Summary

Bereiding van geconcentreerd, lipide-gebaseerde Oxygen Microbellen emulsies door High Shear homogenisering en Serial Concentratie

Published: May 26, 2014
doi:

Summary

We beschrijven werkwijzen voor de bereiding van grote hoeveelheden lipide-gebaseerde zuurstof microbellen (LOM) ontworpen voor intraveneuze zuurstoflevering onder hoge afschuiving homogenisatie en seriële concentratie.

Abstract

Met gas gevulde microbolletjes zijn ontwikkeld als ultrageluid contrast en drug delivery agenten. Microbellen kan worden verkregen door verwerking oppervlakteactieve middels sonicatie, mechanisch roeren, microfluïdische apparaten of homogeniseren. Onlangs zijn lipide-gebaseerde zuurstof microbellen (LOM) is ontworpen om zuurstof intraveneus toedienen tijdens medische noodgevallen, omkeren levensbedreigende hypoxemie, en voorkomen van verdere orgaanschade, hartstilstand en de dood. We presenteren methoden voor opgeschaalde productie van zeer zuurstofrijk microbellen met een closed-loop high-shear homogenisator. Het proces kan 2 L van geconcentreerde LOM's (90% van het volume) te produceren in 90 minuten. Resulterende belletjes hebben een gemiddelde diameter van ca. 2 pm en een reologisch profiel overeenkomend met die van bloed wanneer verdund tot 60 volume%. Deze techniek produceert LOM's in hoge capaciteit en met een hoge zuurstof zuiverheid, wat suggereert dat deze techniek bruikbaar voor translationeel onderzoek labs kunnen zijn.

Introduction

Microbubbles samengesteld eiwit, polymeer en lipide schelpen zijn ontwikkeld als vectoren voor geneesmiddelafgifte, gentherapie en ultrageluid contrastmiddelen 1-5. Omdat deze therapeutische toepassingen vereisen intravasculaire microbellen doorzettingsvermogen, worden dergelijke microbellen vaak gevuld met inert, moleculair gewicht gassen hoog zoals perfluorkoolstoffen 6, die een lage oplosbaarheid hebben in het bloed en het stabiliseren van de bel 3,4.

Onlangs zijn lipide-gebaseerde zuurstof microbellen (LOM) is ontworpen om de therapeutische doses van zuurstof, die end-orgel zuurstof levering kunnen behouden en tijdens perioden van luchtwegobstructie of hypoxemie 7 voorkomen hemodynamische instabiliteit te leveren. Emulsies ontworpen voor intraveneuze gas levering vereisen verschillende design kenmerken dan die welke worden gebruikt voor ultrageluid contrastmiddelen of gerichte toediening van medicijnen. Ten eerste, omdat het lichaam verbruikt grote hoeveelheden zuurstofgas (~ 200 ml / min), LOM worden vervaardigd engeïnjecteerd op grote schaal. Dit vereist dat het productieproces efficiënt. Ten tweede moet het productieproces gesloten lus om stikstof besmetting door de blootstelling van LOM (dat moet worden gevuld met 100% zuurstof) vermijden omgevingslucht. Ten derde, omdat het doel van het LOM is intraveneuze levering van gas, het gas fractie van LOM gemaximaliseerd moet worden, erkenning van de voorwaarden door emulsie viscositeit 7 beperkingen. Ten slotte, zoals bij elk intraveneus injecteerbare, nauwkeurige controle over deeltjesgrootteverdeling is essentieel voor het vermijden van microvasculaire obstructie 8.

Er zijn een aantal gevestigde methoden voor microbellen vervaardigen. Sonicatie gebruikt hoge intensiteit laagfrequente ultrageluid toegepast op de lucht-vloeistof-interface van een emulsie die een oppervlakteactieve stof, zoals een amfipathische fosfolipide, in aanwezigheid van een gas kopruimte om microbellen 7,9 produceren omvat. Dit proces is regelbaar door het variëren ultrageluidsfrequentie, kracht en pulsduur en de verkregen grootteverdeling kan worden aangepast aan microbellen een specifieke grootteverdeling produceren, maar sonicatie zelden gebruikt bij de vervaardiging van klinisch gebruikte microbellen. Fusie is de intense mechanische agitatie van een oppervlakteactieve stof en gas in een gesloten systeem, dat ook moeilijk te schalen naar grote volumes 2 tegemoet. Droplet-gebaseerde microfluidics zorgt voor een precieze controle van microbellen grootteverdeling 10-13. Hoewel traditioneel moeilijk op te schalen, multi-channel, high-speed microfluidics beschreven die microbellen productie-efficiëntie te verhogen 13. Microbellen vervaardigd met behulp van een van deze methoden kan de post-productie verkleinen van de deeltjes processen, zoals centrifugaal fractionering 14,15 en microbellen beursgang 16,17 nodig.

Een andere beproefde methode voor het vervaardigen van zeer stabiele microbellen is shear homogenizatie 6, wat kan resulteren in een stabiliserend fosfolipide hexagonaal patroon op het oppervlak microbelletjes 18. Voortbouwend op dit concept, beschrijven we de oprichting van een in-line high shear homogenisator naar zelfassemblage LOM 19 te creëren. In dit proces, maakt gebruik van de homogenisator snel roterende messen in de nabijheid van dual fijnmazige emulgeerzeef schermen, het creëren van een hoge mechanische en hydraulische schaar voor de creatie van microbellen. Seriële concentratie van het lipide-emulsie via dit systeem levert een verhoogde concentratie gasfractie, die verder kan worden geconcentreerd door centrifugatie.

Protocol

1. Systeem Set-up Het systeem bestaat uit een holding en het concentreren van de tank (HCT), met een enkel podium mixer, een in-line high shear homogenisator, een roller pomp vloeistof tussen de HCT en de homogenisator bewegen, en een warmtewisselaar (figuur 1). Plaats een gesteriliseerde, brede opening 4 L glascollectie vat uitgerust met 2 voet-poorten en 3 poorten aan de zijkant onder de single stage mixer. Laat de mixer hoofd tot aan de monding van het schip en…

Representative Results

Hoge afschuiving homogenisering kan de efficiënte (dwz binnen een middag) productie van voldoende LOM's voor een studie bij dieren en geen technische expertise nodig. Eenmaal bedreven, kan tot 2 L van geconcentreerde LOM's worden vervaardigd in 90 minuten. Microbellen grootte en morfologie werd beoordeeld door lichtmicroscopie en door lichtverstrooiing. Wanneer een 10 ul monster van LOM werd gevisualiseerd werden bolvormige LOM genoteerd, evenals een relatieve schaarste aan…

Discussion

De belangrijkste stappen voor het creëren van geconcentreerde, zeer zuurstofrijk LOM's omvatten: 1) ervoor zorgen dat de bovenruimte in het HCT volledig blijft zuurstofrijk; 2) ervoor te zorgen dat de zuiverheid van de lipide hulpstoffen is optimaal (inclusief opslagcondities en het gebruik van GMP-producten); 3) de garantie dat de poedervormige lipiden mengen volledig met de waterige fase voorafgaand aan het systeem priming; en 4) met veel aandacht voor de stijging van de gas-fractie binnen het HCT om ervoor te zo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financiering: US Army Medical Research & Materieel Command (USAMRMC) en beheerd door de Telemedicine & Advanced Technology Research Center. Shunxi Ji droeg de wijziging van de injectiespuiten zoals hier beschreven.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Polar Lipids 770365 Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080)
Cholesterol Sigma Aldrich C75209
Plasma-Lyte A VWR 80089-818 Alternatively can use NaCl
Glass collection vessel Specialty Glass, Inc. Custom Contact: Pam Zurbrick – 281-595-2210
Gas composition (oxygen) monitor Precision Medical PM5900L
Sarns 8000 roller pump Calicut Medical 16407 Part of a modular perfusion system
BIOtherm Heat Exchanger Medtronic ECMOtherm-II
Verso laboratory in-line mixer Silverson Machines, Inc TH-IL-102-VERSO Use multistage workheads and front-end extension with T piece
T-piece for Silverson Verso inlet port Process Innovations Custom Contact: Brian Leavitt – 508-423-2266
L5M-A laboratory mixer Silverson Machines, Inc NC0136483 Use mesh emulsor screen (fine)
Rochester-Ochsner toothed forceps Fisher Scientific 13-812-18
140 mL syringe Kendall Healthcare Monoject  8881114030 Ensure there is a luer lock.
IX71 Inverted light microscope Olympus IX71
Retiga-2000R microscope camera QImaging RET-2000R-F-M-12
Accusizer 780A Autodilution PSS-NICOMP Particle Sizing Systems Out of production

References

  1. Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5 (11), 2161-2170 (2009).
  2. Ren, J. L., et al. A Novel Ultrasound Microbubble Carrying Gene and Tat Peptide: Preparation and Characterization. Academic Radiology. 16 (12), 1457-1465 (2009).
  3. Tinkov, S., et al. Microbubbles as Ultrasound Triggered Drug Carriers. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (6), 1935-1961 (2009).
  4. Hernot, S., Klibanov, A. L. Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (10), 1153-1166 (2008).
  5. Lanza, G. M., et al. A novel site-targeted ultrasonic contrast agent with broad biomedical application. Circulation. 94 (12), 3334-3340 (1996).
  6. Cavalli, R., et al. Preparation and characterization of dextran nanobubbles for oxygen delivery. International Journal of Pharmaceutics. 381 (2), 160-165 (2009).
  7. Kheir, J. N., et al. Oxygen Gas-Filled Microparticles Provide Intravenous Oxygen Delivery. Science Translational Medicine. 4 (140), (2012).
  8. Lindner, J. R., et al. Microvascular rheology of definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration. Journal of the American Society of Echocardiography. 15 (5), 396-403 (2002).
  9. Zhao, Y. Z., et al. Preparation, characterization and in vivo observation of phospholipid-based gas-filled microbubbles containing hirudin. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (9), 1237-1243 (2005).
  10. Seo, M., et al. Microfluidic Assembly of Monodisperse, Nanoparticle-Incorporated Perfluorocarbon Microbubbles for Medical Imaging and Therapy. Langmuir. 26 (17), 13855-13860 (2010).
  11. Wan, J. D., Stone, H. A. Coated Gas Bubbles for the Continuous Synthesis of Hollow Inorganic Particles. Langmuir. 28 (1), 37-41 (2012).
  12. Duncanson, W. J., et al. Monodisperse Gas-Filled Microparticles from Reactions in Double Emulsions. Langmuir. 28 (17), 6742-6745 (2012).
  13. Kendall, M. R., et al. Scaled-Up Production of Monodisperse, Dual Layer Microbubbles Using Multi-Array Microfluidic Module for Medical Imaging and Drug Delivery. Bubble Science Engineering and Technology. 4 (1), 12-20 (2012).
  14. Szijjarto, C., et al. Effects of Perfluorocarbon Gases on the Size and Stability Characteristics of Phospholipid-Coated Microbubbles: Osmotic Effect versus Interfacial Film Stabilization. Langmuir. 28 (2), 1182-1189 (2012).
  15. Rossi, S., Waton, G., Krafft, M. P. Phospholipid-Coated Gas Bubble Engineering: Key Parameters for Size and Stability Control, as Determined by an Acoustical Method. Langmuir. 26 (3), 1649-1655 (2010).
  16. Swanson, E. J., et al. Phospholipid-Stabilized Microbubble Foam for Injectable Oxygen Delivery. Langmuir. 26 (20), 15726-15729 (2010).
  17. Kvåle, S., et al. Size fractionation of gas-filled microspheres by flotation. Separations Technology. 6 (4), 219-226 (1996).
  18. Dressaire, E., et al. Interfacial polygonal nanopatterning of stable microbubbles. Science. 320 (5880), 1198-1201 (2008).
  19. Kheir, J. N., et al. Bulk Manufacture of Concentrated Oxygen Gas-Filled Microparticles for Intravenous Oxygen Delivery. Advanced Healthcare Materials. , (2013).

Play Video

Cite This Article
Thomson, L. M., Polizzotti, B. D., McGowan, F. X., Kheir, J. N. Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration. J. Vis. Exp. (87), e51467, doi:10.3791/51467 (2014).

View Video