Tillverkning av Koncentrerad, Lipid-baserade Oxygen mikrobubblor Emulsioner av hög Shear Homogenisering och Serial Koncentration

Summary

Vi beskriver metoder för tillverkning av stora volymer av lipidbaserade syremikrobubblor (LOM) avsedda för intravenös syreavgivning med hjälp av hög skjuvning homogenisering och seriell koncentration.

Abstract

Gasfyllda mikrobubblor har utvecklats som ultraljuds kontrast och drogleveransmedel. Mikrobubblor kan framställas genom behandling av tensider med användning av sonikering, mekanisk agitation, mikrofluidikanordningar eller homogenisering. Nyligen har lipid-baserade syremikrobubblor (LOM) utformats för att leverera syre intravenöst under medicinska akutfall, vända livshotande hypoxemi, och förhindra efterföljande organskada, hjärtstillestånd och död. Vi presenterar metoder för att skala upp produktionen av högt syresatta mikrobubblor med en sluten slinga med hög skjuvning homogenisator. Processen kan producera 2 L av koncentrerade LOM (90 volym%) i 90 min. Resulte bubblor har en medeldiameter på ~ 2 ^ m, och en reologisk profil som överensstämmer med den i blodet vid utspädning till 60 volym%. Tekniken ger LOM i hög kapacitet och med hög syrerenhet, vilket tyder på att denna teknik kan vara användbar för translationforskningslaboratorier.

Introduction

Mikrobubblor som består av protein, polymer, och lipid skal har utvecklats som vektorer för drogleverans, genterapi, och ultraljudkontrastmedel ^1-5. Eftersom dessa terapeutiska användningar kräver intravaskulär mikrobubblor uthållighet är sådana mikrobubblor vanligtvis fylld med inerta, hög molekylvikt gaser som perfluorkarboner ^6, som har låg löslighet i blod och stabilisera bubblan ^3,4.

Nyligen har lipid-baserade syremikrobubblor (LOM) utformats för att ge terapeutiska doser av syre, vilket kan bevara slutorgansyrgastillförsel och förhindrar hemodynamisk instabilitet under perioder av luftvägsobstruktion eller hypoxemi ^7. Emulsioner avsedda för intravenös gastillförsel kräver olika konstruktionsegenskaper än de som används för ultraljudkontrastmedel eller målstyrning av läkemedel. Först, eftersom kroppen förbrukar stora mängder syrgas (~ 200 ml / min), LOM måste produceras ochinjiceras i stor skala. Detta kräver att tillverkningsprocessen vara effektiv. För det andra bör tillverkningsprocessen vara sluten slinga i syfte att undvika kontaminering av kväve genom exponering av LOM (som bör vara fylld med 100% syre) för omgivande luft. För det tredje, eftersom syftet med LOM är intravenös gas leverans, gas bråkdel av LOM bör maximeras, erkänner de begränsningar som emulsionsviskositeten ^7. Slutligen, som med alla intravenösa injicerbara, är avgörande för att undvika mikrovaskulär obstruktion ⁸ exakt kontroll över partikelstorleksfördelning.

Det finns flera etablerade metoder för mikrobubblor tillverkning. Sonikering använder hög intensitet, appliceras lågfrekvent ultraljud för att luft-vätskegränsytan av en emulsion, som innefattar ett ytaktivt medel, såsom en amfipatisk fosfolipid, i närvaro av en gas som luft för att alstra mikrobubblor ^7,9. Denna process kan styras genom att variera ultraljudfrekvens, makt och pulslängd, och den resulterande storleksfördelningen kan skräddarsys för att producera mikrobubblor av en viss storleksfördelning, även om ultraljudsbehandling används sällan vid tillverkning av kliniskt använda mikrobubblor. Sammanslagning är intensiv mekanisk omröring av ett ytaktivt medel och gas i ett slutet system, som också är svåra att skala upp för att rymma stora volymer ^2. Droplet-baserade mikroflödes ger exakt kontroll av mikrobubblor storleksfördelning ^10-13. Även traditionellt svårt att skala upp, flera kanaler, höghastighets mikrofluidik har beskrivits som ökar mikrobubblor produktionseffektivitet ^13. Mikrobubblor som tillverkas med hjälp av någon av dessa metoder kan kräva efter tillverkning storleksreduktionsprocesser, såsom centrifugal fraktione ^14,15 och mikrobubblor flotation ^16,17.

En annan etablerad metod för framställning av mycket stabila mikrobubblor är skjuvning homogenization ^6, vilket kan resultera i en stabiliserande sexkantiga fosfolipid mönstret på den mikrobubbelytan ^18. Att bygga på detta koncept, beskriver vi införlivandet av en hög skjuvning sator in-line för att skapa självorganiserande LOM ^19. I denna process utnyttjar homogeniseringsanordningen snabbt roterande knivar i nära anslutning till dubbla finmaskigt emulsor skärmar, skapar hög mekanisk och hydraulisk sax för att skapa mikrobubblor. Seriell koncentration av lipidemulsionen genom detta system ger en alltmer koncentrerad gasfraktion, vilket kan ytterligare koncentreras genom centrifugering.

Protocol

1. System Set-up Systemet består av ett jordbruksföretag och koncentrera tank (HCT) utrustad med en enda scen blandare, en hög skjuvning sator in-line, en rullpump för att flytta vätska mellan HCT och homogenisator och en värmeväxlare (Figur 1). Placera en steriliserad, vid mynning 4 L glasuppsamlingskärl försedd med 2 bas-portar och 3 sidoportar nedanför den enda scenen blandaren. Sänk blandarhuvudet till munnen av fartyget och garantera en gastät mon…

Representative Results

Hög skjuvning homogenisering möjliggör effektiv (dvs inom en eftermiddag) produktion av tillräckliga LOM för en djurstudie och inte kräver teknisk expertis. När skicklig, kan tillverkas upp till 2 liter koncentrerade LOM i 90 min. Mikrobubblor storlek och morfologi bedömdes genom ljusmikroskop och genom ljus förmörkelse. När ett prov av LOM 10 jil visualiserades gjordes sfäriska LOM noteras, liksom en relativ brist på lipid-rester (fig 3A). Detta är s?…

Discussion

De viktigaste stegen för att skapa koncentrerade, starkt syre LOM är: 1) se till att det fria utrymmet i HCT förblir fullt syresatt; 2) se till att renheten hos de lipid hjälpämnena är optimal (inklusive villkor och användning av GMP produkter förvaring); 3) se till att de pulveriserade lipider blandas helt med vattenfasen före grundning av systemet; och 4) mycket uppmärksamma på den ökade gas-fraktionen inom HCT att volymfraktionen av gas inte överstiger 70%.

Den metod som vi b…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)	Avanti Polar Lipids	770365	Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080)
Cholesterol	Sigma Aldrich	C75209
Plasma-Lyte A	VWR	80089-818	Alternatively can use NaCl
Glass collection vessel	Specialty Glass, Inc.	Custom	Contact: Pam Zurbrick – 281-595-2210
Gas composition (oxygen) monitor	Precision Medical	PM5900L
Sarns 8000 roller pump	Calicut Medical	16407	Part of a modular perfusion system
BIOtherm Heat Exchanger	Medtronic	ECMOtherm-II
Verso laboratory in-line mixer	Silverson Machines, Inc	TH-IL-102-VERSO	Use multistage workheads and front-end extension with T piece
T-piece for Silverson Verso inlet port	Process Innovations	Custom	Contact: Brian Leavitt – 508-423-2266
L5M-A laboratory mixer	Silverson Machines, Inc	NC0136483	Use mesh emulsor screen (fine)
Rochester-Ochsner toothed forceps	Fisher Scientific	13-812-18
140 mL syringe	Kendall Healthcare Monoject	8881114030	Ensure there is a luer lock.
IX71 Inverted light microscope	Olympus	IX71
Retiga-2000R microscope camera	QImaging	RET-2000R-F-M-12
Accusizer 780A Autodilution	PSS-NICOMP Particle Sizing Systems	Out of production