Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Fremstilling af koncentreret, Lipid-baserede Oxygen Microbubble Emulsioner af High Shear Homogenisering og Serial Koncentration

doi: 10.3791/51467 Published: May 26, 2014

Summary

Vi beskriver metoder til fremstilling af store mængder lipid-baserede ilt mikrobobler (LOMs) beregnet til intravenøs ilttilførsel ved hjælp af high-shear homogenisering og serienummer koncentration.

Abstract

Gasfyldte mikrobobler er udviklet som ultralyd kontrast og drug delivery agenter. Mikrobobler kan fremstilles ved behandling af overfladeaktive midler ved hjælp af sonikering, mekanisk omrøring, mikrofluide anordninger eller homogenisering. For nylig har lipid-baserede ilt mikrobobler (LOMs) er designet til at levere ilt intravenøst ​​i løbet af ulykkestilfælde, vende livstruende hypoxæmi og forhindre efterfølgende orgel skade, hjertestop og død. Vi præsenterer metoder til opskaleret produktion af stærkt iltet mikrobobler ved hjælp af et lukket kredsløb high-shear homogenisator. Processen kan producere 2 L af koncentrerede LOMs (90 volumen%) i 90 minutter. Resulterende bobler har en gennemsnitlig diameter på ~ 2 um og en rheologisk profil i overensstemmelse med den af ​​blod, når den fortyndes til 60 volumen%. Denne teknik producerer LOMs i høj kapacitet og med høj ilt renhed, hvilket tyder på, at denne teknik kan være nyttige for translationelle forskningslaboratorier.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mikrobobler bestående af protein, polymer og lipid skaller er blevet udviklet som vektorer for drug delivery, genterapi, og ultralyd-kontrastmidler 1-5. Fordi disse terapeutiske anvendelser kræver intravaskulære mikrobobler vedholdenhed er sådanne mikrobobler almindeligvis fyldt med inerte, høje molekylvægt gasser såsom perfluorcarboner 6, der har lav opløselighed i blod og stabilisere boblen 3,4.

For nylig har lipid-baserede ilt mikrobobler (LOMs) er designet til at levere terapeutiske doser af ilt, der kan bevare slutorganet ilttilførsel og forhindre hæmodynamisk ustabilitet i perioder med luftvejsobstruktion eller hypoxæmi 7. Emulsioner designet til intravenøs gas levering kræver forskellige design funktioner end dem, der anvendes til ultralyd kontraststoffer eller målrettede drug delivery. Først, fordi kroppen forbruger store mængder ilt gas (~ 200 ml / min), LOMs skal produceres oginjiceret på en stor skala. Dette kræver, at fremstillingsprocessen være effektiv. For det andet bør fremstillingsprocessen være lukket kredsløb for at undgå kontaminering nitrogen gennem eksponering LOMs (som skal fyldes med 100% oxygen) til den omgivende luft. For det tredje, fordi formålet med LOMs er intravenøs gas levering, gas fraktion af LOMs skal maksimeres, anerkender de begrænsninger, som emulsion viskositet 7. Endelig, som med enhver intravenøs injektion, præcis kontrol over partikelstørrelsesfordeling er afgørende for at undgå mikrovaskulære obstruktion 8.

Der er flere etablerede metoder til mikrobobler fremstillingen. Lydbehandling udnytter høj intensitet, lavfrekvente ultralyd påføres luft-væske-grænsefladen af en emulsion, der omfatter et overfladeaktivt middel, såsom et amfipatisk phospholipid, i nærvær af en gas headspace at fremstille mikrobobler 7,9. Denne proces kan styres ved at variere ultralyd frekvens, effekt og puls varighed, og den resulterende størrelse fordelingen kan skræddersyes til at producere mikrobobler af en bestemt størrelse distribution, selvom lydbehandling er sjældent anvendes til fremstilling af klinisk anvendte mikrobobler. Sammenlægning er intens mekanisk omrøring af et overfladeaktivt middel og gas i et lukket system, som også er vanskelig at skalere op til at rumme store mængder 2. Droplet-baserede MicroFluidics giver præcis styring af mikroboblestørrelse fordeling 10-13. Selvom traditionelt svært at skalere op, multi-kanal, high-speed microfluidics er blevet beskrevet som øger mikrobobler produktionseffektivitet 13. Mikrobobler fremstillet ved hjælp af en af disse metoder kan kræve post-fremstilling størrelse reduktion processer, såsom centrifugal fraktionering 14,15 og mikrobobler flotation 16,17.

En anden fast metode til fremstilling af meget stabile mikrobobler er shear homogenizning 6, som kan resultere i en stabiliserende sekskantet phospholipid mønster på mikroboble overflade 18. Med udgangspunkt i dette koncept beskriver vi inkorporeringen af en in-line høj forskydning homogeniseringsapparat at skabe selvsamlende LOMs 19. I denne proces udnytter homogenisatoren hurtigt roterende knive tæt på dobbelt finmasket emulsor skærme, skabe høj mekanisk og hydraulisk forskydning til oprettelse af mikrobobler. Serial koncentration af fedtemulsionen via dette system giver en mere koncentreret gasfraktion, som kan yderligere koncentreres ved centrifugering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1.. System Set-up

Systemet består af en bedrift og koncentrere tanken (HCT), forsynet med en enkelt fase mixer, en in-line homogenisator med høj forskydning, en rulle-pumpe til at flytte væske mellem HCT og homogenisatoren, og en varmeveksler (figur 1).

  1. Placer en steriliseret, bred åbning 4 L samling glasbeholder udstyret med 2 basishavne og 3 sideporte beneath enkelt fase mixer. Sænk mikserhovedet til mundingen af ​​beholderen og sikre en gastæt montering med gummipakninger eller tape (for at forhindre luften i at forurene head space).
  2. Monter en af basishavne (figur 1, port # 1) af HCT med sterilt 3/8 "(ID) klar slanger, ca 10" lang, udstyret med en 3-vejs stophane på spidsen til opsamling af den koncentrerede emulsion .
  3. Monter den anden basehavn (figur 1, port # 2) med sterilt 3/8 "(ID) slange, approximately 36 "i længden. Feed denne slange gennem en rullepumpe. Montér indløbet af høj forskydning homogeniseringsapparat med et T-stykke, herunder to porte og tilslut som følger: Tilslut slangen fra havn nr. 2, gennem valsen pumpen og forbinde til den side porten af ​​T-stykket. Fastgør den anden port til en ilt tank ved hjælp af en lav-flow ilt gas flowmåler.
  4. Tilslut udgangsporten høj forskydning homogenisator til indgangsporten en in-line varmeveksler holdes på 4 ° C. Tilslut udgangsport af varmeveksleren til afkastet port HCT (figur 1, port # 3), hvilket skaber et lukket kredsløb.
  5. Vedhæft en ilt tank (via en flowmåler) til HCT (figur 1, port # 4). Vedhæft en gassammensætning skærm, der er åbent til atmosfæren til den øverste port HCT (figur 1, port # 5).
  6. Hvis der ønskes sterilitet, sterilisere komponenter glas og metal før hver brug af autoklaven. Sterilisere rør komponenter og plast connectors af ethylenoxid før hver brug. Dette er især vigtigt, hvis produktet skal testes in vivo.

2.. LOM Fremstilling

  1. Anbring 20 g GMP 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC) og 10 g af kolesterol i bunden af HCT. Tilsæt 1 L Plasma-Lyte A til HCT og hånd omrøres i 1 min, integrerer meget lipid som muligt i vandfasen.
  2. Sænk ettrins mixer i den vandige fase, der sikrer, at hele mikserhovedet er omfattet af den vandige fase. Sikre, at toppen af ​​HCT er gastæt (se trin 1.1), og at der er ingen åbne sideåbninger. Tænd for gas kilde er knyttet til port nr. 4 og vente, indtil ilt fraktion af HCT headspace når> 95%. Ved 10 L / min (LPM), bør dette tage ~ 10 min.
  3. Brug af ettrins mixer, blandes forstadie emulsion til 5 minutter ved 5.000 rpm. Den resulterende blanding skal vises bleg hvid og indeholder ingen synlige lipid klumper. Når blandet, kan ubrugte lipid-vand-blanding skal opbevares ved 4 ° C i op til 30 dage før engangsbrug.
  4. Prime hele lukket kredsløb med forstadiet emulsion ved at dreje på rullen pumpen på 1,3 LPM. Når systemet er spædet, holde pumpen på 1,3 LPM.
  5. Til at begynde fremstillingen af ​​LOMs, tænde for in-line høj forskydning homogeniseringsapparat til 7.500 rpm. Umiddelbart derefter tænde ilt flow til indløbsdelen af ​​homogeniseringsapparat på 0,5 LPM. Hold enkelt fase mixer (i HCT) på ved 3.500 rpm. LOMs er dannet ved grænsefladen mellem rotorbladene og emulsor skærme inden for in-line homogenisator (figur 2). Inden for få minutter, bør væske blive synligt mere tyktflydende. En mere stringent fremgangsmåde er at bestemme viskositet som en funktion af tid, hvilket kan gøres ved at fjerne aliquoter fra Port 1 under fabrikation og analyse med en viskosimeter.
    Bemærk: Hvis synlige luftbobler i slangen forlader blanderen, oxygenstrømme til in-line homogenisator er for høj. Titreres ned gasstrømmen, indtil væsken er uigennemsigtig og indeholder ingen synlige luftbobler.
  6. Køre systemet i 15 min, og derefter slukke for høj forskydning homogenisatoren og ilt indløbet til det. Fortsæt med at køre enkelt fase mixer i HCT indtil emulsionen er fjernet; Dette afbøder faseseparation og holder produktet relativt ensartet i HCT.
    Bemærk: Lydstyrken af ​​gasfyldte emulsion bør stige omkring 2-3x under den serielle koncentration fase. Hvis det ikke, skal du kontrollere at sikre, at ilt strømmer ind i høj forskydning homogeniseringsapparat og at lipid koncentrationer i forstadiet emulsionen er korrekte. Effektivitet af produktionen falder som lipid koncentrationen falder.

3.. Indsamling, Koncentration, Vurdering og opbevaring af LOMs

  1. Vedhæft en steril, modificeret 140 ml luer-lock sprøjte til stophanen knyttet til basehavn # 1 på opsamlingsbeholderen. Udarbejde 100 ml væske. Låget tæt sprøjte og gentag indtil al væsken er blevet fjernet.
    1. Ændre sprøjter ved at trække 100 ml luft ind i sprøjten, og derefter save det overskydende stempel og sprøjte materiale over 140 ml mærket. Fyld og tomme sprøjter bruger tandede pincet til at udarbejde stemplet. Denne ændring gør det nemmere at centrifugering.
  2. Centrifugér sprøjter med hætten ende orienteret nedad i et nedkølet (4 º C) spand centrifuge ved 225 xg i 10 min.
  3. Tre lag af materiale vises efter centrifugering. Udvise den nederste lag af overskydende overskyet vandig fase og kasseres. Det andet lag er hvidt og indeholder koncentrerede LOMs. Overførsel koncentreret skum til en sprøjte gasimpermeabel ved hjælp af en tre-vejs stophane til at forhindre forurening af omgivelserne gas. Kassér den sidste lag, som indeholder fri ilt gas fra bristede LOMs.
  4. Skum kvalitet kan vurderes ved at nå ≥ 90% gas koncentreret skum. Calculspiste gaskoncentration som følger:
    Volumen-% gas = [(skum vægt / skum-volumen) - 1] x 100
    1. Som et andet kvalitetskontrol, at størrelse mikrobobler af lysabsorberende afgøre, om partikelstørrelsen er inden for det forventede område. Det skal bemærkes, at en ændring i homogeniseringstid eller formulering kan ændre boblestørrelse.
  5. Stramt cap sprøjten glas med en luer-lock fitting. Koncentrerede LOMs kan fortyndes med Plasma-Lyte A på tidspunktet for anvendelsen. Sprøjter kan opbevares ved 22, 4 eller -20 º C; koldere temperaturer kan give øget holdbarhed stabilitet 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

High shear homogenisering muliggør en effektiv (dvs. inden for en eftermiddag) produktion af tilstrækkelige LOMs for en dyr undersøgelse og ikke kræver teknisk ekspertise. Når dygtige, kan op til 2 L koncentrerede LOMs blive fremstillet i 90 min.

Mikrobobler størrelse og morfologi blev vurderet ved lysmikroskopi og lys dæmpning. Når en 10 pi prøve af LOMs blev visualiseret blev sfæriske LOMs bemærkes, såvel som en relativ mangel på lipid debris (figur 3A). Dette gælder især, når GMP produkt anvendes. Når den samme prøve af LOMs blev vurderet ved lys dæmpning, den gennemsnitlige partikeldiameter var 2,624 ± 0,332 um (SD). Større end 90% af LOMs var <10 um i diameter, og befolkningen var polydisperse (figur 3B).

Emulsion viskositet var stærkt afhængig af fraktion gas (og derfor mikroboblekoncentration). To ml alikvoteraf LOMs af varierende gaskoncentrationer blev undersøgt under anvendelse af en steady state strøm feje ved hjælp af en 40 mm parallel pladegeometri som stress blev varieret fra 0,1 til 10.000 μN · m. Alle LOM gas fraktioner udviser forskydningsfortyndende adfærd, og dette fænomen var mest udtalt ved højere gas-fraktioner. LOMs indeholdende mindst 60 volumen-% gas udviste en rheologisk profil svarende til blod (figur 4A).

Endelig blev iltindholdet (herunder gas fraktion og fraktioneret koncentration af ilt) af LOMs Kontrollen ved tilsætning af varierende mængder af ilt indeholdt i 60 volumen% LOMs til portioner af desaturerede humant blod med en kendt iltsvind. Som tidligere beskrevet, kan indholdet af LOMs ilt beregnes ud fra stigningen i oxyhæmoglobin koncentration 7. Forholdet mellem mængden af ilt tilsættes inden LOMs og den volumetriske forøgelse af indholdet af blodet ilt var 1,053 ± 0,03025 (SD) (95% CI = 0,9865 til 1,120) (Figurure 4B), hvilket tyder på, at de testede LOMs indeholdt næsten 100% oxygen, udstillet få fanget gaslommer (som ikke effektivt overføre ilt til blodet, men flyde ud hurtigt), og effektivt at overføre hele deres ilt nyttelast på humant blod in vitro.

Figur 1
Figur 1.. Fremstilling setup skematisk. LOMs er fremstillet ved hjælp af en in-line, high-shear homogeniseringsapparat i et lukket kredsløb. LOMs holdes inden for bedriften og koncentrere tanken (HCT), under konstant omrøring. Emulsionen bevæges gennem systemet ved hjælp af en rullepumpe. Varme fra homogenisatoren fjernes ved hjælp af en varmeveksler. Klik her for at se en større version af dette tal. </ A>

Figur 2
Figur 2. Selvsamling af LOMs inden for en finmasket emulsor skærmen. A) en hurtigt roterende kniv passerer over et finmasket emulsor skærmen, hvilket skaber en sifonvirkning, der trækker i den vandige fase og gasfasen. Iltbobler dannes ved forskydning, og er hurtigt omgivet af hydrofobe lipidhaler af amfipatiske phospholipider, hvilket skaber en selvsamlende gasfyldt boble (B).

Figur 3
Figur 3.. Karakterisering af LOMs. A) En repræsentant photomicrograph af sfæriske LOMs udviser en polydispers størrelse distribution. Scale bar =10 um. B) Størrelse fordeling af LOMs som vurderet af lys dæmpning. Data = betyder, fejl = SEM.

Figur 4
Fig. 4. Egenskaber centrifugerede og koncentrerede LOMs. A) rheologiske profil af LOM emulsionen ved 60, 70 og 90 volumen-% gas. Fortynding af koncentreret skum til 60 volumen-% gas giver en rheologisk profil ligner humant blod (hæmatokrit 40%). Data = betyder, fejl = SEM. B) Forholdet mellem indholdet af LOMs oxygen tilsat til humant blod og den målte stigning i indholdet af blodet ilt. Data = betyder, fejl = SEM, linje = lineær regression med 95% CI af de bedst tilpassede linje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De vigtigste skridt til at skabe koncentrerede, stærkt iltet LOMs omfatter: 1) at sikre, at headspace i HCT forbliver fuldt iltet; 2) at sikre, at renheden af ​​lipid hjælpestofferne er optimal (herunder opbevaring og brug af GMP produkter); 3) at sikre, at de pulveriserede lipider blandes fuldstændigt med den vandige fase forud for priming af systemet; og 4) meget opmærksom på stigningen i fraktionen gas i HCT at sikre, at volumen fraktion af gas ikke overstiger 70%.

Fremgangsmåden beskrevet her anvender høj forskydning homogenisering at skabe hule mikrobobler. Amphipatiske lipider er ophængt med den vandige fase, som anvendes til at transportere lipider i in-line-homogenisator. GMP-grade lipider anvendes til in vivo-undersøgelser, og foretrækkes i almindelighed, fordi de indeholder færre lipidaggregater og urenheder. Lipider er også omfattet af lipid oxidation (især når de opbevaresinden for en iltet væske) og bakteriel kontaminering. LOMs dannes, når de hydrofobe haler arrangere omkring små oxygen gasmikrobobler oprettet inden for in-line homogenisator (figur 2). Homogenisering LOMs ved 7.500 rpm udsætter mikrobobler yderligere mekaniske belastninger, som de er fræset mellem spidserne af vingerne og den indre væg af statoren. LOMs også gennemgå hydraulisk forskydning, som de er tvunget til ved høj hastighed gennem ultrafine mesh emulsor skærm, hvilket yderligere reducerer partikelstørrelse. Forskydningskræfter generere varme inden for in-line-homogenisator og lokalt ved ettrins mixer; en in-line varmeveksler, før tilbagevenden til HCT er nødvendigt at fjerne denne varme. Fravær af en varmeveksler kan hæve temperaturen over faseovergangstemperaturen af ​​lipidet (55 ° C i DSPC), hvilket øger fluiditeten af ​​lipid og resulterer i produkttab. Oprettelse af emulsionen i et lukket in-line enhed sikrer, at ren tørremidden er indarbejdet i LOM kerne ved at forebygge luftforurening. Endvidere er LOMs kontinuerligt udsættes for med den gasformige headspace HCT. Det er derfor afgørende at sikre, at sugeeffekt skabt af laboratoriet mixer i HCT ikke skaber en tilbageførsel af luftstrøm fra atmosfæren ind i HCT (gennem gassen sammensætning monitor, som er åben til atmosfæren for at forhindre overtryk i HCT) . Ilt gasstrømningshastigheder beskrevet her bør være tilstrækkelig til at forhindre dette fænomen.

Genanvendelse af emulsionen gennem den in-line-homogenisator i serielle koncentrationen fase skaber yderligere LOMs fra ubenyttede 'phospholipider forbliver i den vandige fase, og også emner intakte LOMs gentagen klipning, som yderligere kan reducere partikelstørrelse. Partikelstørrelse og gas koncentrationen kan derfor skræddersys ved at justere mixer hastigheder emulsor skærme, maskestørrelse og køre tid (dvs. varigheden af den serielle concentration trin). Mekanisk omrøring frembringer en polydispers størrelsesfordeling. Den brede størrelsesfordeling giver mulighed for strammere pakning af mikrobobler, og derved øge maksimum fraktion den indkapslede gas i en given mængde skum. Ændring formulering kemi ved inklusion viskositetsforstærkende midler kan bruges til at skabe en mere homogen størrelse fordeling, hvis det ønskes. Vi har fundet, at en køretid på 15 minutter er mest ideel; som mikroboblekoncentration stiger, bliver emulsionen stadig tyktflydende. Når den når en kritisk viskositet, er det ikke længere effektivt pumpes ved hjælp af en rullepumpe. Dette forårsager fri gas at passere gennem homogenisatoren uden at blive inkorporeret i LOMs og kan ses i den klare slange. På dette stadium, vi generelt vælge at stoppe den serielle koncentrationen trin, men hvis det ønskes, kan gas-strømningshastighed ind i in-line homogenisator sættes ned og rullepumpen strømningshastighed kan øges for at skabe en højere gas-fraktioner. Men meget viscous emulsioner kræver mere kraft til at trække sig ind i sprøjter til centrifugeringen, og kan mindske udbyttet af denne proces.

Centrifugeringstrinnet er blevet lettet ved at ændre 140 ml sprøjter afkorte stemplet og sprøjtens bund, så sprøjter udgør en endnu cylinder. Dette letter i høj grad lastning og losning af sprøjter i centrifugen. Efter centrifugering sprøjter indeholder typisk tre lag. Den tætteste lag (nær sprøjtens spids når sprøjter er fyldt næse-down) indeholder ubrugte phospholipider og hovedparten af ​​den vandige fase. I nogle tilfælde kan overskyet 'snavs' ses i sprøjten, der typisk indeholder lipid klumper. For grundlæggende forsøg kan indholdet af denne "vandige fase" genanvendes til efterfølgende forsøg, selv om vi har fundet, at dette i væsentlig grad formindsker effektiviteten af ​​processen. (For at afbøde dette problem yderligere phospholipid hjælpestoffer kansættes til den recirkulerede precursor emulsion, idet man for at opretholde det molære forhold af hver excipiens.) Det midterste lag i hver sprøjte er hvidt og indeholder koncentrerede LOMs. Der er typisk en skarp skillelinje mellem bunden og midterste lag. Det midterste lag af hver sprøjte kan kombineres til yderligere forarbejdning som beskrevet nedenfor. Det øverste lag indeholder fluffy skum indeholder fri gas fra LOMs brudt hele fremstillingsprocessen. De øverste og nederste lag er typisk kasseres. Under centrifugering, er det vigtigt at sikre, at hver sprøjte er dækket af en gastæt sprøjte hætte for at forhindre ekstrudering af emulsionen i centrifugen under behandlingen. Centrifugering ved højere hastigheder var begrænset af trykstyrke sprøjterne vi bruges. Hvis det er nødvendigt for at opnå en skarp skillelinje mellem de nederste og midterste lag (normalt når emulsioner indeholdende fraktion høj gas blev centrifugeret), kan centrifugering tid væreforlænges. Anvendelse af en gastæt, 3-vejs stophane at kombinere koncentrerede LOMs er nyttigt at forhindre luft forurening. Det er også vigtigt at sikre, at LOM-holdige sprøjter altid holdes loft, og at den omgivende luft udstødes straks. For at begrænse luftforureningen under opbevaring bør sprøjter forsegles med kun luer-lock caps. Plastsprøjter er kendt for at være gaspermeabel, så glas eller metal injektionssprøjter foretrække for langtidsopbevaring.

Som beskrevet ovenfor, emulsioner, der udsættes for den serielle koncentrationen trin i 15 minutter udviser typisk 70% gas ved volumen og kan koncentreres til 90% gas ved centrifugering. Selv om 70 volumen% emulsion er ønsket i sidste ende, har vi fundet centrifugering for at være nyttigt at fjerne fosfolipider, som ikke er indarbejdet i LOMs fra koncentrat. Dette kan også opnås ved at tillade emulsioner til at stå natten over for at opnå faseadskillelse. Til in vivo forsøg, vi ofte fortynde den koncentreredeLOMs med Plasma-Lyte A, bland forsigtigt, centrifugeres igen for at fjerne yderligere ubrugte phospholipider og andet affald. Dette trin kan gentages flere gange for at fjerne overskydende lipid debris. Indsprøjtningen af ​​phospholipider, som ikke er indarbejdet i LOMs er uønsket på grund af den ekstra lipid belastning de bibringer i fastsættelsen af ​​en høj infusionshastighed.

Vi har fundet flere almindelige faldgruber at undgå i denne fremstillingsprocessen. Først bør lipid excipienser være frisk, opbevaret ved -80 ° C, og ikke anvendes, hvis udløbet. Forløberen opløsning bør ikke genanvendes til in vivo-undersøgelser, som følge emulsioner er inkonsekvent i deres størrelse distribution og maksimal fraktion gas, og kan indeholde bakterielle forureninger, oxiderede lipider eller lipid klumper. Det andet, når emulsionen når kritiske viskositet 'under fremstilling, vil det ikke længere være effektivt pumpes gennem systemet, og store gaslommer vil danne i HCT. Den høje emulsion viskositet gør også emulsionen vanskelige at håndtere og trække op i sprøjter. Disse problemer er bedst undgås ved at måle stigningen i fraktionen gas i HCT (ved at kvantificere stigningen i volumen som den fraktion af gas stiger) og stoppe den serielle koncentration processen, når udgangsvolumenet fordobles.

En vigtig begrænsning ved denne teknik er et vedvarende behov for centrifugering, hvilket er uønsket, fordi det skaber potentiale for luft og bakteriel kontaminering af det endelige produkt, og forhindrer det fra at være en kontinuerlig proces. I fremtiden kan den serielle koncentration trin ændres til et enkelt trin for fremstilling kommerciel lægemiddel ved at bruge en hydraulisk udledning system til at fjerne behovet for batched centrifugering. In-line-homogenisator og laboratorie blandere kan fremstilles med 3/16 rustfrit stål og steriliseres på plads. Inddragelsen af ​​andre gasser i systemet kan udvide the anvendeligheden af ​​denne teknik yderligere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Finansiering: US Army Medical Research & Materiel Kommando (USAMRMC) og forvaltes af Telemedicin & Advanced Technology Research Center. Shunxi Ji bidrog ændringen af ​​sprøjter, som beskrevet her.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Polar Lipids 770365 Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080)
Cholesterol Sigma Aldrich C75209
Plasma-Lyte A VWR 80089-818 Alternatively can use NaCl
Glass collection vessel Specialty Glass, Inc. Custom Contact: Pam Zurbrick - 281-595-2210
Gas composition (oxygen) monitor Precision Medical PM5900L
Sarns 8000 roller pump Calicut Medical 16407 Part of a modular perfusion system
BIOtherm Heat Exchanger Medtronic ECMOtherm-II
Verso laboratory in-line mixer Silverson Machines, Inc TH-IL-102-VERSO Use multistage workheads and front-end extension with T piece
T-piece for Silverson Verso inlet port Process Innovations Custom Contact: Brian Leavitt - 508-423-2266
L5M-A laboratory mixer Silverson Machines, Inc NC0136483 Use mesh emulsor screen (fine)
Rochester-Ochsner toothed forceps Fisher Scientific 13-812-18
140 ml syringe Kendall Healthcare Monoject 8881114030 Ensure there is a luer lock.
IX71 Inverted light microscope Olympus IX71
Retiga-2000R microscope camera QImaging RET-2000R-F-M-12
Accusizer 780A Autodilution PSS-NICOMP Particle Sizing Systems Out of production

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5, (11), 2161-2170 (2009).
  2. Ren, J. L., et al. A Novel Ultrasound Microbubble Carrying Gene and Tat Peptide: Preparation and Characterization. Academic Radiology. 16, (12), 1457-1465 (2009).
  3. Tinkov, S., et al. Microbubbles as Ultrasound Triggered Drug Carriers. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98, (6), 1935-1961 (2009).
  4. Hernot, S., Klibanov, A. L. Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, (10), 1153-1166 (2008).
  5. Lanza, G. M., et al. A novel site-targeted ultrasonic contrast agent with broad biomedical application. Circulation. 94, (12), 3334-3340 (1996).
  6. Cavalli, R., et al. Preparation and characterization of dextran nanobubbles for oxygen delivery. International Journal of Pharmaceutics. 381, (2), 160-165 (2009).
  7. Kheir, J. N., et al. Oxygen Gas-Filled Microparticles Provide Intravenous Oxygen Delivery. Science Translational Medicine. 4, (140), (2012).
  8. Lindner, J. R., et al. Microvascular rheology of definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration. Journal of the American Society of Echocardiography. 15, (5), 396-403 (2002).
  9. Zhao, Y. Z., et al. Preparation, characterization and in vivo observation of phospholipid-based gas-filled microbubbles containing hirudin. Ultrasound in Medicine and Biology. 31, (9), 1237-1243 (2005).
  10. Seo, M., et al. Microfluidic Assembly of Monodisperse, Nanoparticle-Incorporated Perfluorocarbon Microbubbles for Medical Imaging and Therapy. Langmuir. 26, (17), 13855-13860 (2010).
  11. Wan, J. D., Stone, H. A. Coated Gas Bubbles for the Continuous Synthesis of Hollow Inorganic Particles. Langmuir. 28, (1), 37-41 (2012).
  12. Duncanson, W. J., et al. Monodisperse Gas-Filled Microparticles from Reactions in Double Emulsions. Langmuir. 28, (17), 6742-6745 (2012).
  13. Kendall, M. R., et al. Scaled-Up Production of Monodisperse, Dual Layer Microbubbles Using Multi-Array Microfluidic Module for Medical Imaging and Drug Delivery. Bubble Science Engineering and Technology. 4, (1), 12-20 (2012).
  14. Szijjarto, C., et al. Effects of Perfluorocarbon Gases on the Size and Stability Characteristics of Phospholipid-Coated Microbubbles: Osmotic Effect versus Interfacial Film Stabilization. Langmuir. 28, (2), 1182-1189 (2012).
  15. Rossi, S., Waton, G., Krafft, M. P. Phospholipid-Coated Gas Bubble Engineering: Key Parameters for Size and Stability Control, as Determined by an Acoustical Method. Langmuir. 26, (3), 1649-1655 (2010).
  16. Swanson, E. J., et al. Phospholipid-Stabilized Microbubble Foam for Injectable Oxygen Delivery. Langmuir. 26, (20), 15726-15729 (2010).
  17. Kvåle, S., et al. Size fractionation of gas-filled microspheres by flotation. Separations Technology. 6, (4), 219-226 (1996).
  18. Dressaire, E., et al. Interfacial polygonal nanopatterning of stable microbubbles. Science. 320, (5880), 1198-1201 (2008).
  19. Kheir, J. N., et al. Bulk Manufacture of Concentrated Oxygen Gas-Filled Microparticles for Intravenous Oxygen Delivery. Advanced Healthcare Materials. (2013).
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomson, L. M., Polizzotti, B. D., McGowan, F. X., Kheir, J. N. Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration. J. Vis. Exp. (87), e51467, doi:10.3791/51467 (2014).More

Thomson, L. M., Polizzotti, B. D., McGowan, F. X., Kheir, J. N. Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration. J. Vis. Exp. (87), e51467, doi:10.3791/51467 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter