We demonstreren een-microfluidics gebaseerde test om de termijn voor de cellen om de doorvoer te meten door middel van een opeenvolging van micron-schaal vernauwingen.
Hier hebben gedetailleerd ontwerp, fabricage en het gebruik van een microfluïdische apparaat om de vervormbaarheid van een groot aantal afzonderlijke cellen te evalueren op een efficiënte wijze. Meestal kan gegevens ~ 10 2 cellen verkregen bij een experiment 1 uur. Een geautomatiseerde beeldanalyse programma maakt efficiënte post-experiment analyse van beeldgegevens, zodat verwerking voltooid binnen enkele uren is. De geometrie inrichting is uniek in die cellen moeten vervormen door een reeks van micron-schaal vernauwingen, waardoor het mogelijk de initiële vervorming en tijd-afhankelijke relaxatie van individuele cellen te testen. De toepasbaarheid van deze methode op menselijke promyelocytische leukemie (HL-60) cellen aangetoond. Rijden cellen vervormen door micronschaal vernauwingen behulp drukgedreven flow, zien we dat de mens promyelocytaire (HL-60) cellen tijdelijk af te sluiten de eerste vernauwing voor een mediane tijd van 9,3 msec voordat sneller passage door de daaropvolgende vernauwenionen met een mediane transittijd van 4,0 msec per vernauwing. Daarentegen, all-trans retinoic zuur behandelde (neutrofiel-type) HL-60 cellen occluderen de eerste vernauwing slechts 4,3 msec voor passage door de daaropvolgende vernauwingen met een gemiddelde looptijd van 3,3 msec. Deze methode kan inzicht verschaffen in de visco-elastische aard van de cellen, en uiteindelijk onthullen de moleculaire oorsprong van dit gedrag.
Veranderingen in de cel vorm zijn van cruciaal belang in tal van biologische contexten. Bijvoorbeeld, erytrocyten en leukocyten vervormen door capillairen die kleiner zijn dan hun eigen diameter 1. In metastase, moeten kankercellen vervormen door smalle spleten interstitiële alsook kronkelige vaten en lymfatische netwerken om zaad op secundaire locaties 2. Om het fysieke gedrag van individuele cellen te onderzoeken, microfluïdische apparaten presenteren een ideaal platform dat kan worden aangepast aan een reeks van cel gedrag met inbegrip van hun vermogen om te migreren door smalle openingen 3 en passief vervormen door micronschaal vernauwingen 3 9 bestuderen. Polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdische apparaten zijn optisch transparant, waardoor cel vervormingen worden gevisualiseerd met behulp van een lichtmicroscoop en het gebruik van de basisfuncties voor beeldbewerking gereedschap geanalyseerd. Bovendien kunnen reeksen van vernauwingen nauwkeurig worden ingesteld, zodat de analyse van meerdere cellen tegelijk metthroughput dat veel bestaande technieken 10,11 overschrijdt.
Hier presenteren we een gedetailleerde experimentele protocol voor het sonderen cel vervormbaarheid met behulp van de 'Cell Deformer' PDMS microfluïdische apparaat. De inrichting is zo ontworpen dat cellen passage door opeenvolgende vernauwingen; deze geometrie is gebruikelijk in fysiologische context, zoals de pulmonaire capillaire bed 12. Naar cel vervormbaarheid peilen, transittijd biedt een handige metric die gemakkelijk wordt gemeten als de tijd die nodig is voor een individuele cel voor doorvoer door een enkele vernauwing 4,6. Om een constante drukval over de vernauwde kanalen tijdens cel doorgang te behouden, maken we gebruik van drukgedreven flow. Onze protocol bevat gedetailleerde instructies apparaat ontwerp en fabricage, werking van het apparaat door druk aangedreven stroming, voorbereiding en beeldvorming van cellen, alsook beeldverwerking van de tijd gedurende cellen vervormen door een reeks insnoeringen meten. Wij zijn onder anderezowel apparaat ontwerpen en visie gegevensverwerking code als aanvullende bestanden. Als representatieve steekproef van gegevens, tonen wij cel reistijd door een reeks insnoeringen in functie van het aantal vernauwingen gepasseerd. Analyse van de tijdschaal cellen voor doorvoer hoewel smalle vernauwingen van een microfluïdische inrichting kan verschillen in vervormbaarheid van verschillende celtypen 4,5,13 onthullen. Het apparaat hier gedemonstreerd unieke enquêtes cel doorvoer door een reeks van micron-schaal vernauwingen; dit ontwerp emuleert het kronkelige pad dat cellen ervaren in circulatie en maakt ook vervolma fysieke kenmerken van de cellen zoals relaxatietijd.
Hier bieden we een uitgebreide experimentele procedure voor het analyseren van de vervorming van de cellen op doorreis in ingesnoerd microfluïdische kanalen met behulp van druk-driven flow. Een MATLAB script maakt geautomatiseerde gegevensverwerking (Aanvullend materiaal); een bijgewerkte versie van de code wordt gehandhaafd ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). Meer algemeen kan de hier gepresenteerde technieken worden aangepast in vele cellen gebaseerde ass…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag Lloyd Ung erkennen voor constructieve inbreng in de eerste versies van deze techniek, Dr Jeremy Agresti voor druk cap design tips, en Dr Dongping Qi voor zijn hulp bij het fabriceren van de druk cap. We zijn dankbaar voor de laboratoria van M. Teitell en P. Gunaratne voor het verstrekken van een verscheidenheid aan mobiele monsters voor het testen. We zijn dankbaar voor de National Science Foundation (Career Award DBI-1254185), de UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, en de UCLA Clinical and Translational Science Institute voor de ondersteuning van dit werk.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
16-bit,250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
LabView System Design Software | National Instruments | ||
Matlab Software | The MathWorks, Inc. | Matlab R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |