Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Производство концентрированных, на основе липидов Oxygen микропузырька эмульсий с высокой скоростью сдвига гомогенизации и последовательной концентрации

doi: 10.3791/51467 Published: May 26, 2014

Summary

Мы описываем методы изготовления больших объемов на основе липидов кислорода микропузырьков (Loms), предназначенных для внутривенного введения кислорода с помощью гомогенизации с высокой степенью сдвига и серийный концентрацию.

Abstract

Газонаполненные микропузырьки были разработаны в качестве ультразвукового контраста и агентов доставки лекарств. Микропузырьки можно получить путем обработки поверхностно-активных веществ с помощью обработки ультразвуком, механическое перемешивание микрожидкостных устройств, или гомогенизации. В последнее время на основе липидов кислорода микропузырьков (Loms) были разработаны, чтобы доставить кислород внутривенно во время скорой медицинской помощи, обращая угрожающие жизни гипоксемии, и предотвращения последующего повреждения органов, остановка сердца и смерть. Мы представляем методы расширения масштабов до производства высоко кислородом микропузырьков с помощью обратной связью гомогенизатора высокого сдвига. Этот процесс может производить 2 л концентрированного модулей LOM (90% по объему) в течение 90 мин. Полученные пузырьки имеют средний диаметр ~ 2 мкм и реологического профиля в соответствии с что крови при разведении до 60% по объему. Эта техника производит Loms в высоком качестве и с высокой чистотой кислорода, предполагая, что этот метод может быть полезен для трансляционных исследовательских лабораторий.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Микропузырьки, состоящие из белка, полимера и липидных оболочек были разработаны в качестве векторов для доставки лекарств, генной терапии и ультразвуковых контрастных средств 1-5. Поскольку эти терапевтические применения требуют внутрисосудистого микропузырьков настойчивость, такие микропузырьки обычно заполнены инертными, высокой молекулярной массой газов, таких как перфторуглеродов 6, которые имеют низкую растворимость в крови и стабилизации пузырьков 3,4.

В последнее время на основе липидов кислорода микропузырьков (Loms) были разработаны для доставки терапевтических доз кислорода, которые могут сохранить органов-мишеней доставку кислорода и предотвращения нестабильность гемодинамики в периоды обструкции дыхательных путей или гипоксемии 7. Эмульсии, предназначенные для внутривенного введения газа требуют различных конструктивных особенностей, чем те, которые используются для ультразвуковых контрастных агентов или целевой доставки лекарств. Во-первых, потому что тело потребляет большие объемы газообразного кислорода (~ 200 мл / мин), Loms должно быть произведено ивводили в больших масштабах. Это требует, чтобы производственный процесс быть эффективным. Во-вторых, производственный процесс должен быть замкнутым контуром для того, чтобы избежать загрязнения азота через воздействии модулей LOM (которая должна быть заполнена с 100% кислорода) в окружающий воздух. В-третьих, потому что цель модулей LOM является внутривенное подачи газа, газ доля модулей LOM должен быть максимальным, признавая ограничения, налагаемые эмульсии вязкости 7. Наконец, как и в любом внутривенных инъекций, точный контроль над распределением частиц по размерам имеет важное значение для предотвращения микрососудистых обструкции 8.

Есть несколько установленные методы для производства микропузырьков. Обработка ультразвуком высокой интенсивности использует, низкочастотный ультразвук применяется к поверхности раздела воздух-жидкость эмульсии, которая включает поверхностно-активное вещество, такое как амфипатического фосфолипида в присутствии газа свободного пространства для производства микропузырьков 7,9. Этот процесс является управляемым путем изменения ультрачастота звука, мощность и длительность импульса, и в результате распределения по размерам может быть адаптировано для получения микропузырьков определенного распределения по размерам, хотя ультразвуком редко используется в производстве клинически используемых микропузырьков. Объединение является интенсивным механическое перемешивание поверхностно-активного вещества и газа в замкнутой системе, что также трудно расширить для размещения больших объемов 2. Капелька основе микрофлюидики позволяет точно контролировать распределение по размерам микропузырьков 10-13. Хотя традиционно трудно расширить, многоканальный, высокоскоростные микрофлюидики были описаны, которые увеличивают микропузырьков эффективности производства 13. Микропузырьки изготовлены с использованием любого из этих методов может потребовать пост-производство процессы сокращения размера, такие как центробежной фракционирования 14,15 и микропузырьков флотации 16,17.

Другой метод создан для изготовления высокостабильных микропузырьков является сдвиг homogenizAtion 6, что может привести к стабилизирующим гексагональной фосфолипидов рисунка на микропузырьков поверхности 18. Основываясь на этой концепции, мы описываем включение гомогенизатор в линии с высокой скоростью сдвига для создания самосборки Loms 19. В этом процессе, гомогенизатор утилизирует быстро вращающихся лопастей в непосредственной близости от двойных тонких экранов сетки emulsor, создавая высокую механическую и Гидравлические ножницы для создания микропузырьков. Серийный концентрация липидной эмульсии с помощью этой системы дает более концентрированный газообразной фракции, который может быть еще больше сконцентрированы центрифугированием.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Настройки системы

Система состоит из холдинга и сосредоточиться бак (НСТ), снабженными одноступенчатой ​​смеситель, гомогенизатор высокого сдвига в линии, роликовым насосом для перемещения жидкости между НСТ и гомогенизатор и теплообменником (рис. 1).

  1. Наведите стерилизованный, широким горлышком 4 L сбора стеклянный сосуд, снабженный 2 базовых портов и 3 боковых портов под единой смеситель стадии. Опустите головку миксера до устья сосуда и обеспечить газонепроницаемую установку с помощью резиновых уплотнений или ленту (в целях предотвращения окружающий воздух от загрязняющих головной пространство).
  2. Установите один из базовых портов (рис. 1, порт # 1) HCT стерильной 3/8 "(ID) прозрачной трубки, около 10" длиной, оснащен 3-ходовой кран на конце для сбора концентрированной эмульсии .
  3. Установите вторую базовую порт (рис. 1, порт # 2) стерильной 3/8 "(ID) трубы, approximatelу 36 "в длину. Поток этот трубопровод через роликовый насос. Установите входное отверстие высокой гомогенизатор сдвига с тройником в том числе двумя портами и подключить следующим образом: соединить трубы из порта № 2, через роликового насоса и подключить к бортовой порт тройника. Подключите другой порт для кислородного баллона с использованием газообразного кислорода расходомер с низким уровнем потока.
  4. Подключение выпускное отверстие гомогенизаторе высокого сдвига к впускному отверстию теплообменником на линии, поддерживаемой при 4 ° С. Подключение выходное отверстие теплообменника с обратным портом HCT (рис. 1, порт # 3), создание системы с замкнутым контуром.
  5. Присоединить кислородный резервуар (через расходомер) в HCT (рис. 1, порт # 4). Прикрепите газовый состав монитор, который открыт в атмосферу к началу порту НСТ (рис. 1, порт № 5).
  6. Если бесплодие желательно, стерилизовать стеклянные и металлические компоненты перед каждым использованием в автоклаве. Стерилизовать компоненты труб и пластиковой сотрудничестваnnectors по окиси этилена перед каждым использованием. Это особенно важно, если продукт должен быть проверен в естественных условиях.

2. LOM Производство

  1. Поместите 20 г GMP 1,2-дистеароил-Sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC) и 10 г холестерина в базе HCT. Добавить 1 л Plasma-Lyte А к HCT и ручной перемешивают в течение 1 мин, объединяя столько, сколько возможно липидов в водной фазе.
  2. Опустить Смеситель стадии в водную фазу, гарантируя, что весь смеситель головка покрыта водной фазе. Убедитесь, что в верхней части HCT является газонепроницаемой (см. шаг 1.1 выше), и, что не существует никаких открытых боковых портов. Включите источник газа, прикрепленной к порту # 4 и подождите, пока кислород доля НСТ свободном пространстве не достигнет> 95%. В 10 л / мин (ЛПМ), это должно занять ~ 10 мин.
  3. Использование одного смесителя этап, смешать эмульсию предшественника в течение 5 мин при 5000 оборотах в минуту. Полученную смесь следует Бледно-белый и не содержат никаких видимых ЛИПИг сгустки. После смешивания, неиспользованный липидов воды смесь можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 30 дней до одного человека.
  4. Премьер вся система замкнутого контура с эмульсией предшественника поворотом на роликового насоса на 1,3 LPM. После того как система грунтуется, держать насос на 1,3 LPM.
  5. Чтобы начать производство из модулей LOM, включите гомогенизатор высокого сдвига в линию к 7500 оборотов в минуту. Сразу же после этого превратить в потоке кислорода к входной части гомогенизатора при 0,5 LPM. Держите один этап смеситель (в НСТ) на при 3500 оборотах в минуту. Loms формируются на стыке рабочих лопаток и экранах emulsor внутри гомогенизатора в линию (рис. 2). В течение нескольких минут, жидкость должна стать заметно более вязкой. Более строгий подход для определения вязкости как функции времени, что может быть сделано путем удаления аликвоты через порт 1 в процессе изготовления и анализа с помощью вискозиметра.
    Примечание: Если видимые пузырьки воздуха присутствуют в трубке, выходящего из смесителя, кислородтечь в гомогенизатор на линии слишком высока. Titrate потока газа до жидкость не является непрозрачным и не содержит никаких видимых пузырьков газа.
  6. Запуск системы в течение 15 мин, а затем выключите высокую гомогенизатора сдвига и входное отверстие кислорода к нему. Продолжить запустить один смеситель этап в НСТ, пока эмульсия не удаляется; Это уменьшает разделение фаз и сохраняет относительно однородный продукт в HCT.
    Примечание: Объем газонаполненном эмульсии следует увеличить примерно в 2 3 раза в течение последовательного этапа концентрации. Если это не так, убедитесь, что кислород течет в высоких гомогенизатор сдвига и что концентрации липидов в эмульсии предшественника являются правильными. Эффективность производства уменьшается по мере концентрации липидов уменьшается.

3. Сбор, Концентрация, оценка, и Хранение модулей LOM

  1. Прикрепите стерильной, изменение 140 мл Luer-Lock шприц к запорным краном, прикрепленной к базовой порту # 1 на емкость. Составьте 100 мл жидкости. Плотно закрывают шприц и повторять, пока вся жидкость не была удалена.
    1. Изменить шприцы путем вывода 100 мл воздуха в шприц и затем распиловки излишки поршень шприца и материал выше отметки 140 мл. Заполните и пустые шприцы с помощью зубчатых щипцов составить поршень. Эта модификация позволяет легче центрифугирования.
  2. Центрифуга шприцы с ограничен конце ориентированной вниз в охлажденном (4 º C) ковша центрифуге при 225 мкг в течение 10 мин.
  3. Три слоя материала появится после центрифугирования. Выгнать нижний слой избыточного пасмурный водной фазы и выбросить. Второй слой ярко-белый и содержит концентрированные Loms. Передача концентрированный пену газонепроницаемого шприца с помощью трехходового запорного крана для предотвращения загрязнения окружающей среды газа. Откажитесь от окончательного слоя, в котором содержится свободный кислород газа из разорванных модулей LOM.
  4. Качество пены может быть оценена путем достижения ≥ 90% газа концентрированной пены. Calculели концентрацию газа следующим образом:
    Объем% газа = [(вес Пена / Объем пены) - 1] х 100
    1. В качестве контроля Второй качества, размер микропузырьков по перекрытия светового потока, чтобы определить, размер частиц находится в пределах ожидаемого диапазона. Следует отметить, что изменение во времени гомогенизации или состава может изменить размер пузырьков.
  5. Плотно закрывайте колпачок стеклянный шприц с Луер-фитинг. Концентрированные Loms можно разбавить Plasma-Lyte А в момент использования. Шприцы могут быть сохранены в 22, 4, или -20 ° С; более низкие температуры могут обеспечить повышенную стабильность срока хранения 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Высокая гомогенизации сдвига позволяет эффективно (то есть в течение одного дня) производство достаточных модулей LOM для исследования животных и не требует технических знаний. Как только опытным, до 2 л концентрированных модулей LOM могут быть изготовлены в течение 90 мин.

Размер Микросепаратор и морфология оценивали с помощью световой микроскопии и перекрытия светового потока. Когда в 10 мкл образца визуализировали модулей LOM, сферические Loms были отмечены, как и относительный недостаток липидов мусора (фиг.3А). Это особенно верно, когда GMP продукт используется. Когда тот же самый образец модулей LOM оценивали с помощью светового потока, средний диаметр частиц был 2,624 ± 0,332 мкм (SD). Более 90% из модулей LOM были <10 мкм в диаметре, а население было полидисперсный (рис. 3В).

Вязкость эмульсии был в большой степени зависит от доли газа (и, следовательно, от концентрации микропузырьков). Два мл аликвотыиз модулей LOM различной концентрации газа изучались с помощью устойчивый размах государственной потока с использованием 40 мм параллельный геометрию пластины, как стресс варьировалась от 0,1 до 10 тысяч мкН · м. Все газовые фракции LOM демонстрируют поведение сдвига для разжижения, и это явление наиболее произносилось на более высоких газовых фракций. Loms содержащие 60 об% газа выставлены реологический профиль, похожий на кровь (рис. 4а).

Наконец, содержание кислорода (в том числе газовой фракции и фракционной концентрации кислорода) из модулей LOM была проверена путем добавления различные объемы кислорода, содержащегося в 60% по объему модулей LOM в аликвотах ненасыщенный крови человека с известным дефицитом кислорода. Как описано выше, содержание кислорода модулей LOM может быть рассчитана с увеличением концентрации оксигемоглобина 7. Соотношение между объемом кислорода добавленной в пределах модулей LOM и объемной увеличением содержания кислорода в крови была 1,053 ± 0,03025 (SD) (95% CI = 0.9865-1.120) (рис.Юр 4В), предполагая, что испытанные Loms содержал почти 100% кислорода, выставлены несколько захваченных газовых карманов (которые не эффективно переносить кислород в крови, но плавать из быстро), а также эффективно передавать всю свою полезную нагрузку кислорода в крови человека в лабораторных условиях.

Рисунок 1
Рисунок 1. Изготовление установки схемы. Loms производятся с использованием, гомогенизатор высокого сдвига в он-лайн в системе с обратной связью. Loms проводятся в холдинг и обогатительное бак (НСТ) при постоянном перемешивании. Эмульсия перемещается через систему при помощи валика насоса. Тепло, выделяемое гомогенизатор удаляют с помощью теплообменника. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. </>

Рисунок 2
Рисунок 2. Самосборка модулей LOM пределах мелкое сито emulsor сетки.) Быстро вращающихся лезвий проходит над мелкое сито emulsor сетки, создавая эффект сифона, что привлекает в водных и газовых фаз. Крошечных пузырьков кислорода образованы сдвига, и быстро окружены гидрофобных липидных хвостов амфипатических фосфолипидов, создавая газонаполненный пузырь самосборки (B).

