Summary
Biz, yüksek kesmeli homojenizasyon ve seri konsantrasyonu kullanılarak gerçekleştirilen damar içi oksijen verilmesi için tasarlanmış lipid tabanlı oksijen mikro-kabarcıkların (LOMs) büyük hacimlerde imalatı için yöntemler tarif eder.
Abstract
Gaz-doldurulmuş mikro-kabarcıklar ultrason kontrast ve ilaç taşıyıcı maddeler olarak geliştirilmiştir. Mikro-sonikasyon, mekanik ajitasyon, mikroakışkan cihazları ya da homojenizasyon ile yüzey aktif maddelerin işlemden ile üretilebilir. Son zamanlarda, lipid bazlı oksijen mikrokabarcıklar (LOMs) yaşamı tehdit eden hipoksemi tersine, tıbbi acil durumlarda damardan oksijen sağlamak için tasarlanmıştır ve daha sonraki organ yaralanması, kardiyak arrest ve ölüm önlenmesi olmuştur. Bir kapalı döngü yüksek kesmeli homojenizörü kullanılarak yüksek oksijenli mikro-ölçekli üretimi için yöntemler kadar mevcut. Bu süreç, 90 dakika içinde konsantre LOMs 2 L (hacim olarak% 90) üretebilir. Elde edilen kabarcıklar kan hacminin% 60 olduğu için seyreltildiklerinde tutarlı ~ 2 um bir ortalama çapa, ve reolojik bir profiline sahiptir. Bu teknik, bu teknik, çeviri araştırma laboratuarları için yararlı olabileceğini düşündüren, yüksek kapasiteli ve yüksek oksijen saflığı ile LOMs üretir.
Introduction
Protein, polimer ve lipid kabukları oluşan mikro-ilaç verilmesi için vektörler, gen tedavisi ve ultrason kontrast ajanları olarak 1-5 geliştirilmiştir. Bu terapötik kullanımları damar içi mikro-kabarcık ısrar gerektirir, bu yüzden, mikro-kabarcıklar genellikle bu tür kanda düşük bir çözünürlüğe sahiptir ve kabarcık 3,4 stabilize perflorokarbon 6, atıl, yüksek molekül ağırlıklı gazı ile doldurulur.
Son zamanlarda, lipid bazlı oksijen mikrokabarcıklar (LOMs) uç organ oksijen iletimini korumak ve hava yolu tıkanıklığı veya hipoksemi 7 dönemlerde hemodinamik kararsızlığı önlemek olabilir oksijenin terapötik dozda, sunmak için tasarlanmıştır. Damar içine gaz verilmesi için tasarlanmış emülsiyonlar ultrason kontrast ajanı ya da hedeflenen ilaç sağlama için kullanılanlardan farklı tasarım özellikleri gerektirir. Vücudun oksijen gazı (~ 200 ml / dakika) ile büyük hacimli tüketir, çünkü İlk olarak, LOMs üretilen ve edilmelidirbüyük ölçüde enjekte edilir. Bu, üretim sürecinin etkin olması gerekir. İkinci olarak, imalat işleminin çevre havasına (% 100 oksijen ile doldurulmalıdır) LOMs maruz kalma yoluyla azot kirlenmesini önlemek amacıyla kapalı döngü olmalıdır. LOMs amacı intravenöz gaz dağıtım çünkü Üçüncüsü, LOMs gaz fraksiyonu emülsiyon viskozitesi 7 sınırlamaları kabul, maksimize edilmelidir. Son olarak, herhangi bir damar içine enjekte edilebilen olduğu gibi, tanecik boyutu dağılımı üzerinde kesin kontrol mikrovasküler tıkanıklığı 8 kaçınmak için gereklidir.
Mikro-kabarcık üretimi için birkaç kurulan yöntem vardır. Sonikasyon yüksek yoğunluk kullanır, düşük frekanslı ultrason 7,9 mikro-kabarcıkları üretmek için gaz kafa mevcudiyetinde böyle bir amfipatik fosfolipid gibi bir yüzey aktif madde, emülsiyon içeren bir hava-sıvı arayüzü uygulanır. Bu işlem son derece değiştirilerek kontrol edilebilirsonikasyon nadiren klinik olarak kullanılan mikro-kabarcıkların imalatında kullanılan da ses frekans, güç ve darbe süresi ve elde edilen boyutu dağılımı, özel bir boyut dağılımının mikro-kabarcıkları üretmek için uygun olabilir. Amalgamation geniş hacimli 2 barındıracak kadar büyütmek de zor olan kapalı bir sistem, bir yüzey aktif madde ve gazın yoğun bir mekanik ajitasyon olduğunu. Damlacık tabanlı ve arayüz mikro-kabarcık boyut dağılımı 10-13 arasında hassas bir kontrol sağlar. Geleneksel olarak zor büyütmek rağmen, çok kanallı, yüksek hızlı Mikroakiskan mikro üretim verimliliğini 13 artış hangi tarif edilmiştir. Bu yöntemlerden herhangi birini kullanarak imal Mikrobaloncuklar gibi merkezkaç fraksiyonasyonu 14,15 ve mikro yüzdürme 16,17 gibi post-üretim boyutu azaltma süreçleri gerektirebilir.
Son derece kararlı mikro-kabarcıkların üretimi için bir başka yöntem, kesme kurulmuş olan homogenizmikro-kabarcık yüzeyinde 18 üzerinde stabilize edici bir altıgen fosfolipid desende olmasına yol açabilir ation 6,. Bu kavram üzerine bina, öz-montaj LOMs 19 oluşturmak için bir in-line yüksek kesme homojenleştirici birleşmesini açıklamak. Bu süreçte, homojenleştirici hızlı mikro-kabarcıkların oluşturulması için yüksek mekanik ve hidrolik kesme oluşturma, çift ince gözenekli emulsor ekranlara yakın bıçaklar döner kullanmaktadır. Bu sistem sayesinde lipid emülsiyonun seri konsantrasyonu daha da santrifüjleme ile konsantre edilebilir giderek daha konsantre hale gaz fraksiyonu, elde edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Sistem Set-up
Sistem, tek bir kademeli karıştırıcı, bir in-line yüksek kesme homojenizatör, HCT ve homojenleştirici arasında sıvının hareket ettirilmesi için bir silindir pompa ve bir ısı-eşanjörü (Şekil 1) ile donatılmış, bir tutma tankı ve konsantre (HCT) oluşur.
- Tek kademeli mikseri altında 2 temel limanlarından ve 3 yan portları ile donatılmış bir steril, geniş ağızlı 4 L cam toplama kabı yerleştirin. Kabın ağzına karıştırıcı kafa indirin ve (kafa alanını karışmasını ortam havasının önlemek için), kauçuk contalar veya bant kullanılarak çok gaz geçirmez bir montaj sağlar.
- Steril 3/8 ile HCT (Şekil 1, bağlantı noktası # 1) temel limanlarından birini Fit "(ID) açık boru, yaklaşık 10" uzun, konsantre emülsiyon toplanması için ucunda 3-yollu ile donatılmış .
- İkinci baz noktasını steril 3/8 ile (Şekil 1, bağlantı noktası # 2) "(ID) boru, approximatel Fity uzunluğunda 36 ". Bir silindir pompa ile bu boru besleyin. İki girişi olan bir T-parçası ile yüksek kesme homojenleştirici girişini Fit ve aşağıdaki gibi bağlayın: roller pompa aracılığıyla, port # 2 boru bağlamak ve T-parçasının yan portuna bağlayın. Düşük akımlı oksijen gaz debimetre ile bir oksijen tankına diğer liman takın.
- 4 ° C'de muhafaza edilen bir in-line ısı değiştiricinin giriş portuna yüksek kesme homojenleştirici çıkış portunu Kapalı bir döngü sistemi oluşturmak, HCT dönüş bağlantı noktası (Şekil 1, bağlantı noktası # 3), ısı değiştiricinin çıkış portunu.
- HCT (a debimetre ile) bir oksijen tankı takın (Şekil 1, port # 4). HCT üst noktasına (Şekil 1, port # 5) atmosfere açık olan bir gaz bileşimi monitör takın.
- Kısırlık isteniyorsa, otoklav her kullanımdan önce, cam ve metal parçaları sterilize edin. Tüp bileşenleri ve plastik co sterilizeHer kullanımdan önce etilen oksit ile nnectors. Ürün in vivo olarak test edilecek ise, bu özellikle önemlidir.
2.. LOM imalatı
- GMP 1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DSPC) ve HCT tabanında 10 g kolesterol, 20 g yerleştirin. Sulu faz içine mümkün olduğu kadar lipid entegre, 1 dakika için karıştırın ve el HCT Plazma-Lyte A 1 L ekleyin.
- Tüm kafa karıştırıcı, sulu faz ile kaplıdır sağlanması, sulu faza tek kademeli karıştırıcı indirin. HCT üst sıkı bir gazdır (yukarıdaki Adım 1.1) ve hiçbir tarafı açık bağlantı noktaları vardır emin olun. Port # 4 bağlı gaz kaynağı açın ve HCT tepe boşluğu oksijen fraksiyonu>% 95 ulaşana kadar bekleyin. 10 L / dk (LPM) de, bu ~ 10 dakika almalı.
- Tek aşamalı karıştırıcı kullanarak, 5000 rpm'de 5 dakika için ön-emülsiyonu karıştırılır. Elde edilen karışım, soluk beyaz görünür ve görünür bir Lipi içermelidird kümeleri. Bir kez karıştırıldı, kullanılmayan lipid-su karışımı, tek bir kullanımdan önce, 30 güne kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
- Prime 1.3 LPM'de de roller pompa açarak öncü emülsiyon ile tüm kapalı döngü sistemi. Sistem dolana kez, 1.3 LPM'de de pompayı tutun.
- LOMs imalatını başlamak için, 7,500 rpm-line yüksek kesme homojenleştiricisi açın. Bundan hemen sonra, 0.5 LPM de homojenleştirici giriş kısmına oksijen akışını açın. 3,500 rpm üzerindeki (HCT olarak) tek aşamalı karıştırıcı tutun. LOMs in-line homojenizerden (Şekil 2) içinde rotor bıçakları ve emulsor ekranlarının arayüzünde oluşturulmaktadır. Birkaç dakika içinde, gözle görülür bir şekilde daha zor akışlı akışkan olmalıdır. Daha ayrıntılı bir yaklaşım, imalat sırasında Port1'inden numuneler çıkarılması ve bir viskometre ile analiz yapılabilir, zamanın bir fonksiyonu olarak viskozite belirlemektir.
Not: görünür hava kabarcığı karıştırıcı, oksijen çıkan boru içinde mevcut isein-line homojenizerden akışının çok yüksektir. Sıvı opak ve görünür hiçbir gaz baloncukları kadar gaz akışını aşağı titre. - 15 dakika boyunca sistem çalıştırın ve sonra buna yüksek kesme Homojenizatör ve oksijen giriş kapatın. Emülsiyon kaldırılır kadar HCT olarak tek aşamalı karıştırıcı çalışmaya devam eder; Bu faz ayrılmasını azaltır ve HCT içinde nispeten homojen bir ürünü tutar.
Not: gazla doldurulmuş emülsiyon hacmi seri konsantrasyonu aşamasında, yaklaşık 2-3x artırmalıdır. Bu sağlamak için kontrol etmiyorsa oksijen yüksek kesme homojenizatör içine akar ve ön emülsiyon bu lipid konsantrasyonları doğru. Lipid konsantrasyonu azaldıkça üretim verimliliği azaltır.
3.. Koleksiyonu, Konsantrasyon, Değerlendirme ve LOMs Depolama
- Steril takın, toplama kabına baz port # 1 bağlı musluğa 140 ml Luer-lock şırınga değiştirilmiş. 10 çizinSıvının 0 ml. Tüm akışkan kaldırıldı kadar sıkıca şırınga ve tekrar kap.
- Şırıngaya havanın çekilmesi, 100 ml ve daha sonra 140 ml işaretinin üzerinde fazla pistonu ve şırınga malzemeyi testere ile şırınga değiştirin. Dolgu ve pistonu yukarı çekmek için dişli forseps kullanarak boş şırınga. Bu modifikasyon, daha kolay santrifüj sağlar.
- 10 dakika boyunca 225 x g 'de bir buzdolabında (4 ° C) santrifüjü kova aşağıya doğru dönük ucu ile kapaklı santrifüj şırınga.
- Üç kat malzeme santrifüj sonra görünür. Fazla kapalı sulu fazın alt tabaka Expel ve atın. İkinci katman parlak beyaz ve konsantre edilerek LOMs içerir. Gaz, çevre kirliliğini önlemek için üç yollu valf kullanılarak bir gaz geçirmeyen şırınga konsantre edilerek bir köpük aktarın. Kopan LOMs gelen serbest oksijen gazı içeren son kat, atın.
- Köpük kalite konsantre köpük ≥% 90 gaz ulaşarak değerlendirilebilir. Calculaşağıdaki gibi gaz konsantrasyonu yedik:
Hacmi% gaz = [(Köpük ağırlık / hacim Köpük) - 1] x 100- Parçacık boyutu beklenen aralık içinde ise bir ikinci kalite kontrol olarak, ışık kararması ile boyut mikrokabarcıklar belirlemek. Bu, homojenleştirme zaman ya da formülasyon içinde bir değişiklik baloncuk büyüklüğünü değiştirebilir unutulmamalıdır.
- Sıkıca bir luer-lock montaj ile cam şırınga kap. Konsantre LOMs kullanım sırasında plazma Lyte A ile seyreltilebilir. Şırınga, 22, 4 ° C'de saklanabilir, ya da -20 ° C; soğuk sıcaklıklar gelişmiş raf ömrü stabilitesi 7 sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yüksek kesme homojenizasyon bir hayvan çalışma için yeterli LOMs etkin (bir öğleden sonra içinde yani) üretimini sağlar ve teknik uzmanlık gerektirmez. Bir kez yeterli konsantre LOMs en fazla 2 L 90 dakika içinde imal edilebilir.
Mikro-kabarcık boyut ve şekil ve ışık mikroskopisi ile ışık kararması ile değerlendirildi. LOMs bir 10 ul örnek gözlendi zaman, küresel LOMs belirtildiği gibi, hem de lipid enkaz göreli yetersizliği (Şekil 3A) edilmiştir. GMP ürün kullanıldığında, bu özellikle doğrudur. LOMs aynı örnek ışık kararması ile değerlendirildi zaman, ortalama parçacık çapı 2,624 ± 0,332 um (SD) idi. LOMs içinde% 90'dan daha büyük çapı <10 um olan ve nüfusun polidispers (Şekil 3B) idi.
Emülsiyon viskozitesi (mikro-kabarcık konsantrasyonuna ve bu nedenle) ağır gaz fraksiyonuna bağlı olmuştur. İki ml alikotlarıDeğişken gaz konsantrasyonlarının LOMs stres 0.1 10.000 μN için değişik gibi m · 40 mm paralel levha geometrisini kullanarak bir sabit akış durumu süpürme kullanılarak çalışıldı. Tüm LOM gaz fraksiyonlar kesmeyle incelme davranışı sergiler ve bu olay çok daha yüksek gaz fraksiyonlarda açıklandı. 60 hacim% ihtiva eden gazın LOMs kan işleme benzer bir reolojik profili (Şekil 4A) sergiledi.
Son olarak, LOMs of (gaz fraksiyonu ve oksijen kısmi konsantrasyon dahil) oksijen içeriği, bilinen bir oksijen eksikliği ile desatüre edilmiş insan kanı alikotları 60 hacim% LOMs içinde bulunan oksijen değişen hacmi eklenerek test edilmiştir. Daha önce tarif edildiği gibi, LOMs oksijen içeriği oksihemoglobin konsantrasyonu 7 artışından hesaplanır. LOMs içinde ilave oksijen hacmi ve kanın oksijen içeriği hacim artışı arasındaki ilişki 1,053 ± 0,03025 (SD) (95% CI = 0,9865-1,120) (Şekil idiure 4B), test LOMs yaklaşık% 100 oksijen ihtiva ettiğini düşündüren, (verimli kan oksijen transferi, ama hızla akıp yok olan) birkaç sıkışıp gaz cepleri sergiledi ve etkili bir in vitro insan kan onların bütün oksijen yükü aktarmak.
Şekil 1.. Kurulum şemasını İmalat. LOMs bir kapalı devre sisteminde sıralı, yüksek kesmeli bir homojenleştirici kullanılarak üretilir. LOMs bir tutma içinde tutulur ve sabit karıştırma altında tankı (HCT) konsantre edilir. Emülsiyon, bir merdaneli pompa kullanılarak sistem üzerinden taşınır. Homojenizatör tarafından üretilen ısı, bir ısı değiştirici kullanılarak kaldırılır. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. </ A>
Bir ince gözenekli emulsor ekran içinde LOMs Şekil 2.. Self-montaj. A) hızla dönen bıçak, sulu ve gaz fazlarında çeken bir sifon etkisi yaratarak, bir ince gözenekli emulsor ekranına geçer. Küçük oksijen kabarcıkları makaslama oluşturduğu ve hızlı bir şekilde kendi kendini montaj gaz ile doldurulmuş bir balon (B) oluşturma, amfipatik fosfolipidlerin hidrofobik lipid kuyrukları ile çevrilidir.
LOMs. A) çok-dağılımlı bir boyut dağılımı sergileyen küresel LOMs bir temsili fotomikrografıdır Şekil 3.. Karakterizasyonu. Ölçek çubuğu =10 um. B) Size ışık kararması ile değerlendirilen LOMs dağıtımı. Veriler = hata = SEM.
Şekil 4,. Santrifüj ve konsantre edilerek LOMs Özellikleri. A) 60 ° C'de bir LOM emülsiyon reolojik profili, 70 ve 90 hacim% gaz. 60 hacim% gaza konsantre edilerek bir köpük seyreltilmesi insan kanı benzer bir reolojik profili (hematokrit% 40) verir. Veriler = hata = SEM. B) LOMs oksijen içeriği arasındaki ilişki, insan kan ve kanın oksijen içeriğinin ölçülen artışı ilave edildi. Veriler = ortalama, hata = SEM, satır = en uygun doğrunun% 95 CI ile lineer regresyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konsantre, yüksek oksijenli LOMs oluşturmak için en önemli adımlar şunlardır: 1) HCT içinde tepe boşluğunun tam olarak oksijenli kalmasını sağlamak; 2) lipid yardımcı maddelerin saflığının (C) depolama koşulları ve GMP ürünlerin kullanımı da dahil olmak üzere uygun olduğunu temin etmek; 3) toz haline getirilmiş lipidler sistemin hazırlanmasından önce, sulu faz ile tamamen karıştırmak sağlanması; ve 4) gaz hacim oranı% 70 aşmamasını sağlamak için HCT içinde gaz fraksiyonu artışa dikkate almıştır.
Biz burada açıklamak yöntem içi boş mikrokabarcıkları oluşturmak için yüksek kesme homojenizasyon kullanır. Amfipatik lipitlerin sıralı homojenleştirici içine lipidlerin taşımak için kullanılan sulu faz ile süspanse edilir. GMP dereceli lipidler in vivo çalışmalar için kullanılmaktadır, ve bunlar daha az lipid agregatları ve yabancı maddeler içerdiğinden, genellikle tercih edilir. Saklı özellikle Lipids (ayrıca lipid oksidasyonuna tabioksijenli sıvısı içinde) ve bakteriyel kontaminasyon. Hidrofobik kuyrukları sıralı homojenleştiricide (Şekil 2) içinde oluşturulan çevresinde küçük oksijen gaz mikro düzenlemek zaman LOMs oluşur. Bu rotor bıçakları ve statorun iç duvarının uçları arasındaki öğütülmüş olarak 7500 rpm'de LOMs Homojenizasyon ilave mekanik gerilimlere karşı mikro-kabarcıkları tabi tutar. Onlar daha fazla parçacık boyutunu azaltarak, ultra-ince gözenekli emulsor elekten yüksek hızda zorlanır gibi LOMs da hidrolik kesme tabi. Kesme kuvvetleri sıralı homojenleştirici içinde ve yerel olarak tek kademeli mikser ısı üretir; HCT geri dönmeden önce, in-line bir ısı değiştirici, bu ısı kaldırmak için gereklidir. Bir ısı değiştirici yokluğu ürün kaybı olarak lipit ve sonuç akışkanlığını arttırır lipid (DSPC boyunca 55 ° C), faz geçiş sıcaklığının üstünde sıcaklıklara neden olabilir. Kapalı içinde emülsiyonun oluşturulması, sıralı cihaz sağlar ki saf oxygen hava kirliliğini önleyerek LOM iç kısım içine dahil edilir. Bundan başka, sürekli LOMs HCT üst kısmında gaz ile maruz kalmaktadır. Bu HCT içinde laboratuar mikseri tarafından oluşturulan emme etkisi (HCT basınçlanması önlemek için atmosfere açık olan gaz bileşimi monitör yoluyla) HCT içine atmosferden hava akışının tersine yaratmaz sağlamak nedenle zorunludur . Burada açıklanan oksijen gaz akışı hızları bu olguyu önlemek için yeterli olmalıdır.
Seri konsantrasyon aşaması sırasında in-line homojenizerden emülsiyon, geri kalan sulu faz içinde 'kullanılmayan' fosfolipidler, ek LOMs oluşturur ve aynı zamanda daha fazla parçacık boyutuna azaltabilir tekrar kesme, bozulmamış LOMs tabi tutar. Partikül boyutu ve bu yüzden gaz konsantrasyonu emulsor ekran, ağ boyutu ve seri c çalışma süresi (örneğin, süresi ve karıştırıcı hızı ayarlayarak, uygun olabilironcentration adım). Mekanik ajitasyon çok-dağılımlı bir boyut dağılımına üretir. Geniş bir boyut dağılımı bu şekilde bir köpük belirli bir hacimdeki maksimum kapsüllenmiş gaz oranının artırılması, mikro-kabarcıkların daha sıkı bir ambalaj sağlar. Dahil viskozite arttırıcı maddeler ile formülasyonu kimya değiştirilmesi arzu edildiği takdirde, daha homojen bir boyut dağılımı oluşturmak için kullanılabilir. Biz, 15 dakikalık bir çalışma süresi en ideal olduğunu bulduk; mikro-kabarcık konsantrasyonu arttıkça, emülsiyon giderek viskoz hale gelir. Kritik bir viskositeye ulaştığı zaman, artık etkili bir silindir pompa ile pompalanır. Bu LOMs dahil ediliyor ve açık tüp içinde görülebilir olmadan homojenleştiriciden geçmesine serbest gazı neden olur. Arzu edildiği takdirde, sıralı homojenleştirici içine, gaz akış hızı azaltılabilir ve silindir pompa akış hızı daha yüksek gaz kısımlar oluşturmak için arttırılabilir rağmen, bu aşamada, genel olarak, seri konsantrasyon adımı durdurmak için seçerler. Bununla birlikte, son derece Ağdalıs emülsiyonlar, santrifüj adımı için şırınga içine çekmek için daha fazla kuvvet gerektirir ve bu işlemin verimini azaltabilir.
Dolu şırıngalar daha silindir oluşturur, böylece santrifüj işlemi, şırınga pistonu ve baz kesmek için 140 ml şırıngalar değiştirerek kolaylaştırılmıştır. Bu büyük santrifüj içine yükleme ve şırınga boşaltma kolaylaştırır. Santrifüj sonrasında, şırınga tipik olarak üç tabaka içerir. (Şırınga ucu aşağı yüklenir, şırınga ucu yakınında) yoğun tabaka kullanılmayan fosfolipidler ve sulu fazın bir kısmını içerir. Bazı durumlarda, hava kapalı moloz ", tipik olarak lipid yığınları içeren şırınga ucu içinde görülebilir. Bu esas olarak, işlemin verimliliğini azaltır bulduk olsa temel deneyler için, bu "sulu faz" içeriği, daha sonraki deneyler için tekrar kullanılabilir. (Bu sorunu hafifletmek için, ek fosfolipid maddeler olabilirHer bir şırınga içinde her katkı maddesi molar oranını korumak için dikkat ederek, geri ön-emülsiyona ilave edilebilir.) orta tabaka parlak beyaz ve konsantre edilerek LOMs içerir. Alt ve orta tabakalar arasında bir sınır tipik haliyle keskin bir çizgi yoktur. Her bir şırınga Orta tabaka, aşağıda tarif edildiği gibi daha fazla işlem için birleştirilebilir. Üst katman üretim süreci boyunca kırık LOMs ücretsiz gaz içeren kabarık köpük içerir. Üst ve alt tabakalar tipik olarak atılır. Santrifüj sırasında, her şırınga işlem esnasında santrifüje emülsiyonun ekstrüzyon önlemek için sıkı bir şırınga kapağı ile kapalı olduğundan emin olmak için önemlidir. Daha yüksek hızlarda santrifüj Kullandığımız şırıngaların ezilme mukavemeti ile sınırlıydı. Alt ve orta tabakaların (genellikle yüksek gaz bölümünü içeren emülsiyonlar santrifüj ediliyordu) arasındaki sınır keskin bir çizgi elde etmek gerekirse, santrifüj zaman olabilirgenişletilmiş. Konsantre LOMs birleştirmek için gaz geçirmez bir, 3-yollu vana kullanımı hava kirliliğini önlemek için yararlıdır. Bu LOM içeren şırıngalar daima kapalı tutulmalıdır ve herhangi bir ortam hava derhal sınırdışı olduğundan emin olmak için de önemlidir. Depolama sırasında hava kirliliğini sınırlandırmak için, şırıngalar sadece luer-lock kapaklar ile kapatılmalıdır. Plastik şırınga gaz geçirgen olduğu bilinmektedir, bu yüzden, cam veya metal şırınga, uzun süreli depolama için çok tercih edilir.
