Summary
ويستخدم رباعي الأبعاد (4D) التصوير لدراسة السلوك والتفاعلات بين نوعين من الإندوسومات في العيش المحطات العصبية الفقاريات. وتتميز حركة هذه الهياكل الصغيرة في ثلاثة أبعاد، والسماح تأكيد الأحداث مثل الانصهار جسيم داخلي وإيماس.
Abstract
وقد استخدمت رباعي الأبعاد (4D) التصوير ضوء لدراسة سلوك هياكل صغيرة داخل المحطات العصب المحرك للالمستعرضة البطنية العضلات رقيقة من ثعبان سام. تضم البيانات الخام تسلسل الوقت الفاصل بين ل3D ض المداخن. كل كومة يحتوي على 4-20 الصور المكتسبة مع عدسات epifluorescence في طائرات التنسيق مفصولة 400-1،500 نانومتر. الخطوات في اكتساب مداخن صورة، مثل تعديل التركيز، والتحول من موجات الإثارة، وتشغيل الكاميرا الرقمية، ومؤتمتة قدر الإمكان لزيادة معدل الصورة وتقليل تلف الأنسجة من التعرض للضوء. بعد الاستحواذ، وdeconvolved مجموعة من مداخن صورة لتحسين القرار المكانية، وتحويلها إلى شكل 3D المطلوب، واستخدامها لإنشاء "فيلم" 4D التي هي مناسبة لمجموعة متنوعة من التحليلات التي تعتمد على الكمبيوتر، اعتمادا على البيانات التجريبية المطلوبة. طلب واحد هو دراسة السلوك الديناميكي للفئتين من الإندوسومات جدت في الأعصاب الطرفية-macroendosomes (MES)والإندوسومات الحمضية (AES) الذي أحجام (200-800 نانومتر لكلا النوعين) هي في أو بالقرب من الحد الحيود. الوصول إلى المعلومات 3D في كل نقطة زمنية يوفر العديد من المزايا التقليدية الوقت الفاصل بين التصوير. على وجه الخصوص، وحجم وسرعة حركة الهياكل يمكن قياسها كميا مع مرور الوقت من دون فقدان التركيز الشديد. أمثلة من البيانات من 4D التصوير تكشف عن أن محلات الصرافة الاقتراب من غشاء البلازما وتختفي، مما يشير إلى أنهم exocytosed بدلا من مجرد التحرك عموديا بعيدا عن طائرة واحدة من التركيز. وكشف أيضا هو الانصهار المفترضة من محلات الصرافة وكيانات، من خلال التصور من التداخل بين الهياكل التي تحتوي على صبغة اثنين كما شوهدت في كل ثلاثة إسقاطات المتعامدة.
Introduction
الوقت الفاصل بين التصوير من الأنسجة الحية يوفر الوصول البصرية للعلاقات هيكل الوظائف الديناميكية التي لا يمكن تقديره في الأعمال التحضيرية ثابتة أو يعيشون تصويرها عند نقطة واحدة في الوقت المناسب. في كثير من الأحيان، ومع ذلك، والمقايضة للحصول على المعلومات الزمانية هو انخفاض في القرار البصرية. الأهداف النفط الغمر عالية الفتحة العددية هي غير عملي في الأنسجة الحية بسبب نطاق ضيق على التركيز، وترك الغمر بالماء أو أهداف الجافة باعتبارها بدائل فقط. وعلاوة على ذلك، فإن قرار زيادة يوفرها البصريات متحد البؤر لا يمكن استخدامها في بعض الاستعدادات المعيشة بسبب الضيائية من مستويات عالية نسبيا من الإضاءة المطلوبة 1،2. أخيرا، في حين أن العديد من الوقت الحقيقي أو الوقت الفاصل بين التقنيات البصرية المتاحة التي عرض القرار المحسن تطبيقها يقتصر على الاستعدادات حيث يمكن وضعه داخل هياكل الفائدة بضع مئات نانومتر الهدف 1. الطريقة الموضحةيجعل من استخدام المعدات قليلة التكلفة نسبيا، هي متعددة، ولكن يقدم تحسين القرار مقارنة استخداما أكثر التقنيات مرور الزمن. الغرض منه هو للاستخدام في المختبرات الفردية فضلا عن مرافق التصوير.
يستخدم الأسلوب المجهري epifluorescence التقليدية، جنبا إلى جنب مع كاميرا رقمية حساسة ومع الأجهزة المصممة لاكتساب بسرعة مجموعات من الصور في طائرات التنسيق مختلفة قليلا (ض مداخن). وdeconvolved كل ض المكدس رقميا لزيادة القرار. ميزة واحدة من 3D مرور الزمن (4D) التصوير هو تتبع دقيق من العضيات تتحرك أو غيرها من الهياكل. عند تعيين بشكل صحيح حتى والهياكل المصورة لا يخرجون من التركيز، والحركة في كل الاتجاهات الثلاثة يمكن ملاحظتها وقياسها. وبالتالي فإنه من المستحيل لهيكل الملون لتختفي على واحد أو أكثر من لقطة مرور الزمن بمجرد الانجراف أعلاه أو أدناه البؤري الضيقة. يخدم الأسلوب أيضا كأداة حساسة لتقييم التفاعلات وممكن فوسيون هياكل صغيرة. epifluorescence التقليدية أو الصور متحد البؤر هياكل بالقرب من الحد حيود (بضع مئات نانومتر) لا تؤكد الانصهار حتى لو تظهر الصور اندمجت التداخل من التسميات كل منهما 3. ويقترح الانصهار، ولكنه لا يزال من الممكن أن يتم فصل الكائنات أفقيا أو رأسيا لمسافة التي هي أقل من الحد الحيود. ثلاثة أو التصوير رباعي الأبعاد، في المقابل، يسمح بمشاهدة الكائنات في كل من ثلاثة اتجاهات متعامدة. مظهر الانصهار في جميع وجهات النظر الثلاثة يزيد من مستوى اليقين. وفي بعض الاستعدادات المعيشة، وجهت الحركة البراونية أو الأجسام تنصهر مزعومة يوفر دليلا آخر عند نقل كل التسميات معا في الوقت المناسب. بطبيعة الحال، عندما بالقرب من الحد حيود مستوى اليقين في الهياكل المميزين من الخلفية، أو التي تبين أنها تحتوي على اثنين من الأصباغ (الانصهار)، ليست مطلقة. إذا، تقنيات متخصصة للتطبيق، مثل مضان بالرنين نقل الطاقة (الحنق)4، هي أكثر ملاءمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد وصمة عار مع الأصباغ فوق حيوي
- لبروتوكول تشريح سام ثعبان رؤية ستيوارت وآخرون. 5 وتنغ وآخرون لا يزال 6 الأنسجة زاحف الفسيولوجية لأوقات أطول، وأقل التلوث الجرثومي، عندما يحتفظ بها في درجات حرارة منخفضة (انظر أدناه). وعادة ما يتم الاحتفاظ أنسجة الثدييات في درجة حرارة الغرفة أو أعلى.
- لالليزوزومية صبغ تلطيخ الحيوية، ويحل الصبغة في البرد الزواحف 1:5،000 الحل قارعو الأجراس (0.2 ميكرومتر). احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. يغسل عدة مرات مع قارعو الأجراس الباردة. صورة في أقرب وقت ممكن.
- لFM1-43 تلطيخ باستخدام التحفيز بوكل، ويخفف من الصبغة في عالية بوكل-قارعو الأجراس 1:500 (7 ميكرومتر). احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30-60 ثانية كحد أقصى. يغسل ثلاث مرات بسرعة مع قارعو الأجراس الباردة، ~ 1 دقيقة / الشطف. صورة في أقرب وقت ممكن.
- لFM1-43 تلطيخ باستخدام مفرط التوتر (السكروز) التحفيز، ويخفف من الصبغة في 0.5 M قارعو الأجراس السكروز على النحو الوارد أعلاه. احتضان عند 4 & #176؛ مئوية لمدة 2-5 دقيقة. يغسل كما في الخطوة 1.3 أعلاه مع قارعو الأجراس الباردة. صورة في أقرب وقت ممكن.
- لFM1-43 تلطيخ عبر التحفيز الكهربائي، انظر تنغ وآخرون. 6 لفترة وجيزة، يتم وضع إعداد طبق يحتوي على محلول ملحي الفسيولوجية والصبغة. يتم تحفيز العصب مع قطار مبرمج مسبقا من 200 μsec البقول مستطيلة (~ 7 V، 30 هرتز، 18 μsec). يغسل كما في الخطوة 1.3 أعلاه مع قارعو الأجراس الباردة. صورة في أقرب وقت ممكن.
2. تكوين إعداد للتصوير
- توجيه إعداد بحيث هياكل الفائدة في أقرب وقت ممكن إلى الهدف المجهر.
- إذا تم استخدام مجهر مقلوب، واستخدام غرفة التي تحتوي على رقيقة جولة زلة تغطية القاع. عادة، يجب أن يكون غرفة التصوير رقيقة أسفل الفولاذ المقاوم للصدأ مع 25 مم # 1 كوب سمك الغطاء زلة في المركز. إذا تم استخدام المجهر تستقيم، لا يشترط ساترة القاع ولكن من المفيدللسماح التصوير مع ضوء المنقولة (مثل تدخل الفرق النقيض من ذلك، DIC) لتوجيه العينة وتحديد مواقع الأشياء المثيرة للاهتمام.
- اختيار الهدف المناسب للحصول على أعلى دقة ممكنة 3D. هناك مفاضلات بين الفتحة العددية (غير متوفر)، بعد العمل، التكبير، ونوع من عدسة (الجاف، المياه والنفط الغمر). لمستحضرات رقيقة مثل مزارع الأنسجة، والأهداف النفط هي الأفضل. باستخدام المجهر تستقيم، تطفو زلة تغطية على حمام مائي، واستخدام زيت الغمر بين الجزء العلوي من الغطاء زلة وموضوعية.
- إذا تم استخدام البرمجيات deconvolution، البائع قد تقدم سلفا انتشار نقطة ظائف (PSFS) لتحقيق أهداف معينة. إذا لم يتم توفير هذه المعلومات، أو إذا ما تم اختيار هدف غير معتمد، وتحديد PSF عن طريق التصوير microdots الفلورسنت أو الأجسام محدودة حيود مماثلة 7،8.
3. تأسيس العمق المرغوب الميدانية وعدد إيماغيس المرغوب في الوقت الفاصل بين الإطار
- حدد عمق إجمالي قدره حقل بحيث تتحرك أو التفاعل هياكل الفائدة لا تختفي أو الخروج من التركيز لأنها تتحرك في اتجاه زي. في الميدان ض يجب أن يتجاوز قليلا البعد العمودي للعملية الخلية أو الخلايا التي يجري تصويرها. لمحطات السيارات الفقاريات، 15-20 ميكرومتر هو نموذجي.
- حساب الخطوة ض محور اللازمة لكل زيادة التركيز. القرار على طول محور ض يختلف تبعا خصائص الهدف؛ فهو يقع في حوالي ربع هذا القرار الطائرة س ص. إذا تم استخدام إما التصوير متحد البؤر أو برامج deconvolution، تم تحسين القرار ض محور. تحسين القرار النهائي من قبل الإفراط المتعمد في اتجاه زي 5، ولكن انظر أيضا الخطوة 3.3 أدناه. فاصل خطوة نموذجية في نطاق من 400-1،500 نانومتر لأهداف 40-100X. ينبغي أن أغلقت ضوء قبالة بين كل صورة ض الخطوة.
- حدد عدد الصور في كل ض المكدس، وهما العمق المطلوب من حقل تقسيمقبل الفاصل الخطوة. الوقت لاستكمال نموذجي ض المكدس هو 1-10 ثانية. الأجسام التي تتحرك بسرعة (100 نيوتن متر / ثانية) يمكن أن تظهر واضحة في صورة كومة 3D لأن كل صورة الطائرة يتوافق مع نقطة زمنية مختلفة قليلا. أيضا، يساهم كل صورة إضافية لphotobleaching من والضيائية ممكن (انظر مناقشة). إذا تنتمي إما الوضع، واختيار أكبر ض خطوة لجمع الصور أقل في المكدس. تعويض في وقت لاحق باستخدام برنامج صورة الاستيفاء (الخطوة 6.3 أدناه).
4 حدد الوقت الفاصل بين معدل الإطار
تختار من التجريب المعدل الذي هو مجرد كافية لحل بسلاسة يتغير مع الزمن مثل الحركة، أو تفاعلات الأحداث الانصهار 9. تحت أخذ العينات يمكن أن تنتج الحركة الفنية (أخطاء أخذ العينات)، في حين أن الإفراط يزيد التعرض للضوء دون داع. جمع إما سلسلة طويلة واحدة أو عدة سلاسل متكررة من نفس التحضير، مع كل فترة زمنية صغيرة نسبيا الوقت الإجمالي ( 5. أكمل جميع تصوير لايف لإعداد خاص ولا تزال الاستعدادات الزواحف عادة قوية ل~ 1-2 ساعة، أطول إذا تبريده. 6. تحليل البيانات وفقا لاستخدام المرغوب
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
البيانات المعروضة هي من المحطات ثعبان العصبي العضلي (انظر الآراء المنخفضة والعالية التكبير في الشكل 3، وصبغ التقامي (FM1-43) امتصاص يخلق الضباب الذي يملأ كل حبة)، وعلى وجه الخصوص، macroendosomes (MES) والإندوسومات الحمضية (AES) داخل هذه المحطات 5. يتم إنشاء محلات الصرافة عن طريق الإلتقام الأكبر خلال النشاط العصبي 10 وعددهم ينخفض بشكل كبير مع مرور الوقت بعد توقف النشاط 6. وكان استخدام 4D التصوير الحي لتحديد ما إذا محلات الصرافة التحرك نحو غشاء البلازما وتختفي بسرعة، مما يشير إلى أن عددهم يتناقص لأن بعض منهم exocytose. وكانت جميع هذه محلات الصرافة حاضرا في نقطة زمنية واحدة (والذين من قبلكم) واختفت تماما عند نقطة في المرة القادمة (وتلك بعد). وبالتالي فإن الوقت اللازم لاختفاء كان أقل من الإطار الزمني لدينا (قصيرة بقدر 30 ثانية) وبما يتفق مع إيماس. نظرية بديلة، وليس مدعومة ببيانات 4D، هو أن محلات الصرافة تبدد ببطء عبر مهدها من الخامسesicles حتى تتلاشى. يحدث في مهدها حويصلة 6، ولكن exocytosed على الأقل بعض محلات الصرافة سواء أثناء أو بعد في مهدها 5. الشكل 1 و السينما S1 توضيح اختفاء ME بين إطارين الوقت الفاصل. لم محلات الصرافة متجهة إلى تختفي لن تغير الشكل أو سطوع أكثر من اثنين أو أكثر من الإطارات (N = 16)، الذي كان يتفق مع تبديد بطيئة خلال الفترة الزمنية للفيلم (بداية عدة دقائق بعد التحفيز وجيزة). وقد لوحظ اختفاء ME سابقا في الوقت الفاصل بين التقليدية، ولكن كان من الممكن أن الهياكل قد غادر ببساطة الطائرة من التركيز. وعلاوة على ذلك، وعرض من مجموعة متنوعة من وجهات النظر (السينما S1) أكد أن اختفاء ME كانت مفاجئة. مع تصوير حي التقليدية (يبحث من منظور واحد، على سبيل المثال الطائرة صورة س ص) التحف الضوضاء تحد من قدرة المحقق للتأكد من أن هيكل لم يتغير. مثل هذه التحف غالبا ما تكون موجودةفي رأي واحد ولكن ليس غيرها.
وأظهرت دراسات المجهر الإلكتروني أن الإندوسومات في محطات السيارات صغيرة الحجم، بالقرب من الحد حيود الضوء 10. وبالتالي انصهار هذه الإندوسومات لا يمكن تمييزها تماما من جمعية المكانية يغلق عند مستوى الضوء. وصفت محلات الصرافة مع FM1-43 (الأخضر الاستشعاع)، و AES مع صبغة حيوية الليزوزومية (الحمراء الاستشعاع). ولوحظ أن الهياكل fluoresced في كل الألوان (الأصفر الظهور) أحيانا في صورة سجلات 4D. باستخدام البرمجيات المناسبة، تم إنشاؤها آراء هذه الإندوسومات المزدوج المسمى وبالتالي تنصهر يبدو من مجموعة متنوعة من منظور من أجل دراسة صدفة من التسميات اثنين في voxels بالقرب من وداخل هيكل واضح. الشكل 2 يظهر المفترضة تنصهر AE-ME كما ينظر اليها من ثلاثة اتجاهات متعامدة. رأي واحد هو الطائرة س ص؛ آراء أخرى متعامدة لتلك الطائرة وإلى بعضها البعض. باستخدام هذا الأسلوب تبين أن voxelsإما تتداخل، كما في هذا المثال، أو أنهم فعلوا واضح ليس في واحد أو أكثر الطائرات المشاهدة. يظهر الفيلم S2 نفس المفترضة تنصهر AE-ME قدمت بمثابة عرض الواقع الافتراضي التفاعلي (للتدوير بالكامل في 3 أبعاد).
deconvolution الرقمية هي أداة مفيدة لتعزيز قرار 3D 4D وكذلك الصور، من المجاهر التقليدية ومتحد البؤر 11. Deconvolution هو عملية تكرارية العددي الذي يعوض إلى حد ما، على القرار المكانية محدودة للهدف المستخدمة. ويتميز هذا القرار مع انتشار نقطة دالة حجم 3D الهدف الذي سيشغله صورة نقطة متناهية الصغر. من الناحية النظرية، deconvolution يستعيد الصورة التي من شأنها أن تؤدي إذا كانت الهدف المثالي. الشكل 3 نسخة 3D من حجم مجموعتين بيانات مختلفة، كل عرض كزوج من anaglyphs الأحمر والأخضر. تظهر الصور الحق تحسين نموذجية في الحدة بعد دي الرقميةالتفاف للصورة المكدس.
يختفي الرقم 1. A macroendosome (ME) بعد اتصال واضحة مع غشاء البلازما. وحفز وإعداد العصبي العضلي ثعبان كهربائيا في وجود FM1-43. وقد تم جمع البيانات باستخدام التصوير 4D كما هو موضح في طرق ويتم عرض باسم "مشاهدة الحجم 3D" في ست نقاط الوقت (60 ثانية فاصل) لتوضيح Z-عمق حبة واحدة. وME يمكن ملاحظة الابتعاد عن محور Y (خط متقطع أحمر) على مدى عدة إطارات قبل ان تختفي بين نقاط الوقت 5 و 6. وقبل اختفاء، يظهر لي أن يكون موجودا في الغشاء البلازمي للحبة ل(بين العلامتين FM1-43 حويصلة تلطيخ أو "الضباب؛" انظر الشكل 3 أسطورة). فإن ME لا تعود الى الظهور فيفي وقت لاحق نقاط الوقت (لا تظهر البيانات، وانظر فيلم S1). شريط النطاق، 2 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيلم S1: الوقت الفاصل بين وجهات النظر 4D من ME اختفاء اضغط هنا لمشاهدة الفيلم. يظهر نفس مجموعة البيانات الخام المعروضة في الشكل (1)، "وجهة نظر حجم 4D" في التكبير أقل. ويتألف تسلسل الوقت الفاصل بين الأصلي 8 نقاط الوقت، كل مفصولة 60 ثانية؛ تشغيل هو في 4 لقطة / ثانية. بشكل مؤقت لفترة وجيزة تسلسل في بداية كل 24 3D الخطوات الدوران حول المحور ص (15 درجة / خطوة) للفت الانتباه إلى اختفاء ME (السهم الأحمر) قريبا-أن ل. علما بأن ME مرئيا، تقترب من حافة حبة (غشاء البلازما)، يختفي، ولا يعود، فيعرض جميع وجهات النظر. بسبب انخفاض القرار ض محور بالمقارنة مع القرار س ص، شكل ME يبدو أن إطالة وتقصير اعتمادا على مشاهدة المنظور. تم تصدير الصور كفيلم كويك تايم، والمشروح باستخدام كويك تايم برو. شريط النطاق، 2 ميكرون.
كانت ملطخة الرقم 2. مشاهدة متعامد لجسيم داخلي تنصهر المفترضة. وإعداد العضلات العصبية بالتتابع مع صبغة حيوية الليزوزومية (أحمر) لتسمية كيانات وFM1-43 (الأخضر) لتسمية محلات الصرافة باستخدام 0.5 M التحفيز السكروز كما هو موضح في طرق. يتم عرض البيانات من نقطة زمنية واحدة من فيلم 4D وجهات النظر 3D حجم في ثلاثة توجهات. في أعلى (لوحات 1-3) هو وجهة النظر التقليدية من فوق (الطائرة س ص). في منتصف (لوحات 4-6) نسخة عمودي على الطائرة س ص وفي (التعسفي) اتجاه السهم حمراء كبيرة. في الجزء السفلي (لوحات 7-9) نسخة المتعامدة على كل وجهات النظر المذكورة أعلاه، في اتجاه السهم الأزرق كبير. وME (الأخضر) وضعت بواسطة سهم أخضر؛ وتتميز اثنين كيانات (الأحمر) عن طريق السهام الحمراء. يتم وضع علامة جسيم داخلي تحتوي على كل من الأصباغ (الصفراء) من قبل السهم الأصفر في لوحات 3 و 6 و 9. لاحظ أن تداخل الأحمر والأخضر اكتمال قدم المساواة في جميع الإسقاطات المتعامدة الثلاثة. شريط النطاق، 2 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيلم S2: دوران الصورة التفاعلية التي تحتوي على محلات الصرافة والإندوسومات الحمضية كيانات . اضغط هنا لمشاهدة الفيلم يظهر مجموعة من البيانات من الشكل 2 تكوينه لصورة 3D للتدوير بالكامل (كويك تايم Reali الظاهريتاي الشكل؛ استخدام الماوس لتدوير الصورة للعرض من أي اتجاه). والمفترضة تنصهر ME / AE يبقى الصفراء من جميع وجهات النظر.
الرقم 3. يعزز Deconvolution القرار المكانية 3D. اثنين من المحطات النموذجية ثعبان العصبية، كما هو موضح في انخفاض (أعلى) وعالية (القاع) التكبير على التوالي وملطخة خلال التحفيز مع FM1-43. FM1-43 الخلفية "الضباب"، نظرا لوضع العلامات الفردية حويصلات 50 نانومتر، ويظهر على شكل حبات محطة خلاله تقتصر محلات الصرافة. يتم عرض البيانات كما anaglyphs الاحمر والاخضر وجهات النظر 3D حجم (عمق يمكن تصور مع النظارات الأحمر والأخضر أو الأحمر والأزرق والأحمر في العين اليسرى؛ علما محوار في اليسار العلوي ينحدر إلى الطائرة من محطة من فوق). لوحات اليسار: البيانات الخام؛ لوحات اليمين: البيانات بعدdeconvolution. لاحظ تحسنا كبيرا في قرار من محلات الصرافة. لوحات أعلى: التحفيز الكهربائي؛ محطة كامل عرض (~ 30 × 50 ميكرون) (نفس البيانات الخام كما في الشكل (1) وفيلم S1؛ شريط النطاق، 10 ميكرومتر). لوحات القاع: التحفيز بوكل؛ تضخيم لإظهار أربع حبات الفردية (~ 3 × 5 ميكرون؛ شريط النطاق، 2 ميكرون). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الجانب الأكثر أهمية من التصوير 4D هو إدارة مدة وشدة التعرض للضوء. photobleaching من النقصان صورة نسبة الإشارة إلى الضوضاء ويمكن أن يكون مشكلة أم لا اعتمادا على عوامل مختلفة، بما في ذلك اختيار fluorophores. ويرتبط الضرر غير محددة لالأنسجة الحية (الضيائية) لphotobleaching من، ويمكن في بعض الأحيان أن تحدد باستخدام تحقيقات الفلورسنت مصممة لغرض أو 2،12 عن طريق الفحص من التشكل مع عدسات brightfield مناسبة، مثل تدخل الفرق النقيض (DIC).
فمن الممكن، مع ذلك، للحث على تأثير الفسيولوجية التي تحدث في مستويات الضوء أقل بكثير من حجم تلك المرتبطة photobleaching من والضيائية. على سبيل المثال، في التجارب المبكرة استخدام مستحضرات متعددة، ثابتة كل في وقت مختلف بعد التحفيز، وتم قياس المعدل الذي اختفى محلات الصرافة مع مرور الوقت بعد التحفيز وجيزة 6. كما هو الممارسة القياسية رس تقليل يتلاشى، وأبقى الاستعدادات في الظلام حتى كان ينظر إليها. عندما أجريت تجارب مماثلة باستخدام التصوير الحية 4D، ظلت العديد من محلات الصرافة في كافة مراحل التجربة (~ 20-60 دقيقة) ولم تختفي. استخدام نفس البروتوكول التصوير الحية، باستثناء عدم تسجيل الواقع والحد من التعرض للضوء إلى إطار 3D واحدة في بداية وإطار واحد في نهاية بذلك، استعادة المعدل العام المتوقع اختفاء جسيم داخلي إلى أن من الاستعدادات الثابتة.
أشار أيضا استكشاف الأخطاء وإصلاحها أن معدل الاختفاء كان في جزء منه، وعكسيا المتعلقة مفردة النغمة إلى إجمالي التعرض للضوء أثناء التجربة. بعد محاولات فاشلة للحد من التعرض عبر البصريات متحد البؤر التقليدية وmultiphoton، تم حل المشكلة أخيرا من شراء الكاميرا أكثر حساسية ~ 3X (الجدول 1). فمن المستحسن أن يتم إجراء مقارنات مماثلة إن أمكن، اعتمادا على التطبيق المستخدم. إذا كان بعض عويجري توثيق rocess أو الانتقال مع مرور الوقت، تؤكد أنه لا يوجد التعديل يعزى إلى شدة أو المدة الإجمالية للإضاءة. والضيائية photobleaching من هي صبغة محددة. على سبيل المثال، ونحن لا يرى كبير يتلاشى بعد تكرار 4D التصوير من محطة واحدة (350 التعرض ضوء الفردية أكثر من 30 دقيقة) باستخدام FM1-43. نفس البروتوكول التصوير باستخدام صبغة مشابهة، SGC5 (الجدول 1)، ومع ذلك، أدت في بعض يتلاشى و، ويفترض، فضلا الضيائية (لا تظهر البيانات).
باستثناء التحسينات التي تقدمها deconvolution الرقمية (والبصريات متحد البؤر إذا ما استخدمت؛ لا يظهر)، وطريقة واضحة وصفها لا يقدم أي "سوبر" القرار. ومع ذلك، فإن الأسلوب له ميزة تحسين القرار العملي أو بديهية عند عرض هياكل المعيشة، ولا سيما تلك التي تتحرك، له حجم عند أو أكبر قليلا من الحد الحيود. القدرة على عرض الكائنات من وجهات نظر مختلفة، includiعرض نانوغرام في كل من ثلاث طائرات المتعامدة، وأدلة المحقق ما إذا كان هيكل موجود بالفعل فوق مستوى الضوضاء وعما إذا كان هو المسمى من قبل واحد أو أكثر fluorophores. على سبيل المثال، في تجارب مصممة ل quantitate عدد وحجم محلات الصرافة وكيانات، وكان من الممكن لتأكيد أن هيكل كان واضحا من وجهات نظر مختلفة، والتي كانت كل البعد (وبالتالي حجمه ثلاثي الأبعاد) ضمن مدى محدد لذلك هيكل. كما يتم تعريف مكان وجود هيكل أفضل، على سبيل المثال، ضمن محور عصبي، الأعصاب الطرفية وغيرها. بدلا من أعلاه أو أسفله. في المقابل، عندما كانت تقتصر على مجال الرؤية إما لطائرة 2D صورة واحدة أو إلى إسقاط واحد من البيانات 3D، والهياكل المفترضة ثبت في كثير من الأحيان إلى أن تكون "الضوضاء". وبالمثل، والهياكل المزدوج المسمى المفترضة ثبت في كثير من الأحيان أن يكون اثنين من الهياكل التي ظهرت تتزامن من وجهة نظر واحدة العرض (أو اثنين) ولكن ليس من كل شيء. التصور من ثلاثة المباشره متعامديوفر ستعقد على مستوى ومعيار روتينية لتقييم خصائص الوجود، والحجم، ووسم الإندوسومات أو هياكل مماثلة لاستخدامها في التحليلات الكمية والإحصائية.
منهجية وصفها هو عملي في هذا المجهر الفيديو التقليدية من نوع وجدت في العديد من المختبرات يمكن استخدامها. والأجهزة هي متعددة بدلا من المتخصصة، وغير مكلفة نسبيا. في حين تم استخدام برامج معينة لمجهر خاص هنا، والبرمجيات المفتوحة المصدر لكلا الحصول على الصور ومعالجة البيانات يمكن أن تنتج نتائج مماثلة 13. تقنيات (بما في ذلك deconvolution) تنطبق على واحد ومتحد البؤر multiphoton التصوير مع مزايا مماثلة، طالما يتم التغاضي التعرض للضوء عن طريق إعداد المعيشية المستخدمة. في المستقبل، سوف تزيد من تعزيز التحسينات تصميم الأداة المساعدة 4D التصوير الحي. وتشمل هذه، في المقام الأول، والأجهزة التي تعزز سرعة التركيز وتصفية الإثارة / الانبعاثات تشاnging، وتوفر أكثر حساسية كاميرات الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية الأميركية للصحة منح NS-024572 (لRSW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| SGC5 | Biotium, Hayward, CA | 70057 | Final conc: 10 mM |
| FM1-43FX | Invitrogen, Carlsbad, CA | F35335 | Final conc: 7 mM |
| LysoTracker Red | Invitrogen, Carlsbad, CA | L7528 | Final conc: 0.2 mM |
| Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2.5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High KCl Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 86 mM | ||
| KCl | 60 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High Sucrose Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2.5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| Sucrose | 0.5 M (17.1 g/50 ml) | ||
| Axioplan 200 inverted microscope | Carl Zeiss, Thornwood, NY | www.zeiss.com | |
| N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm | Carl Zeiss, Thornwood, NY | www.zeiss.com | |
| DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher | Sutter Instruments, Novato, CA | 175W Xenon arc lamp | www.sutter.com |
| Lambda 10-2 emission filterwheel switcher | Sutter Instruments, Novato, CA | www.sutter.com | |
| Sensicam CCD camera | Cooke Instruments, Tonawanda, NY | www.cookecorp.com | |
| Cascade 512 CCD camera | Photometrics, Tucson, AZ | www.photometrics.com | |
| Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins | |||
| Software | |||
| Slidebook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO | Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation | www.intelligent-imaging.com |
| IMARIS 7.5.2 | Bitplane, South Windsor, CT | Drift correction; 3D and 4D data presentation | www.bitplane.com |
| AfterEffects CS6 | Adobe, San Jose, CA | Drift correction | www.adobe.com |
| ImageJ 1.46 | National Institutes of Health, Bethesda, MD | Multiple plugins available; Stereo pair construction | http://rsbweb.nih.gov/ij |
| Zeiss LSM | Carl Zeiss, Thornwood, NY | Stereo pair construction | www.zeiss.com |
References
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M.
- Tinevez, J. -Y., et al. A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope. Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).
- Snapp, E. L., Hegde, R. S. Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells. Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).
- Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. Late" macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals. J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).
- Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons. J. Physiol. 582, 243-262 (2007).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19, 373-385 (1999).
- Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).
- Cromey, D. W. Digital images are data: and should be treated as such. Methods Mol. Biol. Taatjes, D. J., Roth, J. 931, 1-27 (2013).
- Teng, H., Wilkinson, R. S. Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals. J. Neurosci. 20 (21), 7986-7993 (2000).
- Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals. J. Neurosci. 19 (12), 4855-4866 (1999).
- Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L. Challenges and recent advances in live cell bioimaging. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. Mendez-Vilas, A., Diaz, J. , 1495-1505 (2010).
- Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software. J. Vis. Exp. (49), (2011).
