Summary
نحن تصف أساليب لتصنيع كميات كبيرة من الدهون على أساس microbubbles الأكسجين (LOMs) مصممة للتسليم الأوكسجين عن طريق الوريد باستخدام التجانس عالية القص وتركيز المسلسل.
Abstract
وقد وضعت microbubbles مليئة بالغاز مثل الموجات فوق الصوتية وكلاء النقيض تسليم المخدرات. يمكن أن تنتج عن طريق معالجة Microbubbles السطحي باستخدام صوتنة، والإثارة الميكانيكية، وأجهزة ميكروفلويديك، أو التجانس. مؤخرا، تم تصميمها على أساس الدهون microbubbles الأكسجين (LOMs) لتسليم الأكسجين عن طريق الوريد أثناء حالات الطوارئ الطبية، وعكس نقص الأكسجة التي تهدد الحياة، ومنع الإصابة اللاحقة الجهاز، وتوقف القلب والموت. نقدم طرق لإنتاج مصغرة تتكون من microbubbles الاوكسيجين للغاية باستخدام حلقة مغلقة عالية القص الخالط. عملية يمكن أن تنتج 2 L من LOMs المركزة (90٪ من حيث الحجم) في 90 دقيقة. فقاعات الناتجة لديها قطر متوسط ~ 2 ميكرون، والتشكيل rheologic يتفق مع الدم عندما تضعف إلى 60٪ حجم. هذه التقنية تنتج LOMs في قدرة عالية وعالية النقاء مع الأكسجين، مما يشير إلى أن هذه التقنية قد تكون مفيدة لمختبرات البحوث متعدية.
Introduction
وقد وضعت Microbubbles تتكون من البروتين، والبوليمر، وقذائف الدهون كذلك ناقلا لتسليم المخدرات، والعلاج الجيني، وعوامل التباين الموجات فوق الصوتية 1-5. لأن هذه الاستخدامات العلاجية تتطلب استمرار microbubble داخل الأوعية الدموية، وتمتلئ هذه microbubbles عادة مع الخاملة، الغازات عالية الوزن الجزيئي مثل الهيدروكربونات المشبعة بالفلور 6، والتي لها قدرة منخفضة على الذوبان في الدم واستقرار 3،4 فقاعة.
مؤخرا، تم تصميمها على أساس الدهون microbubbles الأكسجين (LOMs) لتقديم الجرعات العلاجية من الأكسجين، والذي حفظه نهاية الجهاز تسليم الأوكسجين والدورة الدموية منع عدم الاستقرار خلال فترات انسداد مجرى الهواء أو نقص الأكسجة 7. المستحلبات مصممة للتسليم الغاز في الوريد تتطلب ميزات تصميم تختلف عن تلك المستخدمة لعوامل التباين الموجات فوق الصوتية أو تسليم المخدرات المستهدفة. أولا، لأن الجسم يستهلك كميات كبيرة من غاز الأكسجين (~ 200 مل / دقيقة)، يجب أن تنتج LOMs وحقن على نطاق واسع. هذا يتطلب أن عملية التصنيع تكون فعالة. ثانيا، ينبغي أن تكون عملية التصنيع حلقة مغلقة من أجل تجنب التلوث النيتروجين من خلال التعرض لLOMs (التي ينبغي أن تملأ مع 100٪ من الأكسجين) إلى الهواء المحيط. الثالثة، وذلك لأن الغرض من LOMs هو تسليم الغاز في الوريد، يجب أن يكون الحد الأقصى جزء من الغاز LOMs، مع الاعتراف القيود التي تفرضها مستحلب اللزوجة 7. أخيرا، كما هو الحال مع أي حقن في الوريد، مراقبة دقيقة على توزيع حجم الجسيمات هو ضروري لتجنب انسداد الاوعية الدموية الدقيقة 8.
هناك العديد من الطرق التي أنشئت لتصنيع microbubble. صوتنة يستخدم كثافة عالية، وتطبيق الموجات فوق الصوتية ذات التردد المنخفض إلى واجهة الهواء السائل من مستحلب الذي يتضمن السطحي، مثل فوسفورية متقابلة الزمر، في وجود فراغ الرأس الغاز لإنتاج microbubbles 7،9. هذه العملية يمكن السيطرة عليها من خلال تغيير فائقةتردد الصوت والقوة ومدة النبضة، وتوزيع حجم الناتج يمكن أن تكون مصممة لإنتاج microbubbles لتوزيع حجم معين، على الرغم من صوتنة ونادرا ما يستخدم في صناعة microbubbles المستخدمة سريريا. الدمج هو التحريض الميكانيكية مكثفة من السطحي والغاز في نظام مغلق، والذي هو أيضا من الصعب زيادة لاستيعاب كميات كبيرة 2. استنادا على microfluidics الحبرية، يسمح بالتحكم الدقيق في توزيع حجم microbubble 10-13. وإن كان من الصعب تقليديا لزيادة، متعدد القنوات، وقد وصفت على microfluidics عالية السرعة التي تزيد microbubble كفاءة الإنتاج 13. Microbubbles تصنيعها باستخدام أي من هذه الأساليب قد تتطلب عمليات تصنيع للحد من حجم آخر، مثل تجزئة الطرد المركزي و14،15 16،17 microbubble التعويم.
آخر بالطريقة المحددة لتصنيع microbubbles درجة عالية من الاستقرار هو homogeniz القصأوجه 6، والذي يمكن أن يؤدي إلى وجود نمط فوسفورية سداسية استقرار على سطح microbubble 18. بناء على هذا المفهوم، ونحن تصف التأسيس من القص عالية الخالط في خط لخلق LOMs الذاتي تجميع 19. في هذه العملية، ويستخدم الخالط الدورية بسرعة ريش على مقربة من غرامة شاشات شبكة emulsor المزدوج، وخلق عالية القص الميكانيكية والهيدروليكية لإنشاء microbubbles. تركيز المسلسل من مستحلب الدهون من خلال هذا النظام ينتج عن جزء الغاز تتركز على نحو متزايد، والتي يمكن حتى تتركز المزيد بواسطة الطرد المركزي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. نظام مجموعة المتابعة
ويتكون النظام من عقد والتركيز خزان (HCT) مزودة خلاط واحد المرحلة، والقص عالية الخالط في الخط، ومضخة الأسطوانة لنقل السوائل بين كليات التقنية العليا والخالط، ومبادل للحرارة (الشكل 1).
- وضع تعقيمها، الفم واسعة 4 L سفينة جمع الزجاج مزودة 2 الموانئ قاعدة و 3 منافذ جانبية تحت خلاط مرحلة واحدة. خفض الرأس إلى الفم خلاط السفينة وضمان تركيب الغاز محكم باستخدام الأختام المطاطية أو شريط (من أجل منع الهواء المحيط من تلويث الفضاء الرأس).
- تناسب واحدة من الموانئ قاعدة (الشكل 1، الميناء رقم 1) من كليات التقنية العليا مع العقيمة 3/8 "(ID) أنابيب واضحة، ما يقرب من 10" لفترة طويلة، مزودة محبس 3 الطريقة في الطرف عن مجموعة من مستحلب المركزة .
- تناسب ميناء القاعدة الثانية (الشكل 1، الميناء رقم 2) مع العقيمة 3/8 "(ID) أنابيب، approximatelذ 36 "في الطول. تتغذى هذه الأنابيب من خلال مضخة الأسطوانة. تناسب مدخل القص الخالط عالية مع T-قطعة من بينهم اثنان من الموانئ وربط على النحو التالي: ربط الأنابيب من ميناء رقم 2، من خلال مضخة الأسطوانة والاتصال إلى جانب منفذ T-قطعة. إرفاق منفذ آخر لدبابة الأكسجين باستخدام مقياس الجريان غاز الأكسجين المنخفضة تدفق.
- ربط ميناء منفذ من القص الخالط عالية لمدخل الميناء لمبادل الحرارة في خط الحفاظ على 4 درجات مئوية. ربط ميناء مخرج المبادل الحراري إلى ميناء عودة كليات التقنية العليا (الشكل 1، الميناء # 3)، وخلق نظام حلقة مغلقة.
- إرفاق خزان الأكسجين (عن طريق مقياس الجريان) إلى كليات التقنية العليا (الشكل 1، ومنفذ رقم 4). نعلق شاشة تكوين الغاز التي هي مفتوحة في الغلاف الجوي إلى ميناء العلوي من كليات التقنية العليا (الشكل 1، الميناء # 5).
- إذا كان المطلوب العقم، تعقيم مكونات الزجاج والمعدن قبل كل استخدام بواسطة الأوتوكلاف. تعقيم مكونات أنابيب وشارك البلاستيكnnectors بواسطة أكسيد الإيثيلين قبل كل استعمال. هذا أمر مهم خاصة إذا كان المنتج هو لفحصها في الجسم الحي.
2. تصنيع LOM
- وضع 20 غرام من 1،2-GMP distearoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (DSPC) و 10 غرام من الكولسترول في قاعدة كليات التقنية العليا. إضافة 1 لتر من البلازما LYTE ألف لكليات التقنية العليا واليد ضجة لمدة 1 دقيقة، ودمج أكبر قدر ممكن من المادة الدهنية في المرحلة المائية.
- خفض خلاط مرحلة واحدة في المرحلة المائية، وضمان أن رأسه خلاط كامل تغطيها المرحلة المائية. تأكد من أن الجزء العلوي من كليات التقنية العليا هو الغاز ضيق (انظر الخطوة 1.1 أعلاه) وأنه لا توجد منافذ جانبية مفتوحة. بدوره على مصدر الغاز تعلق على منفذ رقم 4 وانتظر حتى الكسر الأكسجين من فراغ الرأس HCT تصل> 95٪. في 10 لتر / دقيقة (LPM)، وهذا ينبغي أن تأخذ ~ 10 دقيقة.
- باستخدام خلاط مرحلة واحدة، ومزيج مستحلب السلائف لمدة 5 دقائق عند 5،000 دورة في الدقيقة. يجب أن تظهر الخليط الناتج أبيض شاحب ولا تحتوي على أية معهد العلوم الإندونيسي مرئيةد كتل. مرة واحدة مختلطة، ويمكن تخزين المياه غير المستخدمة خليط الدهون في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 30 يوما قبل استخدام مرة واحدة.
- رئيس كامل نظام حلقة مغلقة مع مستحلب السلائف عن طريق تشغيل المضخة الدوارة في 1.3 LPM. مرة واحدة وتستعد النظام، والحفاظ على المضخة عند 1.3 LPM.
- لبدء تصنيع LOMs، بدوره على القص عالية الخالط في خط ل7،500 دورة في الدقيقة. بعد ذلك مباشرة، بدوره على تدفق الأكسجين إلى جزء من مدخل الخالط عند 0.5 LPM. الحفاظ على خلاط مرحلة واحدة (في HCT) على 3،500 دورة في الدقيقة في. تتشكل LOMs في واجهة من ريش الدوار وشاشات emulsor ضمن الخالط في الخط (الشكل 2). في غضون دقائق، وينبغي أن تصبح أكثر لزوجة السائل بشكل واضح. نهج أكثر صرامة لتحديد اللزوجة بوصفها وظيفة من الوقت، والتي يمكن أن يتم عن طريق إزالة مأخوذة من ميناء 1 خلال تلفيق وتحليل مع جهاز قياس اللزوجة.
ملاحظة: إذا فقاعات الهواء مرئية موجودة في أنابيب الخروج من خلاط، والأكسجينتتدفق إلى الخالط في خط مرتفع جدا. عاير أسفل تدفق الغاز السائل حتى مبهمة ولا تحتوي على فقاعات الغاز مرئية. - تشغيل النظام لمدة 15 دقيقة، ثم إيقاف الخالط القص عالية ومدخل الأوكسجين إليها. الاستمرار في تشغيل الخلاط مرحلة واحدة في كليات التقنية العليا حتى تتم إزالة مستحلب؛ هذا يخفف مرحلة الانفصال وتحافظ على المنتج موحدة نسبيا في كليات التقنية العليا.
ملاحظة: حجم مستحلب مليئة بالغاز يجب زيادة حوالي 2-3X خلال مرحلة تركيز المسلسل. إذا لم يحدث ذلك، تحقق للتأكد من أن الأكسجين يتدفق في القص الخالط عالية وأن تركيزات الدهون في مستحلب السلائف صحيحة. كفاءة الإنتاج يتناقص كما يقلل تركيز الدهون.
3. جمع وتركيز، وتقييم، وتخزين LOMs
- إرفاق العقيمة، وتعديل 140 مل بالتركيبة قفل محبس حقنة لتعلق على المنفذ الأساسي رقم 1 على متن السفينة المجموعة. وضع 100 مل من السوائل. الغطاء بإحكام حقنة وتكرار حتى تمت إزالة جميع السوائل.
- تعديل الحقن من خلال سحب 100 مل من الهواء في حقنة ثم بالنشر قبالة الغطاس الزائدة والمواد حقنة فوق علامة مل 140. ملء والحقن الفارغة باستخدام ملقط مسنن لوضع المكبس. هذا التعديل يسمح أسهل الطرد المركزي.
- المحاقن الطرد المركزي مع نهاية توج المنحى النزولي في المبرد (4 º C) دلو الطرد المركزي في 225 x ج لمدة 10 دقيقة.
- وثلاث طبقات من المواد تظهر بعد الطرد المركزي. طرد الطبقة السفلية من المرحلة المائية الزائدة غائم وتجاهل. الطبقة الثانية هي بيضاء مشرقة ويحتوي LOMs المركزة. نقل الرغوة المركزة إلى حقنة الغاز غير منفذة باستخدام محبس ثلاثي لمنع التلوث الغاز المحيطة. تجاهل الطبقة النهائية، والذي يحتوي على غاز الأكسجين خالية من LOMs تمزق.
- ويمكن تقييم نوعية الرغوة من خلال الوصول ≥ الغاز 90٪ من الرغوة المركزة. Calculأكلت تركيز الغاز على النحو التالي:
حجم الغاز٪ = [(الوزن رغوة / رغوة حجم) - 1] × 100- كما لمراقبة الجودة الثاني، microbubbles حجم التعمية بواسطة الضوء لتحديد ما إذا كان حجم الجسيمات هو ضمن النطاق المتوقع. تجدر الإشارة إلى أن أي تغيير في الوقت التجانس أو صياغة قد يغير حجم الفقاعة.
- الغطاء بإحكام الحقنة الزجاج مع تركيب-بالتركيبة القفل. يمكن أن تضعف LOMs مركزة مع البلازما LYTE A في وقت الاستخدام. ويمكن تخزين المحاقن في 22، 4، أو -20 درجة مئوية؛ قد توفر درجات حرارة أكثر برودة وتعزيز الاستقرار الجرف الحياة 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عالية التجانس القص تمكن كفاءة (أي في غضون احدة بعد الظهر) إنتاج LOMs كافية لدراسة أجريت على الحيوانات و لا يتطلب خبرة تقنية. مرة واحدة يتقن، لتصل إلى 2 لتر من LOMs المركزة يمكن تصنيعها في 90 دقيقة.
تم تقييم حجم Microbubble والتشكل بواسطة المجهر الضوئي والتعمية ضوء. عندما تصور عينة 10 ميكرولتر من LOMs، لوحظت LOMs كروية، فضلا عن ندرة النسبية الحطام الدهون (الشكل 3A). هل هذا صحيح خصوصا عندما يتم استخدام المنتج GMP. عندما تم تقييم نفس العينة من LOMs بواسطة التعمية ضوء، وكان قطرا الجسيمات يعني 2.624 ± 0.332 ميكرون (SD). كانت أكبر من 90٪ من LOMs <10 ميكرون في القطر، وكان عدد السكان polydisperse (الشكل 3B).
كان مستحلب اللزوجة تعتمد اعتمادا كبيرا على جزء الغاز (وبالتالي على تركيز microbubble). اثنين مل مأخوذةمن LOMs تركيزات غازات متفاوتة درست باستخدام حالة مستقرة تدفق الاجتياح باستخدام 40 مم موازية الهندسة وحة كما تباينت التوتر بين 0.1 إلى 10،000 μN · م. جميع الكسور الغاز لومي يظهرون سلوكا القص رقيق، وكان هذه الظاهرة أكثر وضوحا في الكسور الغاز العالي. LOMs تحتوي على الغاز 60٪ حجم عرضت لمحة الريولوجية مماثلة للدم (الشكل 4A).
أخيرا، تم اختبار محتوى الأكسجين (بما في ذلك الغاز وتركيز جزء كسري من الأوكسجين) من LOMs بإضافة كميات متفاوتة من الأكسجين الوارد في غضون 60٪ حجم LOMs إلى مأخوذة من دم الإنسان مشبع مع وجود عجز الأكسجين معروفة. كما هو موضح سابقا، يمكن حساب محتوى الاكسجين من LOMs من الزيادة في تركيز الأوكسي هيموغلوبين 7. كانت العلاقة بين حجم الأكسجين المضافة داخل LOMs والزيادة الحجمية في محتوى الأكسجين في الدم 1.053 ± 0.03025 (SD) (95٪ CI = ،9865-1،120) (الشكللدى عودتهم 4B)، مما يوحي بأن LOMs اختبار الواردة يقرب من 100٪ الأكسجين، وعرضت بضعة جيوب الغاز المحاصرين (التي لا نقل كفاءة الأكسجين إلى الدم، ولكن تطفو بها على وجه السرعة)، ونقل بشكل فعال على كامل حمولة الأكسجين إلى الدم البشري في المختبر.
الشكل 1. تصنيع الإعداد التخطيطي. ويتم إنتاج LOMs باستخدام في سطر، وارتفاع القص الخالط في نظام حلقة مغلقة. تقام LOMs ضمن عقد والتركيز خزان (HCT) في إطار خلط مستمر. يتم نقل مستحلب من خلال نظام باستخدام مضخة الدوارة. تتم إزالة الحرارة المتولدة من الخالط باستخدام مبادل حراري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. </ أ>
الشكل 2. التجميع الذاتي من داخل LOMs غرامة شبكة الشاشة emulsor. A) A شفرة الدورية بسرعة يمر فوق غرامة شبكة الشاشة emulsor، وخلق تأثير سيفون الذي يرسم في المراحل المائية والغاز. تتشكل فقاعات الأكسجين صغيرة قبل القص، وتحيط بسرعة عن طريق ذيول الدهون مسعور من الدهون الفوسفاتية متقابلة الزمر، وخلق فقاعة مملوءة بالغاز الذاتي تجميع (B).
الرقم 3. توصيف LOMs. أ) صورة مجهرية ممثل LOMs كروية واظهار حجم التوزيع polydisperse. شريط النطاق =10 ميكرون. ب) توزيع حجم LOMs وفقا لتقييم التعمية ضوء. البيانات = يعني الخطأ = SEM.
الشكل 4. خصائص LOMs بالطرد المركزي ومركزة. A) وصورة الريولوجية من مستحلب لومي في 60، 70 و 90 الغاز حجم٪. التخفيف من الرغوة المركزة إلى الغاز 60٪ حجم تعطي الشخصي الريولوجية مماثلة إلى دم الإنسان (الهيماتوكريت 40٪). البيانات = يعني الخطأ = SEM. ب) العلاقة بين محتوى الأكسجين من LOMs تضاف إلى دم الإنسان والزيادة في قياس محتوى الاكسجين من الدم. البيانات = يعني الخطأ = SEM، سطر = الانحدار الخطي مع 95٪ CI من الخط أفضل مناسبا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أهم الخطوات لخلق المركزة، LOMs الاوكسيجين للغاية وتشمل: 1) التأكد من أن فراغ الرأس داخل كليات التقنية العليا لا تزال الاوكسيجين تماما؛ 2) ضمان نقاء السواغات الدهون هو الأمثل (بما في ذلك ظروف التخزين واستخدام منتجات GMP)؛ 3) ضمان أن الدهون مسحوق مزيج تماما مع المرحلة المائية قبل فتيلة النظام؛ و4) إيلاء اهتمام وثيق لزيادة نسبة الغاز في كليات التقنية العليا للتأكد من أن جزء من حجم الغاز لا يتجاوز 70٪.
طريقة وصفنا هنا يستخدم عالية التجانس القص لخلق microbubbles جوفاء. يتم تعليق الدهون متقابلة الزمر مع المرحلة المائية، والذي يستخدم لحمل الدهون في الخالط في الخط. تستخدم الدهون GMP الصف لفي الدراسات المجراة، ويفضل عموما لأنها تحتوي على عدد أقل من المجاميع الدهون والشوائب. الدهون هي أيضا عرضة للأكسدة الدهون (وخاصة عند تخزينهاضمن السوائل الاوكسيجين) والتلوث الجرثومي. تتشكل عندما LOMs ذيول مسعور ترتيب microbubbles غاز الأكسجين في جميع أنحاء الصغيرة التي تم إنشاؤها ضمن الخالط في الخط (الشكل 2). المجانسة LOMs في 7،500 دورة في الدقيقة يخضع للضغوط الميكانيكية microbubbles إضافية كما يتم المضروب أنها بين نصائح من ريش الدوار والجدار الداخلي للالموالي. الخضوع LOMs أيضا القص الهيدروليكية لأنهم مضطرون بسرعة عالية من خلال شاشة فائقة غرامة شبكة emulsor، وكذلك الحد حجم الجسيمات. قوى القص توليد الحرارة داخل الخالط في خط ومحليا في خلاط مرحلة واحدة؛ مبادل الحرارة في الخط قبل العودة إلى كليات التقنية العليا ضروري لإزالة هذه الحرارة. عدم وجود مبادل حراري قد رفع درجات حرارة أعلى من درجة حرارة التحول المرحلة من الدهون (55 درجة مئوية لمدة DSPC)، مما يزيد من سيولة من الدهون والنتائج في خسارة المنتج. إنشاء مستحلب ضمن مغلقة، في خط يضمن الجهاز الذي الاوكسجين النقيأدرج ن في صلب LOM عن طريق منع تلوث الهواء. علاوة على ذلك، يتعرض باستمرار لLOMs مع فراغ الرأس الغازية من كليات التقنية العليا. وبالتالي فإنه لا بد من التأكد من أن تأثير شفط إنشاؤها بواسطة خلاط مختبر داخل كليات التقنية العليا لا يخلق تحولا في تدفق الهواء من الجو في كليات التقنية العليا (من خلال رصد تكوين الغاز، والتي هي مفتوحة للمناخ لمنع الضغط من HCT) . معدلات تدفق غاز الأكسجين وصفها هنا ينبغي أن يكون كافيا لمنع هذه الظاهرة.
إعادة التدوير من مستحلب من خلال الخالط في الخط خلال المرحلة تركيز المسلسل يخلق LOMs إضافية من "غير المستخدمة" الفوسفورية المتبقية في المرحلة المائية، وأيضا يخضع LOMs سليمة لتقطيع المتكررة، والتي قد مزيد من الانخفاض حجم الجسيمات. قد يكون حجم الجسيمات والغاز تركيز بالتالي مصممة عن طريق ضبط السرعات خلاط، emulsor الشاشات، وحجم شبكة، ووقت التشغيل (أي مدة من المسلسل جoncentration الخطوة). الإثارة الميكانيكية تنتج توزيع حجم polydisperse. يسمح توزيع حجم التعبئة واسعة لتشديد من microbubbles، وبالتالي زيادة الحد الأقصى مغلفة جزء الغاز في حجم معين من الرغوة. تغيير الكيمياء صياغة بواسطة إدراج عوامل تعزيز اللزوجة يمكن استخدامها لإنشاء توزيع حجم أكثر تجانسا اذا شئت. وقد وجدنا أن وقت التشغيل من 15 دقيقة هو الأكثر مثالية؛ كما يزيد من تركيز microbubble، يصبح مستحلب لزج على نحو متزايد. بمجرد أن تصل إلى اللزوجة الحرجة، فإنه لم يعد يضخ نحو فعال باستخدام مضخة الدوارة. هذا يسبب الغاز الحر بالمرور عبر الخالط دون أن تدمج LOMs ويمكن رؤية داخل الأنابيب واضحة. في هذه المرحلة، ونحن عموما انتخاب لوقف خطوة تركيز المسلسل، على الرغم إذا رغبت، ومعدل تدفق الغاز في الخالط في خط يمكن انخفضت ويمكن زيادة معدل تدفق المضخة الدوارة لخلق الكسور الغاز العالي. ومع ذلك، غاية زجةو المستحلبات تتطلب المزيد من القوة لسحب في المحاقن للخطوة الطرد المركزي، ويمكن أن يقلل من العائد من هذه العملية.
وقد تيسر الخطوة الطرد المركزي عن طريق تعديل 140 مل المحاقن لاقتطاع الغطاس وقاعدة من الحقنة، بحيث تشكل المحاقن المعبأة حتى اسطوانة. هذا يسهل كثيرا التحميل والتفريغ من المحاقن في أجهزة الطرد المركزي. بعد الطرد المركزي، وتحتوي على الحقن عادة ثلاث طبقات. أكثف طبقة (بالقرب من طرف الحقنة عندما يتم تحميل المحاقن الأنف إلى أسفل) يحتوي على الدهون الفوسفاتية غير المستخدمة والجزء الأكبر من المرحلة المائية. في بعض الحالات، غائم كليا "الحطام" يمكن أن ينظر إليه في إطار طرف الحقنة التي عادة ما تحتوي على كتل الدهون. للتجارب الأساسية، ويمكن إعادة استخدامها محتويات هذه 'المرحلة المائية' لتجارب لاحقة، على الرغم من أننا قد وجدت أن هذا يقلل بدرجة كبيرة من كفاءة هذه العملية. (وللتقليل من هذه المشكلة، قد السواغات فوسفورية إضافيةتضاف إلى مستحلب السلائف المعاد تدويرها، مع الحرص على الحفاظ على نسبة المولي كل سواغ) وطبقة وسطى داخل كل حقنة هو مشرق الأبيض ويحتوي LOMs المركزة. عادة هناك خط حاد في ترسيم الحدود بين القاع والطبقات المتوسطة. وطبقة وسطى من كل حقنة ويمكن الجمع بين لمزيد من المعالجة كما هو موضح أدناه. يحتوي على الطبقة العليا رغوة رقيق تحتوي على الغاز الحر من LOMs كسر في جميع مراحل عملية التصنيع. وعادة ما يتم تجاهل الطبقات العليا والسفلي. أثناء الطرد المركزي، فمن المهم التأكد من أن كل حقنة تغطيها قبعة ضيقة حقنة من أجل منع قذف من مستحلب في أجهزة الطرد المركزي أثناء معالجة. الطرد المركزي بسرعات أعلى كانت محدودة من قبل قوة سحق من المحاقن التي استخدمناها. إذا لزم الأمر لتحقيق حاد خط الحدود بين طبقات القاع والوسط (عادة عندما يجري طرد المستحلبات التي تحتوي على نسبة عالية الغاز)، يمكن للزمن أن يكون الطرد المركزيالموسعة. استخدام، محبس 3 في اتجاه والغاز محكم على الجمع بين LOMs المركزة مفيد لمنع تلوث الهواء. من المهم أيضا لضمان أن LOM التي تحتوي على المحاقن يتم الاحتفاظ دائما توج ويتم طرد أي الهواء المحيط على الفور. للحد من تلوث الهواء أثناء التخزين، يجب أن تكون مختومة المحاقن مع قبعات بالتركيبة قفل فقط. ومن المعروف المحاقن البلاستيكية ليكون الغاز قابلة للاختراق، لذلك الزجاج أو المعدن الحقن هي الأفضل لتخزين على المدى الطويل.
كما هو موضح أعلاه، والمستحلبات يتعرض إلى الخطوة تركيز المسلسل لمدة 15 دقيقة تظهر عادة الغاز 70٪ من حيث الحجم ويمكن أن تتركز على الغاز 90٪ عن طريق الطرد المركزي. حتى لو كان المطلوب 70٪ حجم مستحلب في النهاية، وجدنا أن تكون مفيدة الطرد المركزي لإزالة الدهون الفوسفاتية التي لم يتم إدراجها في LOMs من التركيز. هذا ويمكن أيضا أن يتحقق من خلال السماح للوقوف بين عشية وضحاها المستحلبات لتحقيق مرحلة الانفصال. لفي التجارب المجراة، ونحن في كثير من الأحيان تمييع المركزةLOMs مع البلازما LYTE A، مزيج بلطف، ثم الطرد المركزي مرة أخرى لإزالة الدهون الفوسفاتية غير المستخدمة إضافية وغيرها من الحطام. هذه الخطوة يمكن أن يتكرر عدة مرات حسب الحاجة لإزالة الزائدة الحطام الدهون. حقن الدهون الفوسفاتية التي لم يتم إدراجها في LOMs غير مرغوب فيه بسبب الحمل الدهون الإضافية التي نقلها في تحديد معدل ضخ عالية.
لقد تم العثور على العديد من المخاطر المشتركة لتجنب هذا في عملية التصنيع. أولا، ينبغي أن تكون السواغات الدهون الطازجة وتخزينها في -80 درجة مئوية، وعدم استخدامها إذا انتهت صلاحيتها. لا ينبغي استخدامها الحل السلائف لفي الدراسات المجراة، كما أدى المستحلبات لا تتفق في حجمها وتوزيع جزء الغاز القصوى، وربما تحتوي على الملوثات البكتيرية والدهون المؤكسدة، أو كتل الدهون. الثانية، وبمجرد أن تصل إلى مستحلب 'اللزوجة حرجة "أثناء تصنيع، فإنه لم يعد من الممكن ضخ نحو فعال من خلال النظام، وسوف جيوب الغاز الكبيرة تشكل داخل HCT. مستحلب اللزوجة العالية أيضا يجعل من مستحلب من الصعب التعامل معها ووضع في المحاقن. من الأفضل تجنب هذه المشاكل من خلال قياس الزيادة في نسبة غاز داخل كليات التقنية العليا (عن طريق قياس الزيادة في حجم كما يزيد نسبة الغاز) ووقف عملية تركيز المسلسل مرة واحدة في الزوجي حجم الانطلاق.
واحد الحد الرئيسية لهذه التقنية هو الحاجة المستمرة للخطوة الطرد المركزي، وهو غير مرغوب فيه لأنه يخلق إمكانية الهواء والتلوث الجرثومي من المنتج النهائي، ويمنع هذا من أن يكون عملية مستمرة. في المستقبل، قد يتم تعديل الخطوة تركيز المسلسل في نظام خطوة واحدة لصنع المخدرات التجارية من خلال استخدام نظام التفريغ الهيدروليكي لتفادي الحاجة إلى الطرد المركزي دفعات. يمكن أن تكون ملفقة الخالط في خط وخلاطات المختبرات مع 3/16 الفولاذ المقاوم للصدأ وتعقيمها في المكان. إدراج الغازات الأخرى في النظام قد توسيع الفائدة (ه) من هذه التقنية كذلك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
التمويل: الجيش الأمريكي البحوث الطبية وقيادة العتاد (USAMRMC) ويديره التطبيب عن بعد ومركز بحوث تكنولوجيا متقدمة. ساهم Shunxi جي التعديل من الحقن كما هو موضح هنا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 770365 | Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080) |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C75209 | |
| Plasma-Lyte A | VWR | 80089-818 | Alternatively can use NaCl |
| Glass collection vessel | Specialty Glass, Inc. | Custom | Contact: Pam Zurbrick - 281-595-2210 |
| Gas composition (oxygen) monitor | Precision Medical | PM5900L | |
| Sarns 8000 roller pump | Calicut Medical | 16407 | Part of a modular perfusion system |
| BIOtherm Heat Exchanger | Medtronic | ECMOtherm-II | |
| Verso laboratory in-line mixer | Silverson Machines, Inc | TH-IL-102-VERSO | Use multistage workheads and front-end extension with T piece |
| T-piece for Silverson Verso inlet port | Process Innovations | Custom | Contact: Brian Leavitt - 508-423-2266 |
| L5M-A laboratory mixer | Silverson Machines, Inc | NC0136483 | Use mesh emulsor screen (fine) |
| Rochester-Ochsner toothed forceps | Fisher Scientific | 13-812-18 | |
| 140 ml syringe | Kendall Healthcare Monoject | 8881114030 | Ensure there is a luer lock. |
| IX71 Inverted light microscope | Olympus | IX71 | |
| Retiga-2000R microscope camera | QImaging | RET-2000R-F-M-12 | |
| Accusizer 780A Autodilution | PSS-NICOMP Particle Sizing Systems | Out of production |
References
- Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5 (11), 2161-2170 (2009).
- Ren, J. L., et al. A Novel Ultrasound Microbubble Carrying Gene and Tat Peptide: Preparation and Characterization. Academic Radiology. 16 (12), 1457-1465 (2009).
- Tinkov, S., et al. Microbubbles as Ultrasound Triggered Drug Carriers. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (6), 1935-1961 (2009).
- Hernot, S., Klibanov, A. L. Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (10), 1153-1166 (2008).
- Lanza, G. M., et al. A novel site-targeted ultrasonic contrast agent with broad biomedical application. Circulation. 94 (12), 3334-3340 (1996).
- Cavalli, R., et al. Preparation and characterization of dextran nanobubbles for oxygen delivery. International Journal of Pharmaceutics. 381 (2), 160-165 (2009).
- Kheir, J. N., et al. Oxygen Gas-Filled Microparticles Provide Intravenous Oxygen Delivery. Science Translational Medicine. 4 (140), (2012).
- Lindner, J. R., et al. Microvascular rheology of definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration. Journal of the American Society of Echocardiography. 15 (5), 396-403 (2002).
- Zhao, Y. Z., et al. Preparation, characterization and in vivo observation of phospholipid-based gas-filled microbubbles containing hirudin. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (9), 1237-1243 (2005).
- Seo, M., et al. Microfluidic Assembly of Monodisperse, Nanoparticle-Incorporated Perfluorocarbon Microbubbles for Medical Imaging and Therapy. Langmuir. 26 (17), 13855-13860 (2010).
- Wan, J. D., Stone, H. A. Coated Gas Bubbles for the Continuous Synthesis of Hollow Inorganic Particles. Langmuir. 28 (1), 37-41 (2012).
- Duncanson, W. J., et al. Monodisperse Gas-Filled Microparticles from Reactions in Double Emulsions. Langmuir. 28 (17), 6742-6745 (2012).
- Kendall, M. R., et al. Scaled-Up Production of Monodisperse, Dual Layer Microbubbles Using Multi-Array Microfluidic Module for Medical Imaging and Drug Delivery. Bubble Science Engineering and Technology. 4 (1), 12-20 (2012).
- Szijjarto, C., et al. Effects of Perfluorocarbon Gases on the Size and Stability Characteristics of Phospholipid-Coated Microbubbles: Osmotic Effect versus Interfacial Film Stabilization. Langmuir. 28 (2), 1182-1189 (2012).
- Rossi, S., Waton, G., Krafft, M. P. Phospholipid-Coated Gas Bubble Engineering: Key Parameters for Size and Stability Control, as Determined by an Acoustical Method. Langmuir. 26 (3), 1649-1655 (2010).
- Swanson, E. J., et al. Phospholipid-Stabilized Microbubble Foam for Injectable Oxygen Delivery. Langmuir. 26 (20), 15726-15729 (2010).
- Kvåle, S., et al. Size fractionation of gas-filled microspheres by flotation. Separations Technology. 6 (4), 219-226 (1996).
- Dressaire, E., et al. Interfacial polygonal nanopatterning of stable microbubbles. Science. 320 (5880), 1198-1201 (2008).
- Kheir, J. N., et al. Bulk Manufacture of Concentrated Oxygen Gas-Filled Microparticles for Intravenous Oxygen Delivery. Advanced Healthcare Materials. , (2013).
