Summary
We beschrijven werkwijzen voor de bereiding van grote hoeveelheden lipide-gebaseerde zuurstof microbellen (LOM) ontworpen voor intraveneuze zuurstoflevering onder hoge afschuiving homogenisatie en seriële concentratie.
Abstract
Met gas gevulde microbolletjes zijn ontwikkeld als ultrageluid contrast en drug delivery agenten. Microbellen kan worden verkregen door verwerking oppervlakteactieve middels sonicatie, mechanisch roeren, microfluïdische apparaten of homogeniseren. Onlangs zijn lipide-gebaseerde zuurstof microbellen (LOM) is ontworpen om zuurstof intraveneus toedienen tijdens medische noodgevallen, omkeren levensbedreigende hypoxemie, en voorkomen van verdere orgaanschade, hartstilstand en de dood. We presenteren methoden voor opgeschaalde productie van zeer zuurstofrijk microbellen met een closed-loop high-shear homogenisator. Het proces kan 2 L van geconcentreerde LOM's (90% van het volume) te produceren in 90 minuten. Resulterende belletjes hebben een gemiddelde diameter van ca. 2 pm en een reologisch profiel overeenkomend met die van bloed wanneer verdund tot 60 volume%. Deze techniek produceert LOM's in hoge capaciteit en met een hoge zuurstof zuiverheid, wat suggereert dat deze techniek bruikbaar voor translationeel onderzoek labs kunnen zijn.
Introduction
Microbubbles samengesteld eiwit, polymeer en lipide schelpen zijn ontwikkeld als vectoren voor geneesmiddelafgifte, gentherapie en ultrageluid contrastmiddelen 1-5. Omdat deze therapeutische toepassingen vereisen intravasculaire microbellen doorzettingsvermogen, worden dergelijke microbellen vaak gevuld met inert, moleculair gewicht gassen hoog zoals perfluorkoolstoffen 6, die een lage oplosbaarheid hebben in het bloed en het stabiliseren van de bel 3,4.
Onlangs zijn lipide-gebaseerde zuurstof microbellen (LOM) is ontworpen om de therapeutische doses van zuurstof, die end-orgel zuurstof levering kunnen behouden en tijdens perioden van luchtwegobstructie of hypoxemie 7 voorkomen hemodynamische instabiliteit te leveren. Emulsies ontworpen voor intraveneuze gas levering vereisen verschillende design kenmerken dan die welke worden gebruikt voor ultrageluid contrastmiddelen of gerichte toediening van medicijnen. Ten eerste, omdat het lichaam verbruikt grote hoeveelheden zuurstofgas (~ 200 ml / min), LOM worden vervaardigd engeïnjecteerd op grote schaal. Dit vereist dat het productieproces efficiënt. Ten tweede moet het productieproces gesloten lus om stikstof besmetting door de blootstelling van LOM (dat moet worden gevuld met 100% zuurstof) vermijden omgevingslucht. Ten derde, omdat het doel van het LOM is intraveneuze levering van gas, het gas fractie van LOM gemaximaliseerd moet worden, erkenning van de voorwaarden door emulsie viscositeit 7 beperkingen. Ten slotte, zoals bij elk intraveneus injecteerbare, nauwkeurige controle over deeltjesgrootteverdeling is essentieel voor het vermijden van microvasculaire obstructie 8.
Er zijn een aantal gevestigde methoden voor microbellen vervaardigen. Sonicatie gebruikt hoge intensiteit laagfrequente ultrageluid toegepast op de lucht-vloeistof-interface van een emulsie die een oppervlakteactieve stof, zoals een amfipathische fosfolipide, in aanwezigheid van een gas kopruimte om microbellen 7,9 produceren omvat. Dit proces is regelbaar door het variëren ultrageluidsfrequentie, kracht en pulsduur en de verkregen grootteverdeling kan worden aangepast aan microbellen een specifieke grootteverdeling produceren, maar sonicatie zelden gebruikt bij de vervaardiging van klinisch gebruikte microbellen. Fusie is de intense mechanische agitatie van een oppervlakteactieve stof en gas in een gesloten systeem, dat ook moeilijk te schalen naar grote volumes 2 tegemoet. Droplet-gebaseerde microfluidics zorgt voor een precieze controle van microbellen grootteverdeling 10-13. Hoewel traditioneel moeilijk op te schalen, multi-channel, high-speed microfluidics beschreven die microbellen productie-efficiëntie te verhogen 13. Microbellen vervaardigd met behulp van een van deze methoden kan de post-productie verkleinen van de deeltjes processen, zoals centrifugaal fractionering 14,15 en microbellen beursgang 16,17 nodig.
Een andere beproefde methode voor het vervaardigen van zeer stabiele microbellen is shear homogenizatie 6, wat kan resulteren in een stabiliserend fosfolipide hexagonaal patroon op het oppervlak microbelletjes 18. Voortbouwend op dit concept, beschrijven we de oprichting van een in-line high shear homogenisator naar zelfassemblage LOM 19 te creëren. In dit proces, maakt gebruik van de homogenisator snel roterende messen in de nabijheid van dual fijnmazige emulgeerzeef schermen, het creëren van een hoge mechanische en hydraulische schaar voor de creatie van microbellen. Seriële concentratie van het lipide-emulsie via dit systeem levert een verhoogde concentratie gasfractie, die verder kan worden geconcentreerd door centrifugatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Systeem Set-up
Het systeem bestaat uit een holding en het concentreren van de tank (HCT), met een enkel podium mixer, een in-line high shear homogenisator, een roller pomp vloeistof tussen de HCT en de homogenisator bewegen, en een warmtewisselaar (figuur 1).
- Plaats een gesteriliseerde, brede opening 4 L glascollectie vat uitgerust met 2 voet-poorten en 3 poorten aan de zijkant onder de single stage mixer. Laat de mixer hoofd tot aan de monding van het schip en zorgen voor een gasdichte montage met behulp van rubber afdichtingen of tape (om te voorkomen dat de lucht verontreinigen het hoofd ruimte).
- Monteer een van de basis-poorten (Figuur 1, poort # 1) van het HCT met steriele 3/8 "(ID) transparante slang, ongeveer 10" lang, uitgerust met een 3-weg kraan aan het uiteinde voor het verzamelen van de geconcentreerde emulsie .
- Monteer het tweede honk poort (Figuur 1, poort # 2) met steriele 3/8 "(ID) slangen, approximately 36 'lengte. Voed deze slang door een roller pomp. Passen bij de inlaat van de high shear homogenisator met een T-stuk met twee poorten en sluit als volgt: Sluit de leidingen van de haven # 2, door de rol pomp en aan te sluiten op de zijpoort van het T-stuk. Maak de andere poort om een zuurstoftank met een low-flow zuurstofgas flowmeter.
- Verbind de uitlaatpoort van de hoge afschuiving homogenisator naar de inlaatpoort van een in-line warmtewisselaar gehandhaafd op 4 ° C. Verbind de uitlaatpoort van de warmtewisselaar aan de terugvoerpoort van de HCT (figuur 1, poort # 3), waardoor een gesloten lussysteem.
- Bevestig een zuurstoftank (via een flowmeter) aan de HCT (Figuur 1, poort # 4). Bevestig een gassamenstelling monitor die open sfeer aan de bovenste poort van de HCT (Figuur 1, poort # 5) is.
- Als steriliteit gewenst is, steriliseren van de glazen en metalen onderdelen voor elk gebruik door autoclaaf. Steriliseer de slang componenten en kunststof connectors met ethyleenoxide voor elk gebruik. Dit is vooral belangrijk wanneer het product wordt getest in vivo.
2. LOM Fabricage
- Breng 20 g GMP 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DSPC) en 10 g cholesterol in de basis van de HCT. Voeg 1 L van Plasma-Lyte A de HCT en hand roer gedurende 1 min, integreren zoveel lipide mogelijk in waterfase.
- Laat de enkele mengtrap in de waterige fase, zodat de gehele mengkop onder de waterfase. Zorg ervoor dat de bovenkant van de HCT is gasdicht (zie stap 1.1 hierboven) en dat er geen open poorten aan de zijkant. Zet het gas bron bevestigd aan de haven # 4 en wacht totdat het zuurstofpercentage van de HCT kopruimte bereikt> 95%. Bij 10 L / min (LPM), moet dit ~ 10 minuten.
- De eentraps mixer, meng de precursor emulsie gedurende 5 minuten bij 5000 rpm. Het resulterende mengsel moet bleke witte verschijnen en bevat geen zichtbare Lipid bosjes. Eenmaal gemengd, kunnen ongebruikte lipide-watermengsel worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 30 dagen voor eenmalig gebruik.
- Prime de gehele closed loop systeem met de voorloper emulsie door te draaien op de rol pomp op 1,3 LPM. Zodra het systeem helemaal klaar, laat u de pomp op op 1,3 LPM.
- Om de productie van de LOM beginnen, zet de in-lijn hoge afschuiving homogenisator tot 7.500 tpm. Onmiddellijk daarna Schakel zuurstoftoevoer naar het inlaatdeel van de homogenisator 0.5 LPM. Houd de eentraps mixer (in het HCT) op bij 3.500 tpm. LOM gevormd op het grensvlak van rotorbladen en emulgeerzeef schermen binnen de in-line homogenisator (figuur 2). Binnen enkele minuten, moet vloeistof zichtbaar meer viskeus. Een meer rigoureuze benadering is de viscositeit als functie van de tijd, die kan worden gedaan door het verwijderen van porties van Port 1 tijdens fabricage en analyseren met een viscometer.
Opmerking: Als zichtbare luchtbellen in de slang het verlaten van de mixer, zuurstofstromen naar de in-line homogenisator te hoog. Titreer beneden gasstroom tot de vloeistof is ondoorzichtig en bevat geen zichtbare gasbellen. - Voer het systeem gedurende 15 minuten, en zet de high shear homogenisator en de zuurstof inlaat aan. Blijf de eentraps mixer draaien in de HCT totdat de emulsie wordt verwijderd; Dit vermindert fasescheiding en houdt het product relatief uniforme binnen het HCT.
Opmerking: Het volume van de gasgevulde emulsie een ongeveer 2-3x verhogen tijdens de seriële concentratiefase. Als dit niet gebeurt, controleer dat zuurstof stroomt in de high shear homogenisator en dat lipide concentraties in de voorloper emulsie correct zijn. Rendement van de af lipide concentratie afneemt.
3. Collection, Concentratie, Assessment, en opslag van LOM
- Bevestig een steriele, gemodificeerd 140 ml luerlockspuit aan de kraan bevestigd aan thuishaven # 1 op het vat. Opstellen 100 ml vloeistof. Nauw cap spuit en herhaal tot alle vocht is verwijderd.
- Spuiten wijzigen door intrekking van 100 ml lucht in de spuit en dan zagen het overtollige zuiger en spuit materiaal boven de 140 ml markering. Vullen en lege spuiten met behulp van getande tang voor het opstellen van de plunjer. Deze wijziging maakt het mogelijk makkelijker centrifugeren.
- Centrifugeer spuiten met het afgedekte gedeelte omlaag gericht in een gekoelde (4 ° C) bucket centrifuge bij 225 xg gedurende 10 minuten.
- Drie lagen van materiaal verschijnen na centrifugeren. Verdrijf de onderste laag van overtollig bewolkt waterfase en gooi deze weg. De tweede laag is helder wit en bevat geconcentreerde LOM. Transfer geconcentreerd schuim om een gasondoorlaatbare spuit met een drie-weg kraan om verontreiniging van de omgeving wordt voorkomen. Gooi de laatste laag, die vrije zuurstof gas van gescheurde LOM's bevat.
- Schuim kwaliteit kan worden beoordeeld door het bereiken van ≥ 90% gas geconcentreerd schuim. Calculaten gasconcentratie als volgt:
Volume% gas = [(Foam gewicht / Foam volume) - 1] x 100- Als tweede kwaliteitscontrole maat microbellen door lichtverstrooiing te bepalen of deeltjesgrootte binnen het verwachte bereik. Opgemerkt zij dat een verandering in homogenisatietijd of formulering bellengrootte zouden kunnen wijzigen.
- Nauw cap het glas spuit met een luer-lock fitting. Geconcentreerde LOM kunnen met Plasma-Lyte A verdund worden op het moment van gebruik. Spuiten kunnen worden bewaard bij 22, 4, of -20 ° C; koudere temperaturen kunnen verbeterde houdbaarheid stabiliteit 7 bieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hoge afschuiving homogenisering kan de efficiënte (dwz binnen een middag) productie van voldoende LOM's voor een studie bij dieren en geen technische expertise nodig. Eenmaal bedreven, kan tot 2 L van geconcentreerde LOM's worden vervaardigd in 90 minuten.
Microbellen grootte en morfologie werd beoordeeld door lichtmicroscopie en door lichtverstrooiing. Wanneer een 10 ul monster van LOM werd gevisualiseerd werden bolvormige LOM genoteerd, evenals een relatieve schaarste aan lipide vormt (Figuur 3A). Dit geldt vooral wanneer GMP product wordt gebruikt. Wanneer hetzelfde monster van LOM's werd beoordeeld door lichtabsorptie, de gemiddelde diameter van de deeltjes was 2,624 ± 0,332 micrometer (SD). Meer dan 90% van de LOM waren <10 micrometer in doorsnede, en de bevolking was polydisperse (Figuur 3B).
Emulsie viscositeit was sterk afhankelijk van gas fractie (en dus, op microbellen concentratie). Twee ml portiesvan LOM's van verschillende concentraties gas werden bestudeerd met behulp van een steady state stroom vegen met behulp van een 40 mm parallel plaatgeometrie als stress werd gevarieerd van 0,1 tot 10.000 μN · m.. Alle LOM gas fracties vertonen shear-verdunnende gedrag, en dit fenomeen is het meest uitgesproken bij hogere gas fracties. LOM met 60 volume% gas vertoonden een reologische profiel vergelijkbaar met bloed (Figuur 4A).
Tot slot, het zuurstofgehalte (inclusief gas fractie en fractionele concentratie van zuurstof) van LOM werd getest door wisselende hoeveelheden zuurstof bevat binnen 60 volume% LOM om monsters van desaturated menselijk bloed met een bekende tekort zuurstof toe te voegen. Zoals eerder beschreven, kan het zuurstofgehalte van LOM berekend uit de verhoging van oxyhemoglobine concentraties 7. De relatie tussen de hoeveelheid zuurstof toegevoegd binnen LOM en volumetrische toename zuurstofgehalte van het bloed was 1,053 ± 0,03025 (SD) (95% CI = ,9865-1,120) (Fig.ure 4B), wat suggereert dat de geteste LOM bevatte bijna 100% zuurstof, vertoonde enkele opgesloten gasbellen (die niet efficiënt zuurstof overdragen aan bloed, maar snel zweven), en effectief over te dragen hun hele zuurstof laadvermogen om menselijk bloed in vitro.
Figuur 1. Manufacturing opstart schema. LOM's worden geproduceerd met behulp van een in-line, high-shear homogenisator in een gesloten systeem. LOM's worden gehouden, binnen het bedrijf en het concentreren van de tank (HCT) onder constante menging. De emulsie wordt bewogen via het systeem door een rollerpomp. Warmte die door de homogenisatie wordt verwijderd met behulp van een warmtewisselaar. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. </ A>
Figuur 2. Zelf-assemblage van LOM binnen een fijnmazig emulgeerzeef. A) een snel roterende mes passeert een fijnmazig emulgeerzeef, waardoor een hevelwerking die trekt de waterfase en de gasfase. Tiny zuurstof belletjes worden gevormd door afschuiving, en worden al snel omsingeld door de hydrofobe lipide staarten van amfifatische fosfolipiden, het creëren van een zelfassemblerende gasgevulde bubble (B).
Figuur 3. Karakterisering van LOM. A) Een vertegenwoordiger microfoto van sferische LOM's vertonen een polydispers grootteverdeling. Schaal bar =10 urn. B) grootteverdeling van LOM's zoals beoordeeld door lichtverstrooiing. Data = bedoel, error = SEM.
Figuur 4. Eigenschappen van gecentrifugeerd en geconcentreerd LOM. A) De reologische profiel van een LOM emulsie op 60, 70 en 90 volume% gas. Verdunning van geconcentreerd schuim 60 volume% gas levert een reologisch profiel vergelijkbaar met humaan bloed (hematocriet 40%). Data = bedoel, error = SEM. B) De relatie tussen zuurstofgehalte van LOM toegevoegd aan menselijk bloed en de gemeten toename van het zuurstofgehalte van het bloed. Data = bedoel, error = SEM, lijn = lineaire regressie met 95% CI van de best passende rechte lijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De belangrijkste stappen voor het creëren van geconcentreerde, zeer zuurstofrijk LOM's omvatten: 1) ervoor zorgen dat de bovenruimte in het HCT volledig blijft zuurstofrijk; 2) ervoor te zorgen dat de zuiverheid van de lipide hulpstoffen is optimaal (inclusief opslagcondities en het gebruik van GMP-producten); 3) de garantie dat de poedervormige lipiden mengen volledig met de waterige fase voorafgaand aan het systeem priming; en 4) met veel aandacht voor de stijging van de gas-fractie binnen het HCT om ervoor te zorgen dat het volume fractie van gas niet hoger is dan 70%.
De methode die we hier beschrijven maakt gebruik van high shear homogenisering holle microbellen creëren. Amfipathische lipiden zijn opgehangen met de waterige fase die wordt gebruikt om de lipiden te voeren in de in-line homogenisator. GMP kwaliteit lipiden worden gebruikt voor in vivo studies, en algemeen de voorkeur omdat zij minder lipide aggregaten en onzuiverheden. Lipiden zijn ook onderworpen aan de vetverbranding (vooral bij opslagbinnen een geoxygeneerde vloeistof) en bacteriële besmetting. LOM worden gevormd wanneer de hydrofobe staarten regelen rond kleine zuurstofgas microbellen gecreëerd binnen de in-line homogenisatie (figuur 2). Homogeniseren LOM bij 7.500 tpm onderwerpt de microbellen aanvullende mechanische spanningen zoals ze worden gemalen tussen de uiteinden van de rotorbladen en de binnenwand van de stator. LOM ook ondergaan hydraulische schaar als ze gedwongen worden op hoge snelheid door de ultra-fijn gaas emulgeerzeef, deeltjesgrootte verder verlaagt. Dwarskrachten warmte binnen de in-line homogenisator en lokaal op de eentraps mixer; een in-line warmtewisselaar voor de terugkeer naar de HCT is nodig om deze warmte af te voeren. Afwezigheid van een warmtewisselaar temperaturen boven de fase-overgangstemperatuur van de lipide (55 ° C gedurende DSPC), waarbij de vloeibaarheid van de lipide en leidt tot productverlies verhoogt verhogen. Oprichting van de emulsie in een gesloten, in-line apparaat zorgt ervoor dat pure zuurstofgehalten wordt in het LOM kern opgenomen door het voorkomen van luchtverontreiniging. Verder worden LOM voortdurende blootstelling aan de gasvormige kopruimte van de HCT. Het is daarom noodzakelijk dat de zuigwerking door het lab menger in de HCT een omkering van de luchtstroom niet leidt uit de atmosfeer in de HCT (via de gassamenstelling monitor die open atmosfeer om onder druk van de HCT voorkomen) . Het zuurstofgas stroomsnelheden beschreven moet voldoende zijn om dit verschijnsel te voorkomen.
Recycling van de emulsie door de in-line homogenisator gedurende de seriële concentratie fase creëert extra LOM van "ongebruikte" fosfolipiden nog in de waterfase, en ook onderwerpen intact LOM herhaaldelijk scheren, welke deeltjesgrootte verder kan afnemen. Deeltjesgrootte en gasconcentratie kan daarom worden aangepast door het aanpassen mixer snelheden, emulgeerzeef schermen, maaswijdte en looptijd (dwz duur van de seriële concentration stap). Mechanisch roeren produceert een polydispers grootteverdeling. De brede grootteverdeling zorgt voor strakkere verpakking van microbellen, waardoor de maximale ingekapselde gasfractie steeds meer in een bepaald volume van schuim. Het veranderen formulering chemie door opname viscositeit verhogende middelen kunnen worden gebruikt om een meer homogene grootteverdeling maken indien gewenst. We hebben ontdekt dat een looptijd van 15 min is het meest ideaal; als microbelletjes concentratie toeneemt, de emulsie steeds viskeus. Zodra een kritische viscositeit bereikt, niet meer effectief gepompt met een rolpomp. Dit veroorzaakt vrij gas door de homogenisator te passeren zonder te worden opgenomen in LOM's en kan worden gezien in de transparante slang. In dit stadium, we meestal kiezen de seriële concentratiestap stoppen, maar indien gewenst, de gasstroomsnelheid in de in-line homogenisator kan worden verminderd en de rolpomp debiet kan worden verhoogd tot hogere gas fracties creëren. Echter, zeer viskeuzes emulsies vereisen meer kracht te trekken in spuiten voor het centrifugeren stap en kan de opbrengst van dit proces verminderen.
De centrifugatiestap werd vergemakkelijkt door het modificeren 140 ml spuiten op de plunjer en de basis van de injectiespuit afkappen, zodat spuiten vormen een gelijkmatige cilinder. Dit vergemakkelijkt aanzienlijk het laden en lossen van injectiespuiten in de centrifuge. Na centrifugatie, spuiten bevatten meestal drie lagen. De dichtste laag (in de buurt van de spuit wanneer spuiten worden geladen neus-down) bevat ongebruikte fosfolipiden en het grootste deel van de waterfase. In sommige gevallen kan troebel 'puin' worden gezien binnen de spuit die doorgaans bevat lipide bosjes. Voor basis experimenten, kan de inhoud van deze 'waterfase' opnieuw worden gebruikt voor verdere experimenten, maar we hebben gevonden dat de doeltreffendheid van de werkwijze aanzienlijk vermindert. (Om dit probleem te verzachten, kan extra fosfolipide hulpstoffenworden toegevoegd aan het gerecycleerde voorloper emulsie, zorg ervoor dat de molverhouding van elke hulpstof te behouden.) De middelste laag in elke spuit is helder wit en bevat geconcentreerde LOM. Er is meestal een scherpe scheidslijn tussen de onderste en middelste lagen. De middelste laag van elke spuit gecombineerd worden voor verdere verwerking zoals hieronder beschreven. De bovenste laag bevat zachte schuim met vrije gas uit LOM gebroken gedurende het productieproces. De bovenste en onderste lagen zijn meestal weggegooid. Tijdens centrifugeren, is het belangrijk dat elke spuit onder een strakke dopje om de extrusie van de emulsie in de centrifuge te voorkomen tijdens de verwerking. Centrifugeren bij hogere snelheden werd beperkt door de breeksterkte van de spuiten we gebruikten. Indien nodig om een scherpe scheidslijn tussen de onderste en middelste lagen (meestal als emulsies met een hoog gas fractie werden gecentrifugeerd) te bereiken, kan centrifugeren tijdverlengd. Gebruik van een gasdichte, 3-weg kraan om geconcentreerde LOM combineren is handig om luchtvervuiling te voorkomen. Het is ook belangrijk dat LOM-bevattende spuiten altijd afgesloten blijven en dat lucht wordt direct verdreven. Om luchtvervuiling tijdens de opslag te beperken, moeten spuiten worden afgedicht met alleen luer-lock caps. Plastic injectiespuiten zijn bekend gasdoorlatende, dus glas of metaal spuiten de voorkeur voor langdurige opslag.
Zoals hierboven beschreven, emulsies blootgesteld aan de seriële concentratiestap gedurende 15 min vertonen typisch 70% gas vol en kan tot 90% gas wordt geconcentreerd door centrifugatie. Zelfs als 70 volume% emulsie gewenst uiteindelijk hebben wij gevonden centrifugatie om behulpzaam te fosfolipiden die niet in LOM uit het concentraat worden opgenomen te verwijderen. Dit kan ook worden bereikt doordat emulsie overnacht staan fasescheiding. Voor in vivo experimenten hebben we vaak verdunnen geconcentreerdeLOM met Plasma-Lyte A, meng voorzichtig, centrifugeer opnieuw om extra ongebruikte fosfolipiden en ander vuil te verwijderen. Deze stap kan verschillende keren herhaald worden om overtollig vet vuil te verwijderen. De injectie van fosfolipiden die niet in LOM opgenomen is ongewenst vanwege de extra lipide belasting zij geven in de setting van een hoge infusiesnelheid.
We hebben een aantal veel voorkomende valkuilen gevonden om te voorkomen dat in dit productieproces. Ten eerste moet lipide excipiënten vers, bewaard bij -80 ° C en gebruikt met verstreken overeenkomst. De voorloper oplossing mag niet opnieuw worden gebruikt voor in vivo studies, zoals deze voortvloeit emulsies zijn inconsistent in hun grootteverdeling en maximale gas-fractie, en kunnen bacteriële verontreinigingen, geoxideerde lipiden, of lipide klonten bevatten. Ten tweede, wanneer de emulsie kritische viscositeit "tijdens de productie bereikt, niet langer effectief door het systeem gepompt en grote gasbellen worden binnen de HC vormenT. De hoge emulsie viscositeit maakt ook de emulsie moeilijk te hanteren en stelt in spuiten. Deze problemen worden best vermeden door het versterkte gasfraktie binnen de HCT (door het kwantificeren van de toename van het volume gas breuk toeneemt) en stoppen van de seriële concentratieproces zodra het startvolume verdubbelt.
Een belangrijke beperking van deze techniek is de aanhoudende behoefte aan een centrifugatie stap, hetgeen ongewenst omdat daarmee het potentieel voor lucht en bacteriële besmetting van het eindproduct, en voorkomt dit dat het een continu proces. In de toekomst kan de seriële concentratiestap worden gewijzigd in een enkele stap voor commerciële drugvervaardiging met behulp van een hydraulisch afvoersysteem de noodzaak gedoseerd centrifugeren voorkomen. De in-line homogenisatieapparaat en laboratorium mixers kunnen worden vervaardigd met 3/16 roestvrij staal en gesteriliseerd zijn plaats. De opname van andere gassen in het systeem kan e verbredene nut van deze techniek verder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Financiering: US Army Medical Research & Materieel Command (USAMRMC) en beheerd door de Telemedicine & Advanced Technology Research Center. Shunxi Ji droeg de wijziging van de injectiespuiten zoals hier beschreven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 770365 | Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080) |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C75209 | |
| Plasma-Lyte A | VWR | 80089-818 | Alternatively can use NaCl |
| Glass collection vessel | Specialty Glass, Inc. | Custom | Contact: Pam Zurbrick - 281-595-2210 |
| Gas composition (oxygen) monitor | Precision Medical | PM5900L | |
| Sarns 8000 roller pump | Calicut Medical | 16407 | Part of a modular perfusion system |
| BIOtherm Heat Exchanger | Medtronic | ECMOtherm-II | |
| Verso laboratory in-line mixer | Silverson Machines, Inc | TH-IL-102-VERSO | Use multistage workheads and front-end extension with T piece |
| T-piece for Silverson Verso inlet port | Process Innovations | Custom | Contact: Brian Leavitt - 508-423-2266 |
| L5M-A laboratory mixer | Silverson Machines, Inc | NC0136483 | Use mesh emulsor screen (fine) |
| Rochester-Ochsner toothed forceps | Fisher Scientific | 13-812-18 | |
| 140 ml syringe | Kendall Healthcare Monoject | 8881114030 | Ensure there is a luer lock. |
| IX71 Inverted light microscope | Olympus | IX71 | |
| Retiga-2000R microscope camera | QImaging | RET-2000R-F-M-12 | |
| Accusizer 780A Autodilution | PSS-NICOMP Particle Sizing Systems | Out of production |
References
- Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5 (11), 2161-2170 (2009).
- Ren, J. L., et al. A Novel Ultrasound Microbubble Carrying Gene and Tat Peptide: Preparation and Characterization. Academic Radiology. 16 (12), 1457-1465 (2009).
- Tinkov, S., et al. Microbubbles as Ultrasound Triggered Drug Carriers. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (6), 1935-1961 (2009).
- Hernot, S., Klibanov, A. L. Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (10), 1153-1166 (2008).
- Lanza, G. M., et al. A novel site-targeted ultrasonic contrast agent with broad biomedical application. Circulation. 94 (12), 3334-3340 (1996).
- Cavalli, R., et al. Preparation and characterization of dextran nanobubbles for oxygen delivery. International Journal of Pharmaceutics. 381 (2), 160-165 (2009).
- Kheir, J. N., et al. Oxygen Gas-Filled Microparticles Provide Intravenous Oxygen Delivery. Science Translational Medicine. 4 (140), (2012).
- Lindner, J. R., et al. Microvascular rheology of definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration. Journal of the American Society of Echocardiography. 15 (5), 396-403 (2002).
- Zhao, Y. Z., et al. Preparation, characterization and in vivo observation of phospholipid-based gas-filled microbubbles containing hirudin. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (9), 1237-1243 (2005).
- Seo, M., et al. Microfluidic Assembly of Monodisperse, Nanoparticle-Incorporated Perfluorocarbon Microbubbles for Medical Imaging and Therapy. Langmuir. 26 (17), 13855-13860 (2010).
- Wan, J. D., Stone, H. A. Coated Gas Bubbles for the Continuous Synthesis of Hollow Inorganic Particles. Langmuir. 28 (1), 37-41 (2012).
- Duncanson, W. J., et al. Monodisperse Gas-Filled Microparticles from Reactions in Double Emulsions. Langmuir. 28 (17), 6742-6745 (2012).
- Kendall, M. R., et al. Scaled-Up Production of Monodisperse, Dual Layer Microbubbles Using Multi-Array Microfluidic Module for Medical Imaging and Drug Delivery. Bubble Science Engineering and Technology. 4 (1), 12-20 (2012).
- Szijjarto, C., et al. Effects of Perfluorocarbon Gases on the Size and Stability Characteristics of Phospholipid-Coated Microbubbles: Osmotic Effect versus Interfacial Film Stabilization. Langmuir. 28 (2), 1182-1189 (2012).
- Rossi, S., Waton, G., Krafft, M. P. Phospholipid-Coated Gas Bubble Engineering: Key Parameters for Size and Stability Control, as Determined by an Acoustical Method. Langmuir. 26 (3), 1649-1655 (2010).
- Swanson, E. J., et al. Phospholipid-Stabilized Microbubble Foam for Injectable Oxygen Delivery. Langmuir. 26 (20), 15726-15729 (2010).
- Kvåle, S., et al. Size fractionation of gas-filled microspheres by flotation. Separations Technology. 6 (4), 219-226 (1996).
- Dressaire, E., et al. Interfacial polygonal nanopatterning of stable microbubbles. Science. 320 (5880), 1198-1201 (2008).
- Kheir, J. N., et al. Bulk Manufacture of Concentrated Oxygen Gas-Filled Microparticles for Intravenous Oxygen Delivery. Advanced Healthcare Materials. , (2013).