Yukarıda tarif edildiği gibi, 15 dakika boyunca seri konsantrasyon adımına maruz emülsiyonlar tipik olarak hacimce% 70 benzin sergiler ve santrifüj ile% 90 gaz konsantre edilebilir. 70 hacim% emülsiyonu sonunda isteniyorsa bile, konsantreden LOMs dahil değildir fosfolipid kaldırmak için yardımcı olmak için santrifüj bulduk. Bu emülsiyonlar aynı zamanda faz ayrımı elde etmek için gece boyunca beklemeye izin vererek gerçekleştirilebilir. In vivo deneyler için, sık sık, konsantre seyreltikPlazma-Lyte A LOMs, hafifçe karıştırın, daha sonra ek kullanılmayan fosfolipidler ve diğer enkaz kaldırmak için tekrar santrifüj. Aşırı lipid enkaz kaldırmak gerektiği gibi Bu adım birkaç kez tekrar edilebilir. LOMs dahil değildir fosfolipidlerin enjeksiyon, çünkü yüksek bir enfüzyon hızı ayarı vermek ek lipid yükünün istenmeyen bir durumdur.
Bu üretim işleminde önlemek için çeşitli ortak tuzaklar bulduk. İlk olarak, lipid katkı maddeleri, taze, -80 ° C'de saklanır ve süresi ise kullanılmaz olmalıdır. Prekürsör çözeltisi edilen emülsiyonlar büyüklük dağılımı ve maksimum gaz fraksiyonu tutarsız olduğu gibi, in vivo çalışmalar için tekrar olmamalıdır, ve bakteriyel kirleticiler, okside lipidler veya lipid kümeleri ihtiva edebilir. Imalat esnasında emülsiyon 'kritik viskoziteye' ulaştıktan sonra ikinci olarak, artık etkili bir sistem üzerinden pompalanacaktır ve büyük gaz cepleri içinde HC oluşturacakT. yüksek emülsiyon akışkanlığı da işlemek ve şırınga içine çekmek için emülsiyon zorlaştırır. Bu sorunlar en (gaz fraksiyonu arttıkça hacmindeki artış miktarının ile) HCT içinde gaz fraksiyonu içinde ölçülmüştür ve başlangıç hacminin iki katına kez seri konsantrasyon işlemini durdurarak önlenir.
Bu tekniğin önemli bir sınırlama, hava ve nihai ürünün bakteri kirlenmesi için potansiyel yaratır, ve sürekli bir süreç olarak bu engellediğinden, istenmeyen bir santrifüjleme adımı için sürekli ihtiyaç vardır. Gelecekte, seri konsantrasyon adım Karışıma santrifüj için duyulan ihtiyacı ortadan kaldıracak bir hidrolik boşaltma sistemi oluşturmak koşulu ile, ticari bir ilaç hazırlamak için tek aşamalı bir sistem olarak modifiye edilebilir. In-hat içi homojenizer ve laboratuar mikseri 3/16 paslanmaz çelikten imal edilmiş olan ve yerinde sterilize edilebilir. Sistemdeki diğer gazlar dahil edilebilir inci genişletmekdaha bu tekniğin e yarar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Finansman: ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Malzeme Komutanlığı (USAMRMC) ve Teletıp ve İleri Teknoloji Araştırma Merkezi tarafından yönetilmektedir. Shunxi Ji burada tarif edildiği gibi şırıngaların modifikasyonu olmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 770365 | Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080) |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C75209 | |
| Plasma-Lyte A | VWR | 80089-818 | Alternatively can use NaCl |
| Glass collection vessel | Specialty Glass, Inc. | Custom | Contact: Pam Zurbrick - 281-595-2210 |
| Gas composition (oxygen) monitor | Precision Medical | PM5900L | |
| Sarns 8000 roller pump | Calicut Medical | 16407 | Part of a modular perfusion system |
| BIOtherm Heat Exchanger | Medtronic | ECMOtherm-II | |
| Verso laboratory in-line mixer | Silverson Machines, Inc | TH-IL-102-VERSO | Use multistage workheads and front-end extension with T piece |
| T-piece for Silverson Verso inlet port | Process Innovations | Custom | Contact: Brian Leavitt - 508-423-2266 |
| L5M-A laboratory mixer | Silverson Machines, Inc | NC0136483 | Use mesh emulsor screen (fine) |
| Rochester-Ochsner toothed forceps | Fisher Scientific | 13-812-18 | |
| 140 ml syringe | Kendall Healthcare Monoject | 8881114030 | Ensure there is a luer lock. |
| IX71 Inverted light microscope | Olympus | IX71 | |
| Retiga-2000R microscope camera | QImaging | RET-2000R-F-M-12 | |
| Accusizer 780A Autodilution | PSS-NICOMP Particle Sizing Systems | Out of production |
References
- Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5 (11), 2161-2170 (2009).
- Ren, J. L., et al. A Novel Ultrasound Microbubble Carrying Gene and Tat Peptide: Preparation and Characterization. Academic Radiology. 16 (12), 1457-1465 (2009).
- Tinkov, S., et al. Microbubbles as Ultrasound Triggered Drug Carriers. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (6), 1935-1961 (2009).
- Hernot, S., Klibanov, A. L. Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (10), 1153-1166 (2008).
- Lanza, G. M., et al. A novel site-targeted ultrasonic contrast agent with broad biomedical application. Circulation. 94 (12), 3334-3340 (1996).
- Cavalli, R., et al. Preparation and characterization of dextran nanobubbles for oxygen delivery. International Journal of Pharmaceutics. 381 (2), 160-165 (2009).
- Kheir, J. N., et al. Oxygen Gas-Filled Microparticles Provide Intravenous Oxygen Delivery. Science Translational Medicine. 4 (140), (2012).
- Lindner, J. R., et al. Microvascular rheology of definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration. Journal of the American Society of Echocardiography. 15 (5), 396-403 (2002).
- Zhao, Y. Z., et al. Preparation, characterization and in vivo observation of phospholipid-based gas-filled microbubbles containing hirudin. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (9), 1237-1243 (2005).
- Seo, M., et al. Microfluidic Assembly of Monodisperse, Nanoparticle-Incorporated Perfluorocarbon Microbubbles for Medical Imaging and Therapy. Langmuir. 26 (17), 13855-13860 (2010).
- Wan, J. D., Stone, H. A. Coated Gas Bubbles for the Continuous Synthesis of Hollow Inorganic Particles. Langmuir. 28 (1), 37-41 (2012).
- Duncanson, W. J., et al. Monodisperse Gas-Filled Microparticles from Reactions in Double Emulsions. Langmuir. 28 (17), 6742-6745 (2012).
- Kendall, M. R., et al. Scaled-Up Production of Monodisperse, Dual Layer Microbubbles Using Multi-Array Microfluidic Module for Medical Imaging and Drug Delivery. Bubble Science Engineering and Technology. 4 (1), 12-20 (2012).
- Szijjarto, C., et al. Effects of Perfluorocarbon Gases on the Size and Stability Characteristics of Phospholipid-Coated Microbubbles: Osmotic Effect versus Interfacial Film Stabilization. Langmuir. 28 (2), 1182-1189 (2012).
- Rossi, S., Waton, G., Krafft, M. P. Phospholipid-Coated Gas Bubble Engineering: Key Parameters for Size and Stability Control, as Determined by an Acoustical Method. Langmuir. 26 (3), 1649-1655 (2010).
- Swanson, E. J., et al. Phospholipid-Stabilized Microbubble Foam for Injectable Oxygen Delivery. Langmuir. 26 (20), 15726-15729 (2010).
- Kvåle, S., et al. Size fractionation of gas-filled microspheres by flotation. Separations Technology. 6 (4), 219-226 (1996).
- Dressaire, E., et al. Interfacial polygonal nanopatterning of stable microbubbles. Science. 320 (5880), 1198-1201 (2008).
- Kheir, J. N., et al. Bulk Manufacture of Concentrated Oxygen Gas-Filled Microparticles for Intravenous Oxygen Delivery. Advanced Healthcare Materials. , (2013).
