Herstellung von konzentrierten, Lipid-basierte Sauerstoffmikroblasen-Emulsionen von High-Shear-Homogenisierung und Serien Konzentration
Summary
Wir beschreiben Methoden zur Herstellung großer Mengen von Lipid-basierten Sauerstoffmikrobläschen (LOMs) zur intravenösen Sauerstoffzufuhr ausgebildet mit hoher Scherung homogenisiert und serielle Konzentration.
Abstract
Gasgefüllte Mikrobläschen haben als Ultraschallkontrast und Drug-Delivery-Agenten entwickelt. Mikrobläschen können durch Verarbeiten Tenside mit Beschallung, mechanischer Agitation, mikrofluidischen Vorrichtungen oder Homogenisierung hergestellt werden. Kürzlich, Lipid-basierten Sauerstoff-Mikrobläschen (LOMs) wurden entwickelt, um Sauerstoff während der medizinischen Notfällen intravenös zu liefern, Rückfahrlebensbedrohlichen Hypoxämie und verhindert spätere Organschäden, Herzstillstand und Tod. Wir stellen Methoden für die vergrösserte Produktion von stark mit Sauerstoff-Mikrobläschen mit einem Closed-Loop-High-Shear Homogenisator. Das Verfahren kann 2 l konzentrierter LOMs (90 Vol.%) in 90 min zu erzeugen. Resultierende Blasen einen durchschnittlichen Durchmesser von ~ 2 um, und eine rheologische Profil in Übereinstimmung mit der von Blut, wenn sie 60 Vol.% verdünnt. Diese Technik erzeugt LOMs in hoher Kapazität und hoher Sauerstoffreinheit, was darauf hindeutet, dass diese Technik kann für die translationale Forschungslabors sein.
Introduction
Mikrobläschen von Protein-, Polymer-und Lipidschalen zusammengesetzt sind als Vektoren für die Arzneimittelabgabe, Gentherapie, und Ultraschall-Kontrastmitteln 1-5 entwickelt. Da diese therapeutische Anwendungen erfordern intravaskulären Mikroblasen-Persistenz, werden solche Mikroblasen häufig mit inerten, molekulare Gase hoch wie perfluorierte Kohlenwasserstoffe 6, die geringe Löslichkeit im Blut haben und Stabilisierung der Blase 3,4 gefüllt.
Kürzlich, Lipid-basierten Sauerstoff-Mikrobläschen (LOMs) wurden entwickelt, um therapeutische Dosen von Sauerstoff, der Endorgane Sauerstoffversorgung zu erhalten und hämodynamische Instabilität in Zeiten der Obstruktion der Atemwege oder Hypoxämie 7 verhindern können, zu liefern. Emulsionen zur intravenösen Gaszufuhr ausgelegt erfordern unterschiedliche Design-Merkmale als die für Ultraschallkontrastmittel oder gezielten Verabreichung von Medikamenten verwendet. Erstens, weil der Körper verbraucht große Mengen an Sauerstoffgas (~ 200 ml / min), ist LOMs erzeugt werden undim großen Maßstab injiziert. Dies erfordert, dass der Herstellungsprozess effizient. Zweitens sollte das Herstellungsverfahren mit geschlossener Schleife, um Stickstoffverunreinigung durch die Belichtung LOMs (die mit 100% Sauerstoff gefüllt werden soll) zu vermeiden, um die Umgebungsluft sein. Drittens, da der Zweck LOMs intravenös Gaszufuhr sollte der Gasanteil LOMs maximiert werden, wobei die Einschränkungen, die durch Emulsionsviskosität 7 auferlegt. Schließlich, wie bei jedem intravenös injizierbare ist eine genaue Kontrolle über die Partikelgrößenverteilung wesentlich zur Vermeidung mikrovaskuläre Obstruktion 8.
Es gibt mehrere etablierte Methoden für die Herstellung von Mikrobläschen. Beschallung hoher Intensität verwendet, um die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche einer Emulsion, die ein Tensid, wie ein amphipathisches Phospholipid in Gegenwart eines Gasraum auf 7,9 Mikrobläschen erzeugen beinhaltet aufgebracht niederfrequenten Ultraschall. Dieses Verfahren ist durch Variieren UltraSchallfrequenz, Leistung und Impulsdauer, und die resultierende Größenverteilung hergestellt werden, um Mikrobläschen aus einem bestimmten Größenverteilung zu erzeugen, wenn der Beschallung nur selten bei der Herstellung von klinisch verwendeten Mikrobläschen verwendet werden. Verschmelzung ist die intensive mechanische Bewegung eines Tensids und Gas in einem geschlossenen System, das auch schwierig zu skalieren, um große Mengen 2 aufzunehmen. Tröpfchenbasierte Mikrofluidik ermöglicht die präzise Steuerung der Mikroblasengrößenverteilung 10-13. Obwohl traditionell schwierig zu skalieren, Multi-Channel-, High-Speed-Mikrofluidik beschrieben worden, die Effizienz in der Produktion von Mikrobläschen 13 zu erhöhen. Mikrobläschen mit einer dieser Methoden hergestellt wurden, können nach der Herstellung Zerkleinerungsprozesse, wie Zentrifugalfraktionierung 14,15 und Mikroblasen-Flotation 16,17 erforderlich.
Eine weitere etablierte Methode für die Herstellung von hochstabilen Mikrobläschen Scher homogenization 6, die in einem Stabilisierungs Phospholipid hexagonalen Muster auf der Mikroblasenoberfläche 18 führen kann. Aufbauend auf diesem Konzept beschreiben wir den Einbau eines In-Line-Homogenisator mit hoher Scher zu selbstorganisierenden LOMs 19 erstellen. In diesem Prozess nutzt der Homogenisator schnell rotierenden Klingen in unmittelbarer Nähe zu Dual feinmaschigen Emulsor Bildschirme, wodurch hohe mechanische und hydraulische Schere für die Schaffung von Mikrobläschen. Serien Konzentration der Lipidemulsion durch dieses System liefert eine zunehmend konzentrierte Gasfraktion, die noch weiter durch Zentrifugation konzentriert werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die wichtigsten Schritte zur Schaffung konzentrierte, hoch sauerstoffhaltigen LOMs gehören: 1) sicherzustellen, dass der Kopfraum in der HCT bleibt voll mit Sauerstoff angereichert; 2) sicherstellen, dass die Reinheit der Lipidträger optimal ist (einschließlich Lagerbedingungen und Verwendung von GMP-Produkte); 3) die Gewährleistung, dass die pulverförmigen Lipiden mischen vollständig mit der wässrigen Phase vor, um die System Grundierung; und 4) aufmerksam auf die Erhöhung der Gasfraktion im HCT zu gewährleist…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finanzierung: US Army Medical Research & Materiel Command (USAMRMC) und von der Telemedizin & Advanced Technology Research Center verwaltet. Shunxi Ji trug die Änderung der Spritzen, wie hier beschrieben.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 770365 | Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080) |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C75209 | |
| Plasma-Lyte A | VWR | 80089-818 | Alternatively can use NaCl |
| Glass collection vessel | Specialty Glass, Inc. | Custom | Contact: Pam Zurbrick – 281-595-2210 |
| Gas composition (oxygen) monitor | Precision Medical | PM5900L | |
| Sarns 8000 roller pump | Calicut Medical | 16407 | Part of a modular perfusion system |
| BIOtherm Heat Exchanger | Medtronic | ECMOtherm-II | |
| Verso laboratory in-line mixer | Silverson Machines, Inc | TH-IL-102-VERSO | Use multistage workheads and front-end extension with T piece |
| T-piece for Silverson Verso inlet port | Process Innovations | Custom | Contact: Brian Leavitt – 508-423-2266 |
| L5M-A laboratory mixer | Silverson Machines, Inc | NC0136483 | Use mesh emulsor screen (fine) |
| Rochester-Ochsner toothed forceps | Fisher Scientific | 13-812-18 | |
| 140 mL syringe | Kendall Healthcare Monoject | 8881114030 | Ensure there is a luer lock. |
| IX71 Inverted light microscope | Olympus | IX71 | |
| Retiga-2000R microscope camera | QImaging | RET-2000R-F-M-12 | |
| Accusizer 780A Autodilution | PSS-NICOMP Particle Sizing Systems | Out of production |
References
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