Рисунок 3
Рисунок 3. Характеристика Loms. А) представитель микрофотография сферических модулей LOM, обладающих распределение размеров полидисперсных. Шкала бар =10 мкм. Б) Распределение по размерам модулей LOM по оценке перекрытия светового потока. Данные = значит, ошибка = SEM.

Рисунок 4
Рисунок 4. Свойства центрифугировали и концентрированных модулей LOM.) Реологический профиль из LOM эмульсии при 60, 70 и 90% по объему газа. Разбавление концентрированного пены до 60% от объема газа дает реологические профиль, подобный человеческой крови (гематокрит 40%). Данные = значит, ошибка = SEM. B) Соотношение между содержанием кислорода модулей LOM добавлен в человеческой крови и измеренному увеличению содержания кислорода в крови. Данные = значит, ошибка = SEM, строка = линейная регрессия с 95% ДИ от наиболее подходящую линию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Наиболее важные шаги к созданию концентрированные, высоко окисленные Loms включают в себя: 1) обеспечение того, чтобы свободное пространство в НСТ остается полностью кислородом; 2) обеспечение того, чтобы чистота липидных наполнителей является оптимальным (в том числе условий хранения и использования продукции GMP); 3) обеспечение того, чтобы смешать порошковые липиды полностью с водной фазой до заливки системы; и 4) обращая особое внимание на увеличение доли газа в пределах HCT чтобы гарантировать, что объемная доля газа не превышает 70%.

Метод, который мы описываем здесь использует высокую гомогенизации сдвига для создания полых микропузырьков. Амфипатические липиды, суспендируют с водной фазой, который используется для выполнения липидов в гомогенизатор на линии. GMP-класса липиды используются для естественных условиях исследования в, и, как правило, предпочтительны, поскольку они содержат меньше агрегаты липидов и примесей. Липиды также подлежат окисления липидов (особенно при хранениив пределах кислородом жидкости) и бактериальное загрязнение. Loms образуются, когда гидрофобные хвосты организовать вокруг маленьких газовых микропузырьков кислорода созданные в гомогенизатор в линию (рис. 2). Гомогенизация Loms на 7500 оборотов в минуту подвергает микропузырьков к дополнительным механическим нагрузкам, как они измельчают между концами лопаток ротора и внутренней стенкой статора. Loms также проходят гидравлические ножницы, поскольку они вынуждены с большой скоростью через ультра-тонкой очистки сетки emulsor, дальнейшее сокращение размера частиц. Поперечные силы генерируют тепло в гомогенизатор в он-лайн и локально на одном смесителе стадии; рядный теплообменник перед возвращением к НСТ необходимо снять это тепло. Отсутствие теплообменник может повысить температурах выше температуры фазового перехода липидов (55 ° C в течение DSPC), что повышает текучесть липидов и приводит к потере продукта. Создание эмульсии в закрытом, рядный устройство гарантирует, что чистая Oxygeн включен в ядро ​​LOM, предотвращая загрязнение воздуха. Кроме того, Loms постоянно подвергаются воздействию с газообразным свободном пространстве от HCT. Поэтому крайне важно, чтобы убедиться, что эффект всасывания создан лабораторный смеситель в НСТ не создает реверсирование воздушного потока из атмосферы в НСТ (через монитора состава газа, который открыт в атмосферу для предотвращения повышения давления в НСТ) . Скорости потока газообразного кислорода, описанные здесь, должны быть достаточными, чтобы предотвратить это явление.

Утилизация эмульсии через гомогенизатор в линию во время последовательного этапа концентрации создает дополнительные Loms из "неиспользованных" фосфолипидов оставшихся в водной фазе, а также подвергает нетронутыми Loms повторному стрижки, который может дополнительно уменьшить размер частиц. Размер частиц и газа концентрация может быть поэтому с учетом, регулируя скорость смесителя, emulsor экраны, размер ячейки, а время работы (т.е. длительность последовательного сoncentration шаг). Механическое перемешивание производит распределение размеров полидисперсных. Широкое распределение по размерам позволяет более тесной упаковки микропузырьков, тем самым увеличивая максимальную инкапсулированный газообразной фракции в данном объеме пены. Изменение рецептуры химию по включению повышающий вязкость агентов могут быть использованы, чтобы создать более равномерное распределение размера при желании. Мы обнаружили, что время работы 15 мин является самым идеальным; по мере увеличения концентрации микропузырьков, эмульсия становится все более и более вязким. После того, как он достигает критического вязкость, это больше не эффективно перекачивается с помощью роликового насоса. Это вызывает свободный газ, чтобы пройти через гомогенизатор, не будучи включены в модулей LOM и можно увидеть в прозрачной трубки. На данном этапе, мы обычно выбирают, чтобы остановить серийный стадии концентрирования, хотя, если желательно, то скорость потока газа в гомогенизатор на линии может быть уменьшена, а скорость потока ролик насос может быть увеличена, чтобы создать более высокие газообразных фракций. Тем не менее, очень viscouS эмульсии требуют больше силы, чтобы выйти в шприцы для стадии центрифугирования, и может снизить выход этого процесса.

Шаг центрифугирования была облегчена путем изменения 140 мл шприцев усечь поршень и основание шприца, так что заполненные шприцы образуют даже цилиндр. Это значительно облегчает погрузку и разгрузку шприцев в центрифугу. После центрифугирования шприцы обычно содержат три слоя. Плотный слой (около наконечника шприца шприцы когда загружаются носом вниз) содержит неиспользуемые фосфолипиды и основную часть водной фазы. В некоторых случаях, облачно 'мусор' можно увидеть в наконечника шприца, который обычно содержит липидные скопления. Для базовых экспериментов, содержимое этого 'водной фазы "может быть повторно использован для последующих экспериментов, однако мы обнаружили, что это существенно снижает эффективность процесса. (Чтобы смягчить эту проблему, дополнительные фосфолипидов наполнители могутбыть добавлены к эмульсии вторичного предшественника, с учетом необходимости поддерживать молярное отношение каждого наполнителем.) Средний слой внутри каждого шприца яркий белый и содержит концентрированные Loms. Существует правило, резкое демаркационная линия между нижней и средних слоев. Средний слой из каждого шприца могут быть объединены для дальнейшей обработки, как описано ниже. Верхний слой содержит пушистый пену, содержащую свободный газ из модулей LOM разбитых на протяжении всего производственного процесса. Верхний и нижний слои, как правило, выбрасывают. Во время центрифугирования, важно, чтобы каждый шприц покрыта плотным колпачком шприца, чтобы предотвратить выдавливание эмульсии в центрифугу во время обработки. Центрифугирование на более высоких скоростях был ограничен прочности на раздавливание шприцев, которые мы использовали. При необходимости, чтобы добиться резкого демаркационную линию между нижними и средними слоями (обычно, когда были центрифугирования эмульсии, содержащие высокую долю газа), время центрифугирования может бытьпродлен. Использование газонепроницаемой, 3-ходовой кран, чтобы объединить концентрированные Loms полезно для предотвращения загрязнения воздуха. Важно также, чтобы гарантировать, что LOM-содержащие шприцы всегда хранятся закрывают и что любой окружающий воздух немедленно исключен. Чтобы ограничить загрязнение воздуха во время хранения, шприцы должны быть запечатаны только с Luer-Lock колпачками. Пластиковые шприцы, как известно, газопроницаемые, так стекла или металла шприцы предпочтительны для длительного хранения.

Как описано выше, эмульсии, контактирующие с последовательной стадии концентрирования в течение 15 мин обычно имеют 70% по объему газа и может быть сосредоточено до 90% газа центрифугированием. Даже если 70% по объему эмульсии желательно в конце концов, мы нашли центрифугирования, чтобы быть полезным для удаления фосфолипидов, которые не включены в модулей LOM из концентрата. Это также может быть достигнуто путем позволяя эмульсии выдерживают в течение ночи, чтобы достичь разделение фаз. Для естественных условиях экспериментов в, мы часто разбавить концентрированныйLoms с Plasma-Lyte А, аккуратно перемешать, затем центрифуги снова, чтобы удалить дополнительные неиспользуемые фосфолипиды и другой мусор. Этот этап может быть повторен несколько раз, сколько необходимо для удаления избытка липидов мусора. Инъекция фосфолипидов, которые не включены в модулей LOM нежелательно из-за дополнительной нагрузки липидов они придают в условиях высокой скорости инфузии.

Мы нашли несколько распространенных ошибок, чтобы избежать в этом производственном процессе. Во-первых, липидных эксципиентов должна быть свежей, хранили при -80 ° С, и не используется, если истек. Раствор предшественника не должны быть повторно использованы для естественных условиях исследования того, как в результате эмульсии несовместимы в их распределением по размерам и максимальной доли газа и могут содержать бактериальных загрязнений, окисленные липиды, липидные или комки. Во-вторых, после того, как эмульсия достигает «критической вязкости 'во время изготовления, он больше не будет эффективно прокачивают через систему, и большие газовые карманы будут формировать внутри HCТ. Высокая вязкость эмульсии также делает эмульсия трудно справиться и составить в шприцы. Эти проблемы лучше избегать, измеряя увеличение доли газа в пределах HCT (по количественной увеличение объема качестве газа фракции возрастает) и остановки процесса последовательного концентрации раз исходного объема удваивается.

Одним из ключевых ограничение этого метода является стойким необходимость в стадии центрифугирования, что нежелательно, потому что это создает потенциал для воздуха и бактериального заражения конечного продукта, а также предотвращает от того, это непрерывный процесс. В будущем, серийный шаг концентрация может быть изменен в пошаговом системы коммерческого изготовления наркотиков путем использования гидравлическую систему разряда для устранения необходимости для пакетной центрифугирования. Гомогенизатор в линию и лабораторные смесители могут быть изготовлены с 3/16 нержавеющей стали и стерилизуют на месте. Включение других газов в системе может расширить тыс.э полезность этого метода дальнейшего.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Финансирование: Армия США медицинских исследований и Materiel Command (USAMRMC) и управляется телемедицины и передовых технологий исследовательского центра. Shunxi Джи способствовали модификацию шприцев, как описано здесь.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Polar Lipids 770365 Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080)
Cholesterol Sigma Aldrich C75209
Plasma-Lyte A VWR 80089-818 Alternatively can use NaCl
Glass collection vessel Specialty Glass, Inc. Custom Contact: Pam Zurbrick - 281-595-2210
Gas composition (oxygen) monitor Precision Medical PM5900L
Sarns 8000 roller pump Calicut Medical 16407 Part of a modular perfusion system
BIOtherm Heat Exchanger Medtronic ECMOtherm-II
Verso laboratory in-line mixer Silverson Machines, Inc TH-IL-102-VERSO Use multistage workheads and front-end extension with T piece
T-piece for Silverson Verso inlet port Process Innovations Custom Contact: Brian Leavitt - 508-423-2266
L5M-A laboratory mixer Silverson Machines, Inc NC0136483 Use mesh emulsor screen (fine)
Rochester-Ochsner toothed forceps Fisher Scientific 13-812-18
140 ml syringe Kendall Healthcare Monoject 8881114030 Ensure there is a luer lock.
IX71 Inverted light microscope Olympus IX71
Retiga-2000R microscope camera QImaging RET-2000R-F-M-12
Accusizer 780A Autodilution PSS-NICOMP Particle Sizing Systems Out of production

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5, (11), 2161-2170 (2009).
  2. Ren, J. L., et al. A Novel Ultrasound Microbubble Carrying Gene and Tat Peptide: Preparation and Characterization. Academic Radiology. 16, (12), 1457-1465 (2009).
  3. Tinkov, S., et al. Microbubbles as Ultrasound Triggered Drug Carriers. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98, (6), 1935-1961 (2009).
  4. Hernot, S., Klibanov, A. L. Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, (10), 1153-1166 (2008).
  5. Lanza, G. M., et al. A novel site-targeted ultrasonic contrast agent with broad biomedical application. Circulation. 94, (12), 3334-3340 (1996).
  6. Cavalli, R., et al. Preparation and characterization of dextran nanobubbles for oxygen delivery. International Journal of Pharmaceutics. 381, (2), 160-165 (2009).
  7. Kheir, J. N., et al. Oxygen Gas-Filled Microparticles Provide Intravenous Oxygen Delivery. Science Translational Medicine. 4, (140), (2012).
  8. Lindner, J. R., et al. Microvascular rheology of definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration. Journal of the American Society of Echocardiography. 15, (5), 396-403 (2002).
  9. Zhao, Y. Z., et al. Preparation, characterization and in vivo observation of phospholipid-based gas-filled microbubbles containing hirudin. Ultrasound in Medicine and Biology. 31, (9), 1237-1243 (2005).
  10. Seo, M., et al. Microfluidic Assembly of Monodisperse, Nanoparticle-Incorporated Perfluorocarbon Microbubbles for Medical Imaging and Therapy. Langmuir. 26, (17), 13855-13860 (2010).
  11. Wan, J. D., Stone, H. A. Coated Gas Bubbles for the Continuous Synthesis of Hollow Inorganic Particles. Langmuir. 28, (1), 37-41 (2012).
  12. Duncanson, W. J., et al. Monodisperse Gas-Filled Microparticles from Reactions in Double Emulsions. Langmuir. 28, (17), 6742-6745 (2012).
  13. Kendall, M. R., et al. Scaled-Up Production of Monodisperse, Dual Layer Microbubbles Using Multi-Array Microfluidic Module for Medical Imaging and Drug Delivery. Bubble Science Engineering and Technology. 4, (1), 12-20 (2012).
  14. Szijjarto, C., et al. Effects of Perfluorocarbon Gases on the Size and Stability Characteristics of Phospholipid-Coated Microbubbles: Osmotic Effect versus Interfacial Film Stabilization. Langmuir. 28, (2), 1182-1189 (2012).
  15. Rossi, S., Waton, G., Krafft, M. P. Phospholipid-Coated Gas Bubble Engineering: Key Parameters for Size and Stability Control, as Determined by an Acoustical Method. Langmuir. 26, (3), 1649-1655 (2010).
  16. Swanson, E. J., et al. Phospholipid-Stabilized Microbubble Foam for Injectable Oxygen Delivery. Langmuir. 26, (20), 15726-15729 (2010).
  17. Kvåle, S., et al. Size fractionation of gas-filled microspheres by flotation. Separations Technology. 6, (4), 219-226 (1996).
  18. Dressaire, E., et al. Interfacial polygonal nanopatterning of stable microbubbles. Science. 320, (5880), 1198-1201 (2008).
  19. Kheir, J. N., et al. Bulk Manufacture of Concentrated Oxygen Gas-Filled Microparticles for Intravenous Oxygen Delivery. Advanced Healthcare Materials. (2013).
Производство концентрированных, на основе липидов Oxygen микропузырька эмульсий с высокой скоростью сдвига гомогенизации и последовательной концентрации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomson, L. M., Polizzotti, B. D., McGowan, F. X., Kheir, J. N. Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration. J. Vis. Exp. (87), e51467, doi:10.3791/51467 (2014).More

Thomson, L. M., Polizzotti, B. D., McGowan, F. X., Kheir, J. N. Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration. J. Vis. Exp. (87), e51467, doi:10.3791/51467 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter