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Bioengineering

Fabbricazione di concentrato, ossigeno a base di lipidi microbolle emulsioni da High Shear omogeneizzazione e concentrazione seriale

doi: 10.3791/51467 Published: May 26, 2014

Summary

Descriviamo metodi per la produzione di grandi volumi di base di lipidi microbolle ossigeno (LOMS) progettati per la consegna di ossigeno endovenosa utilizzando high-shear omogeneizzazione e concentrazione seriale.

Abstract

Microbolle di gas sono stati sviluppati come contrasto ecografico e agenti di consegna della droga. Le microbolle possono essere prodotti dalla lavorazione di tensioattivi mediante sonicazione, agitazione meccanica, dispositivi microfluidici, o omogeneizzazione. Recentemente, a base di lipidi microbolle di ossigeno (LOMS) sono stati progettati per fornire ossigeno per via endovenosa durante le emergenze mediche, invertendo pericolo di vita ipossiemia, e prevenire lesioni a organi, arresto cardiaco e morte. Vi presentiamo i metodi per la produzione in scala-up di microbolle altamente ossigenati utilizzando un circuito chiuso ad alta-shear omogeneizzatore. Il processo può produrre 2 L di LOMS concentrati (90% in volume) in 90 min. Bolle risultanti hanno un diametro medio di circa 2 micron, e un profilo reologico coerente con quella del sangue quando diluito al 60% in volume. Questa tecnica produce LOMS a capacità elevata e con la purezza di ossigeno, suggerendo che questa tecnica può essere utile per laboratori di ricerca traslazionale.

Introduction

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Microbolle composto da proteine, polimero, e conchiglie lipidi sono stati sviluppati come vettori per il drug delivery, terapia genica, e mezzi di contrasto ecografici 1-5. Poiché questi usi terapeutici richiedono intravascolare persistenza microbolle, tali microbolle sono comunemente pieni di inerti, alti gas peso molecolare come perfluorocarburi 6, che hanno bassa solubilità nel sangue e stabilizzano il 3,4 bolla.

Recentemente, a base di lipidi microbolle di ossigeno (LOMS) sono stati progettati per fornire dosi terapeutiche di ossigeno, che può preservare la consegna di ossigeno d'organo e prevenire instabilità emodinamica durante i periodi di ostruzione delle vie aeree o ipossiemia 7. Emulsioni progettati per la consegna di gas endovenosa richiedono diverse caratteristiche di design rispetto a quelli utilizzati per gli agenti di contrasto ecografici o somministrazione di farmaci mirati. In primo luogo, perché il corpo consuma grandi quantità di gas ossigeno (~ 200 ml / min), LOMS devono essere prodotti einiettato su larga scala. Ciò richiede che il processo di fabbricazione sia efficiente. In secondo luogo, il processo di fabbricazione deve essere a circuito chiuso per evitare la contaminazione azoto attraverso l'esposizione di LOMS (che deve essere riempito con 100% di ossigeno) all'aria ambiente. Terzo, poiché lo scopo di LOMS è consegna gas endovenosa, la frazione di gas LOMS dovrebbe essere massimizzata, riconoscendo i limiti imposti dalla emulsione viscosità 7. Infine, come con qualsiasi iniettabili per via endovenosa, un controllo preciso sulla distribuzione granulometrica è essenziale per evitare l'ostruzione microvascolare 8.

Ci sono diversi metodi stabiliti per la produzione di microbolle. Sonicazione utilizza alta intensità, ultrasuoni a bassa frequenza applicato all'interfaccia aria-liquido di una emulsione che comprende un tensioattivo, come ad esempio un fosfolipide anfipatica, in presenza di un gas spazio di testa per produrre microbolle 7,9. Questo processo è controllabile variando ultrafrequenza del suono, potenza e durata dell'impulso, e la distribuzione granulometrica risultante possono essere adattate per produrre microbolle di una specifica distribuzione dimensione, anche se sonicazione è raramente usato nella fabbricazione di microbolle clinicamente utilizzati. Fusione è l'agitazione meccanica intenso di un tensioattivo e gas in un sistema chiuso, che è anche difficile da scalare fino a grandi volumi 2. Microfluidica basata su Droplet permette un controllo preciso della distribuzione delle dimensioni di microbolle 10-13. Anche se tradizionalmente difficili da scalare, multi-canale, microfluidica ad alta velocità sono stati descritti che aumentano l'efficienza di produzione di microbolle 13. Le microbolle fabbricati utilizzando uno di questi metodi possono richiedere processi formato di riduzione post-produzione, come frazionamento centrifuga 14,15 e microbolle galleggiamento 16,17.

Un altro metodo stabilito per la fabbricazione di microbolle altamente stabili è homogeniz shearzione 6, che può risultare in una stabilizzazione reticolo esagonale fosfolipide sulla superficie di microbolle 18. Basandosi su questo concetto, si descrive l'incorporazione di un taglio elevato omogeneizzatore in-linea per creare auto-assemblaggio LOMS 19. In questo processo, l'omogeneizzatore utilizza lame a rapida rotazione in prossimità doppio sottili schermi emulsor maglia, creando alto taglio meccanico ed idraulico per la creazione di microbolle. Concentrazione Serial dell'emulsione lipidica attraverso questo sistema produce una frazione di gas sempre più concentrata, che può essere ulteriormente concentrato mediante centrifugazione.

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Protocol

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1. System Set-up

Il sistema è costituito da un'azienda e concentrando serbatoio (HCT) dotato di un miscelatore stadio, un taglio elevato omogeneizzatore in-linea, una pompa a rulli per spostare fluido tra l'HCT e l'omogeneizzatore, e uno scambiatore di calore (Figura 1).

  1. Posizionare un sterilizzato, bocca larga 4 L recipiente di raccolta di vetro munito di 2 porte base e 3 porte laterali sotto il mixer a singolo stadio. Abbassare la testa del mixer alla bocca della nave e garantire un raccordo a tenuta di gas con guarnizioni in gomma o nastro adesivo (al fine di evitare che l'aria ambiente di contaminare lo spazio di testa).
  2. Montare una delle porte di base (Figura 1, porta # 1) della HCT con sterile 3/8 "(ID) tubo trasparente, di circa 10" di lunghezza, dotata di rubinetto a 3 vie sulla punta per la raccolta della emulsione concentrata .
  3. Montare la seconda porta base (Figura 1, porta # 2) con sterile 3/8 "(ID) tubi, ufficio intornoy 36 "di lunghezza. Alimentare questo tubo attraverso una pompa a rulli. Montare l'ingresso di alto omogeneizzatore taglio con un raccordo a T comprese le due porte e collegare come segue: collegare il tubo dal porto # 2, attraverso la pompa rullo e collegarlo alla porta laterale del T-pezzo. Attaccare l'altra porta ad una bombola di ossigeno utilizzando un misuratore di flusso di gas di ossigeno a basso flusso.
  4. Collegare la porta di uscita del omogeneizzatore ad alta taglio alla porta di ingresso di uno scambiatore termico in linea mantenuta a 4 ° C. Collegare la porta di uscita dello scambiatore di calore per l'apertura di ritorno del HCT (Figura 1, porta # 3), creando un sistema a circuito chiuso.
  5. Attaccare un serbatoio di ossigeno (tramite un flussometro) alla HCT (Figura 1, porta # 4). Collegare un monitor composizione del gas che è aperto all'atmosfera alla porta all'inizio della HCT (Figura 1, port # 5).
  6. Se sterilità è desiderato, sterilizzare i componenti in vetro e metallo prima di ogni utilizzo in autoclave. Sterilizzare i componenti di tubi e co plasticannectors di ossido di etilene prima di ogni utilizzo. Ciò è particolarmente importante se il prodotto viene testato in vivo.

2. LOM Fabbricazione

  1. Porre 20 g di 1,2-GMP distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) e 10 g di colesterolo nella base del HCT. Aggiungere 1 L di plasma-Lyte A alla HCT e mescolare a mano per 1 min, integrando il più possibile lipidi in fase acquosa.
  2. Abbassare il mixer monostadio nella fase acquosa, assicurando che l'intera testa del mixer è coperto dalla fase acquosa. Assicurarsi che la parte superiore del HCT è a tenuta di gas (vedi punto 1.1) e che non ci sono le porte laterali aperte. Accendere la sorgente di gas collegato alla porta # 4 e attendere che la frazione di ossigeno della spazio di testa HCT raggiunge il> 95%. Al 10 L / min (LPM), questo dovrebbe prendere ~ 10 min.
  3. Uso del mixer monostadio, mescolare l'emulsione precursore per 5 minuti a 5000 rpm. La miscela risultante dovrebbe apparire bianco pallido e non contengono lipi visibiled grumi. Una volta mescolato, miscela lipidica acqua non utilizzata può essere conservato a 4 ° C fino a 30 giorni prima monouso.
  4. Prime dell'intero sistema a ciclo chiuso con l'emulsione precursore attivando la pompa a rulli a 1.3 LPM. Una volta che il sistema è innescato, tenere la pompa a 1,3 LPM.
  5. Per iniziare fabbricazione dei LOMS, accendere il taglio elevato omogeneizzatore in-linea a 7.500 giri. Subito dopo, attivare il flusso di ossigeno alla porzione di ingresso del omogeneizzatore a 0.5 LPM. Tenere il mixer di palco singolo (in HCT) su a 3.500 giri. LOMS si formano all'interfaccia di pale del rotore e gli schermi emulsor ai omogeneizzatore in-linea (Figura 2). In pochi minuti, il liquido dovrebbe diventare visibilmente più viscoso. Un approccio più rigoroso è quello di determinare la viscosità in funzione del tempo, che può essere fatto rimuovendo aliquote da Port 1 durante la fabbricazione e l'analisi con un viscosimetro.
    Nota: Se bolle d'aria visibili presenti nella tubazione in uscita dal mixer, ossigenofruiti omogeneizzatore in-linea è troppo alta. Titolare basso flusso di gas fino a quando il fluido è opaco e non contiene bolle di gas visibile.
  6. Funzionare il sistema per 15 minuti, quindi spegnere l'alto omogeneizzatore taglio e l'ingresso di ossigeno ad esso. Continuare a eseguire il miscelatore singola fase nel HCT fino a quando l'emulsione viene rimosso; questo mitiga separazione di fase e mantiene il prodotto relativamente uniforme all'interno della HCT.
    Nota: Il volume dell'emulsione riempito di gas dovrebbe aumentare di circa 2-3x durante la fase di concentrazione seriale. In caso contrario, verificare che l'ossigeno fluisce in alto omogeneizzatore taglio e che le concentrazioni di lipidi in emulsione precursore siano corrette. Efficienza della produzione diminuisce concentrazione di lipidi diminuisce.

3. Collection, Concentrazione, valutazione e conservazione di LOMS

  1. Collegare un sterile, modificato 140 ml siringa luer-lock per il rubinetto collegato alla porta di base # 1 sulla nave collezione. Redigere 100 ml di liquido. Cap Strettamente siringa e ripetere fino a quando tutto il liquido è stato rimosso.
    1. Modifica siringhe ritirando 100 ml di aria nella siringa e poi segare lo stantuffo eccesso e materiale siringa sopra il marchio 140 ml. Riempire e siringhe vuote con pinze dentate di redigere lo stantuffo. Questa modifica permette facile centrifugazione.
  2. Siringhe centrifuga con la fine capped orientato verso il basso in un frigorifero (4 ° C) Benna centrifugare a 225 xg per 10 min.
  3. Tre strati di materiale appariranno dopo la centrifugazione. Espellere lo strato inferiore di un eccesso di fase acquosa nuvoloso e scartare. Il secondo strato è bianco luminoso e contiene LOMS concentrati. Trasferire schiuma concentrata ad una siringa impermeabile ai gas utilizzando un rubinetto a tre vie per prevenire la contaminazione gas ambiente. Eliminare lo strato finale, che contiene il gas ossigeno libero da LOMS rottura.
  4. Qualità della schiuma può essere valutata raggiungendo ≥ 90% del gas di schiuma concentrato. Calculate concentrazione di gas come segue:
    Volume% gas = [(peso piuma / volume Foam) - 1] x 100
    1. Come controllo secondo qualità, microbolle dimensioni di oscuramento della luce per determinare se la dimensione delle particelle è nel range previsto. Va notato che un cambiamento nel tempo omogeneizzazione o formulazione potrebbe alterare dimensione delle bolle.
  5. Tappare ermeticamente la siringa di vetro con un raccordo luer-lock. LOMS concentrati possono essere diluiti con Plasma-Lyte A al momento dell'uso. Le siringhe possono essere conservati a 22, 4, o -20 ° C; temperature più fredde possono fornire maggiore stabilità shelf-life 7.

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Representative Results

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Alta omogeneizzazione taglio permette efficiente (cioè entro un pomeriggio) la produzione di LOMS sufficienti per uno studio sugli animali e non richiede competenze tecniche. Una volta abile, fino a 2 L di LOMS concentrati può essere fabbricato in 90 min.

Dimensioni microbolle e la morfologia è stata valutata mediante microscopia ottica e oscuramento della luce. Quando è stato visualizzato un campione di 10 microlitri di LOMS, sono stati notati LOMS sferici, nonché una scarsità relativa di detriti lipidi (Figura 3A). Ciò è particolarmente vero quando si usa prodotto GMP. Quando lo stesso campione di LOMS è stata valutata mediante oscuramento della luce, il diametro delle particelle media era di 2,624 ± 0,332 micron (SD). Maggiore del 90% di LOMS erano <10 micron di diametro, e la popolazione era polydisperse (Figura 3B).

Viscosità dell'emulsione era fortemente dipendente frazione gas (e quindi, sulla concentrazione microbolle). Due aliquote di mldi LOMS di concentrazioni di gas diversi sono stati studiati utilizzando un costante flusso spazzata stato con una geometria della piastra parallela 40 millimetri lo stress è stata variata da 0,1 a 10.000 μN · m. Tutte le frazioni di gas LOM mostrano un comportamento shear-assottigliamento, e questo fenomeno è stato più pronunciato in frazioni di gas superiori. LOMS contenenti il 60% del volume di gas esibito un profilo reologico simile al sangue (Figura 4A).

Infine, il contenuto di ossigeno (compresa la frazione di gas e concentrazione frazionaria di ossigeno) di LOMS stata testata aggiungendo diversi volumi di ossigeno contenuti in volume 60% LOMS di aliquote di sangue umano desaturato con un deficit di ossigeno noto. Come descritto in precedenza, il contenuto di ossigeno LOMS può essere calcolato l'aumento della concentrazione di ossiemoglobina 7. Il rapporto tra volume di ossigeno aggiunto all'interno LOMS e l'aumento volumetrico del contenuto di ossigeno del sangue era 1.053 ± 0,03,025 mila (SD) (95% CI = ,9865-1,120) (Figure 4B), suggerendo che le LOMS testate contenevano quasi il 100% di ossigeno, esposto poche sacche di gas intrappolati (che non trasferire efficientemente ossigeno al sangue, ma galleggiare rapidamente), e trasferire efficacemente il loro intero payload ossigeno al sangue umano in vitro.

Figura 1
Figura 1. Produzione impostazione schematica. LOMS sono prodotte utilizzando un filtro in linea, ad alta taglio omogeneizzatore in un sistema a circuito chiuso. LOMS si svolgono all'interno di un'azienda e concentrando serbatoio (HCT) sotto costante miscelazione. L'emulsione viene spostato attraverso il sistema utilizzando una pompa a rulli. Il calore generato dalla omogeneizzatore viene rimosso utilizzando uno scambiatore di calore. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. </ A>

Figura 2
Figura 2. Autoassemblaggio di LOMS all'interno di una multa schermo emulsor mesh. A) Una lama rapida rotazione passa sopra una multa schermo emulsor maglia, creando un effetto sifone che attira le fasi acquosa e gas. Bolle di ossigeno piccoli sono formati da taglio, e sono circondati da rapidamente le code idrofobiche di fosfolipidi lipidi anfipatici, creando una bolla riempita di gas autoassemblaggio (B).

Figura 3
Figura 3. Caratterizzazione dei LOMS. A) una microfotografia rappresentante LOMS sferiche che presentano una distribuzione dimensionale polydisperse. Barra della scala =10 micron. B) distribuzione delle dimensioni delle LOMS valutata mediante oscuramento della luce. Dati = significano, errore = SEM.

Figura 4
Figura 4. Proprietà di LOMS centrifugato e concentrati. A) Il profilo reologico di un'emulsione LOM a 60, 70 e 90% in volume di gas. Diluizione di schiuma concentrato al 60% in volume del gas produce un profilo reologico simile al sangue umano (ematocrito 40%). Dati = significano, errore = SEM. B) Il rapporto tra contenuto di ossigeno LOMS aggiunto al sangue umano e l'aumento misurato del contenuto di ossigeno del sangue. Dati = significano, errore = SEM, riga = regressione lineare con IC 95% della linea best-fit.

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Discussion

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I passi più importanti per la creazione, LOMS altamente ossigenati concentrate le seguenti: 1) garantire che lo spazio di testa all'interno del HCT rimane completamente ossigenato; 2) garantire che la purezza degli eccipienti lipidi è ottimale (comprese le condizioni di conservazione e utilizzo dei prodotti GMP); 3) garantire che i lipidi polvere mescolano completamente con la fase acquosa prima di innesco del sistema; e 4) prestando attenzione all'aumento della frazione di gas all'interno del HCT per garantire che la frazione di volume di gas non superi il 70%.

Il metodo che descriviamo qui utilizza alta omogeneizzazione taglio per creare microbolle vuote. Lipidi anfipatici sono sospese con la fase acquosa, che viene utilizzato per trasportare i lipidi nel omogeneizzatore in-linea. Lipidi GMP-grade sono utilizzati per studi in vivo, e sono generalmente preferiti perché contengono meno aggregati lipidici ed impurezze. I lipidi sono inoltre soggetti a ossidazione dei lipidi (soprattutto se conservatiall'interno di un fluido ossigenato) e contaminazione batterica. LOMS si formano quando le code idrofobe organizzano intorno piccole microbolle di gas ossigeno creati all'interno del omogeneizzatore in-linea (Figura 2). Omogeneizzazione LOMS a 7.500 giri sottopone le microbolle a ulteriori sollecitazioni meccaniche come sono fresati tra le punte delle pale del rotore e la parete interna dello statore. LOMS subiscono anche cesoia idraulica come sono costretti ad alta velocità attraverso lo schermo emulsor maglie ultra-sottile, riducendo ulteriormente la dimensione delle particelle. Forze di taglio generano calore all'interno del omogeneizzatore in-linea e localmente al mixer singola fase; uno scambiatore di calore in linea prima del ritorno al HCT è necessario rimuovere questo calore. Assenza di uno scambiatore di calore può aumentare le temperature superiori alla temperatura di transizione di fase del lipide (55 ° C per DSPC), che aumenta la fluidità del lipide e si traduce in perdita di prodotto. Creazione dell'emulsione all'interno di un ambiente chiuso, in linea dispositivo permette ossigenazione puron è incorporato nel nucleo LOM impedendo la contaminazione dell'aria. Inoltre, LOMS sono continuamente esposti a con spazio di testa gassoso della HCT. È pertanto indispensabile per garantire che l'effetto di aspirazione creata dal miscelatore laboratorio ai HCT non crea una inversione del flusso d'aria dall'atmosfera nella HCT (attraverso il monitor composizione del gas, che è aperto all'atmosfera per evitare pressurizzazione del HCT) . Le portate di gas ossigeno qui descritti dovrebbe essere sufficiente per prevenire questo fenomeno.

Riciclo dell'emulsione attraverso l'omogeneizzatore in linea durante la fase di concentrazione seriale crea LOMS aggiuntivi da fosfolipidi 'inutilizzati' che rimane nella fase acquosa, e anche soggetti LOMS intatte ripetuto taglio, che può ridurre ulteriormente la dimensione delle particelle. Concentrazione di dimensione delle particelle e gas può quindi essere adattato regolando la velocità del mixer, emulsor schermi, dimensione delle maglie, e il tempo di esecuzione (cioè durata del c serialeoncentration step). Agitazione meccanica produce una distribuzione della dimensione polydisperse. La distribuzione ampia dimensione consente stretto imballaggio di microbolle, aumentando così la massima frazione gas incapsulato in un dato volume di schiuma. Alterare formulazione chimica da agenti viscosità migliorare inclusione può essere utilizzato per creare una distribuzione di dimensione più omogenea se desiderato. Abbiamo trovato che un tempo di durata di 15 min è più ideale; all'aumentare della concentrazione di microbolle, l'emulsione diventa sempre più viscoso. Una volta raggiunta una viscosità critico, non è più efficace pompato mediante una pompa a rulli. Questo fa sì che il gas libero di passare attraverso l'omogeneizzatore senza essere incorporato in LOMS e può essere visto all'interno del tubo trasparente. In questa fase, generalmente eleggiamo per fermare la fase di concentrazione seriale, però se desiderato, la portata del gas nel omogeneizzatore in-linea può essere diminuita e la portata della pompa a rulli può essere aumentata per creare frazioni di gas superiori. Tuttavia, altamente viscous emulsioni richiedono più forza di ritirarsi in siringhe per la fase di centrifugazione, e possono diminuire la resa di questo processo.

La fase di centrifugazione è stata facilitata modificando 140 ml siringhe per troncare il pistone e la base della siringa, in modo che riempite formano anche cilindro. Questo facilita notevolmente il carico e lo scarico delle siringhe nella centrifuga. Dopo la centrifugazione, siringhe contengono tipicamente tre strati. Lo strato più denso (vicino alla punta della siringa quando siringhe vengono caricati naso-down) contiene fosfolipidi inutilizzati e la maggior parte della fase acquosa. In alcuni casi, torbida 'detriti' può essere visto all'interno della siringa che contiene tipicamente grumi lipidici. Per gli esperimenti di base, il contenuto di questa 'fase acquosa' possono essere riutilizzati per esperimenti successivi, sebbene abbiamo trovato che questo diminuisce notevolmente l'efficienza del processo. (Per attenuare questo problema, altri eccipienti fosfolipidi possonoaggiungere all'emulsione precursore riciclato, avendo cura di mantenere il rapporto molare di ogni eccipiente.) Lo strato intermedio all'interno di ogni siringa è bianco brillante e contiene LOMS concentrati. Vi è tipicamente una netta linea di demarcazione tra il fondo e strati intermedi. Lo strato intermedio di ciascuna siringa può essere combinato per ulteriore elaborazione, come descritto di seguito. Lo strato superiore contiene schiuma soffice contenenti gas libero da LOMS rotti durante tutto il processo di fabbricazione. Gli strati superiori e inferiori sono tipicamente scartati. Durante la centrifugazione, è importante garantire che ciascuna siringa è coperto da un cappuccio siringa a tenuta per impedire l'estrusione dell'emulsione nella centrifuga durante la lavorazione. Centrifugazione a velocità più elevate è stata limitata dalla resistenza alla compressione delle siringhe che abbiamo usato. Se necessario per raggiungere una netta linea di demarcazione tra gli strati inferiori e medi (di solito quando venivano centrifugati emulsioni contenenti frazione ad alto gas), tempo di centrifugazione può essereesteso. Uso di un rubinetto a 3 vie a tenuta di gas per combinare LOMS concentrati è utile per prevenire la contaminazione dell'aria. E 'anche importante garantire che LOM-contenenti siringhe sono sempre mantenuti livellata e che l'aria ambiente viene espulsa immediatamente. Per limitare la contaminazione dell'aria durante la conservazione, siringhe devono essere sigillati con solo tappi luer-lock. Siringhe di plastica sono noti per essere permeabile ai gas, così vetro o metallo siringhe sono preferibili per la conservazione a lungo termine.

Come descritto sopra, emulsioni esposte alla fase di concentrazione seriale per 15 min mostrano tipicamente il 70% in volume di gas e possono essere concentrati al 90% di gas mediante centrifugazione. Anche se% emulsione di 70 volumi si desidera, alla fine, abbiamo trovato centrifugazione per essere utile rimuovere fosfolipidi che non sono incorporati in LOMS dal concentrato. Questo può anche essere realizzato consentendo emulsioni riposare per una notte la separazione di fase. Per esperimenti in vivo, spesso diluire il concentratoLOMS con Plasma-Lyte A, mescolare delicatamente, quindi centrifugare di nuovo per rimuovere ulteriori fosfolipidi inutilizzati e altri detriti. Questa operazione può essere ripetuta più volte necessario per rimuovere i detriti lipidi in eccesso. L'iniezione di fosfolipidi che non sono incorporati in LOMS è indesiderabile a causa del carico lipidico supplementare impartiscono nella cornice di un alto tasso di infusione.

Abbiamo trovato diversi errori comuni da evitare in questo processo di fabbricazione. Primo, eccipienti lipidici devono essere freschi, conservati a -80 ° C, e non utilizzati se scaduta. La soluzione precursore non dovrebbe essere riutilizzato per studi in vivo, come emulsioni risultanti sono incoerenti nella loro distribuzione dimensionale e la frazione di gas massima, e può contenere contaminanti batterici, lipidi ossidati, o grumi lipidici. In secondo luogo, una volta che l'emulsione raggiunge 'viscosità critica' durante la fabbricazione, esso non sarà più efficace pompato attraverso il sistema, e sacche di gas grandi formerà all'interno HCT. La viscosità alta emulsione rende l'emulsione difficile da gestire ed elaborare in siringhe anche. Questi problemi sono meglio evitare misurando l'aumento della frazione di gas all'interno del HCT (quantificando l'aumento di volume come frazione del gas aumenta) e fermare il processo di concentrazione seriale volta le doppie volume iniziale.

Un limite fondamentale di questa tecnica è la necessità persistente di fase di centrifugazione, che è indesiderabile perché crea il potenziale per l'aria e la contaminazione batterica del prodotto finale, e questo impedisce dall'essere un processo continuo. In futuro, la fase di concentrazione seriale può essere modificato in un sistema a singolo passo per produzione di droghe commerciale utilizzando un sistema di scarico idraulico per ovviare alla necessità di centrifugazione batch. L'omogeneizzatore in-linea e miscelatori di laboratorio possono essere fabbricate in acciaio inox 3/16 e sterilizzati in posto. L'inclusione di altri gas nel sistema può ampliare the utilità di questa tecnica ulteriore.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgments

Finanziamento: US Army Medical Research e Materiel Command (USAMRMC) e gestito dalla Telemedicina e Advanced Technology Research Center. Shunxi Ji ha contribuito alla modifica delle siringhe come descritto qui.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Polar Lipids 770365 Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080)
Cholesterol Sigma Aldrich C75209
Plasma-Lyte A VWR 80089-818 Alternatively can use NaCl
Glass collection vessel Specialty Glass, Inc. Custom Contact: Pam Zurbrick - 281-595-2210
Gas composition (oxygen) monitor Precision Medical PM5900L
Sarns 8000 roller pump Calicut Medical 16407 Part of a modular perfusion system
BIOtherm Heat Exchanger Medtronic ECMOtherm-II
Verso laboratory in-line mixer Silverson Machines, Inc TH-IL-102-VERSO Use multistage workheads and front-end extension with T piece
T-piece for Silverson Verso inlet port Process Innovations Custom Contact: Brian Leavitt - 508-423-2266
L5M-A laboratory mixer Silverson Machines, Inc NC0136483 Use mesh emulsor screen (fine)
Rochester-Ochsner toothed forceps Fisher Scientific 13-812-18
140 ml syringe Kendall Healthcare Monoject 8881114030 Ensure there is a luer lock.
IX71 Inverted light microscope Olympus IX71
Retiga-2000R microscope camera QImaging RET-2000R-F-M-12
Accusizer 780A Autodilution PSS-NICOMP Particle Sizing Systems Out of production

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Fabbricazione di concentrato, ossigeno a base di lipidi microbolle emulsioni da High Shear omogeneizzazione e concentrazione seriale
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Thomson, L. M., Polizzotti, B. D., McGowan, F. X., Kheir, J. N. Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration. J. Vis. Exp. (87), e51467, doi:10.3791/51467 (2014).More

Thomson, L. M., Polizzotti, B. D., McGowan, F. X., Kheir, J. N. Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration. J. Vis. Exp. (87), e51467, doi:10.3791/51467 (2014).

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