise eine scharfe Grenze zwischen der unteren und mittleren Schichten. Die mittlere Schicht jeder Spritze kann zur weiteren Verarbeitung, wie unten beschrieben, kombiniert werden. Die oberste Schicht enthält flauschige Schaum mit freien Gas aus LOMs während des Herstellungsprozesses gebrochen. Die oberen und unteren Schichten werden typischerweise weggeworfen. Während der Zentrifugation, ist es wichtig, sicherzustellen, dass jede Spritze durch einen Spritzenkappe dicht um die Extrusion der Emulsion während der Verarbeitung in die Zentrifuge verhindern abgedeckt. Zentrifugation bei höheren Geschwindigkeiten durch die Druckfestigkeit der Spritzen verwendeten wir beschränkt. Wenn benötigt, um eine scharfe Grenze zwischen den unteren und mittleren Schichten (in der Regel, wenn Emulsionen mit hohem Gasanteil wurden zentrifugiert) zu erreichen, kann Zentrifugation Zeitverlängert. Verwendung einer gasdichten, 3-Wege-Absperrhahn, um konzentrierte LOMs kombinieren ist nützlich, um die Luftverschmutzung zu verhindern. Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass LOM enthaltenden Spritzen stets verschlossen und gehalten, dass jede Umgebungsluft sofort ausgestoßen wird. Um die Luftverschmutzung während der Lagerung zu begrenzen, sollten Spritzen mit Luer-Lock nur Kappen verschlossen werden. Kunststoffspritzen sind bekannt, gasdurchlässig sein, so dass Glas-oder Metallspritzen bevorzugt für langfristige Lagerung.
Wie oben beschrieben, Emulsionen zur seriellen Konzentrationsschritt für 15 min ausgesetzt, zeigen typischerweise 70% Gasvolumen und bis zu 90% Gas durch Zentrifugation konzentriert werden. Selbst wenn 70 Vol.%-ige Emulsion in dem Ende gewünscht, haben wir gefunden Zentrifugation hilfreich, Phospholipide, die nicht in LOMs aus dem Konzentrat eingearbeitet sind, zu entfernen sein. Dies kann auch, indem Emulsionen über Nacht stehen gelassen, um Phasentrennung erreicht werden. Für die in vivo Experimente, verdünnen wir oft die konzentrierteLOMs mit Plasma-Lyte A, vorsichtig mischen, dann wieder zentrifugiert, um weitere ungenutzte Phospholipide und andere Verunreinigungen zu entfernen. Dieser Schritt kann mehrmals, um überschüssige Fett Schmutz zu entfernen wiederholt werden. Die Injektion von Phospholipiden, die nicht in LOMs eingebaut werden, ist aufgrund der zusätzlichen Last Lipid sie in der Einstellung einer hohen Infusionsrate verleihen unerwünscht.
Wir haben einige Fallstricke gefunden, um bei diesem Herstellungsverfahren zu vermeiden. Zunächst sollten Lipidträger frisch, bei -80 ° C gelagert und verwendet werden, wenn nicht abgelaufen ist. Die Vorläuferlösung sollte nicht für in vivo-Studien wiederverwendet werden, so erhaltenen Emulsionen sind widersprüchlich in ihrer Größenverteilung und maximale Gasanteil und können bakterielle Verunreinigungen, oxidierte Lipide oder Lipid-Klumpen enthalten. Zweitens, wenn die Emulsion "kritische Viskosität" während der Herstellung erreicht, wird es nicht mehr effektiv durch das System gepumpt werden und große Gaseinschlüsse innerhalb des HC zu bildenT. Die hohe Viskosität der Emulsion macht auch die Emulsion schwierig zu handhaben und stellt in Spritzen. Diese Probleme werden am besten durch Messen der Zunahme der Gasfraktion im HCT (durch Quantifizierung der Volumenanstieg der Gasanteil zunimmt) und Stoppen des seriellen Konzentrationsprozess, sobald die Ausgangsvolumen verdoppelt vermieden.
Eine wesentliche Einschränkung dieser Technik ist die anhaltende Notwendigkeit eines Zentrifugationsschritt, was unerwünscht ist, da sie das Potential für Luft und bakterieller Kontamination des Endprodukts, und verhindert, dass dies ein kontinuierlicher Prozess. In der Zukunft kann der serielle Konzentrationsschritt in einem einstufigen System zur kommerziellen Herstellung von Drogen durch die Verwendung eines hydraulischen Entlastungssystem, um die Notwendigkeit zu vermeiden gebündelt Zentrifugation modifiziert werden. Die in-line-Homogenisator und Labormischer mit 3/16 Edelstahl hergestellt und an Ort und Stelle sterilisiert werden. Die Einbeziehung von anderen Gasen in dem System th erweiterne Nützlichkeit dieser Technik weiter.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Finanzierung: US Army Medical Research & Materiel Command (USAMRMC) und von der Telemedizin & Advanced Technology Research Center verwaltet. Shunxi Ji trug die Änderung der Spritzen, wie hier beschrieben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 770365 | Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080) |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C75209 | |
| Plasma-Lyte A | VWR | 80089-818 | Alternatively can use NaCl |
| Glass collection vessel | Specialty Glass, Inc. | Custom | Contact: Pam Zurbrick - 281-595-2210 |
| Gas composition (oxygen) monitor | Precision Medical | PM5900L | |
| Sarns 8000 roller pump | Calicut Medical | 16407 | Part of a modular perfusion system |
| BIOtherm Heat Exchanger | Medtronic | ECMOtherm-II | |
| Verso laboratory in-line mixer | Silverson Machines, Inc | TH-IL-102-VERSO | Use multistage workheads and front-end extension with T piece |
| T-piece for Silverson Verso inlet port | Process Innovations | Custom | Contact: Brian Leavitt - 508-423-2266 |
| L5M-A laboratory mixer | Silverson Machines, Inc | NC0136483 | Use mesh emulsor screen (fine) |
| Rochester-Ochsner toothed forceps | Fisher Scientific | 13-812-18 | |
| 140 ml syringe | Kendall Healthcare Monoject | 8881114030 | Ensure there is a luer lock. |
| IX71 Inverted light microscope | Olympus | IX71 | |
| Retiga-2000R microscope camera | QImaging | RET-2000R-F-M-12 | |
| Accusizer 780A Autodilution | PSS-NICOMP Particle Sizing Systems | Out of production |
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