Summary
הדמיה ארבעה ממדים (4D) מנוצל כדי ללמוד את ההתנהגות ואינטראקציות בין שני סוגים של endosomes בחיים מסוף עצב חוליות. תנועה של המבנים הקטנים האלה מתאפיינת בשלושה ממדים, המאפשרת אישור של אירועים כגון היתוך endosome וexocytosis.
Abstract
ארבעה ממדים (4D) אור הדמיה נעשתה שימוש כדי ללמוד את ההתנהגות של מבנים קטנים בתוך מסוף עצב המוטורי של transversus abdominis שריר הרזה של נחש הבירית. הנתונים גולמיים כוללים רצפים של Z-ערימות 3D זמן לשגות. כל ערימה מכילה 4-20 תמונות שנרכשו עם אופטיקה epifluorescence במטוסי מוקד מופרדים על ידי 400-1,500 ננומטר. שלבים ברכישת ערימות של תמונות, כגון התאמה של מיקוד, מיתוג של אורכי גל עירור, ותפעול של המצלמה הדיגיטלית, הם אוטומטיים ככל האפשר על מנת למקסם את קצב תמונה ולמזער את הנזק לרקמות כתוצאה מחשיפה לאור. לאחר רכישה, קבוצה של ערימות תמונה deconvolved כדי לשפר את הרזולוציה מרחבית, שהומר לפורמט 3D הרצוי, ומשמש ליצירה "סרט" 4D כי הוא מתאים למגוון רחב של ניתוחים מבוססי מחשב, בהתאם לנתונים הניסיוניים ביקשו. יישום אחד הוא מחקר של ההתנהגות הדינמית של שתי מעמדות של endosomes מצאו במסופים-macroendosomes עצב (MES)וendosomes חומצי (AES), שגדלים (200-800 ננומטר עבור שני הסוגים) הן ליד או לגבול ההשתברות. גישה למידע 3D בכל נקודת זמן מספקת מספר יתרונות על פני הזמן לשגות הדמיה קונבנציונלית. בפרט, גודל ומהירות תנועה של מבנים ניתן לכמת לאורך זמן ללא אובדן המיקוד חד. דוגמאות לנתונים מהדמית 4D עולים כי MES ניגש קרום הפלזמה ונעלמים, מה שמרמז שהם exocytosed ולא רק נעים אנכי ממישור אחד של מוקד. חשף גם הוא היתוך משוער של MES ו-AES, על ידי הדמיה של חפיפה בין שני המבנים המכיל צבען כפי שנצפו בכל שלוש תחזיות המאונכות.
Introduction
זמן לשגות הדמיה של רקמת חיה מספקת גישה חזותית ליחסי תפקוד והמבנה דינמיים, שלא ניתן להערכה בהכנות קבועות או חיים צילמו בנקודה אחת בזמן. לעתים קרובות, עם זאת, שהתגמול עבור גישה למידע זמני הוא ירידה ברזולוציה אופטית. מטרות נפט טבילה צמצם מספרי גבוהה הן מעשיות ברקמת חיה בגלל הטווח הצר שלהם בפוקוס, והשאירו את הטבילה במים או מטרות יבשות כחלופות בלבד. יתר על כן, ברזולוציה המוגברת המוענקת על ידי אופטיקה confocal לא יכולה להיות מנוצל בכמה הכנות חיים בשל phototoxicity מהרמות גבוהות היחסי של תאורה הנדרשת 1,2. לבסוף, בעוד כמה שיטות אופטיות בזמן אמת או זמן לשגות זמינות שרזולוציה משופרת ההצעה, תחולתם מוגבלת להכנות שבו מבנים של עניין יכולים להיות ממוקמות בתוך כמה מאה ננומטרים של המטרה 1. השיטה המתוארתעושה שימוש בציוד בעלות נמוכה יחסית, הוא תכליתי, ובכל זאת מציעה רזולוציה משופרת בהשוואה לטכניקות זמן לשגות יותר נפוץ בשימוש. הוא מיועד לשימוש במעבדות בודדות, כמו גם מתקני הדמיה.
השיטה משתמשת במיקרוסקופ epifluorescence קונבנציונלי, בשילוב עם מצלמה דיגיטלית רגישה ועם חומרה שנועדה לרכוש במהירות סטים של תמונות במישורים שונים מעט מוקד (Z-ערימות). כל Z-מחסנית היא deconvolved דיגיטלי כדי להגדיל את הרזולוציה. תכונה אחת של 3D הדמיה זמן לשגות (4D) היא מעקב מדויק של העברת אברונים או מבנים אחרים. כאשר להגדיר כראוי, מבנים צילמו לא לצאת מפוקוס, ותנועה בכל שלושת הכיוונים ניתן להבחין ולכמת. לכן זה בלתי אפשרי עבור מבנה מוכתם להיעלם מעל מסגרות זמן לשגות אחד או יותר רק על ידי היסחפות מעל או מתחת למישור מוקד צר. השיטה משמשת גם ככלי רגיש להערכת האינטראקציות ופו האפשרישיאון של מבנים קטנים. epifluorescence הקונבנציונלי או תמונות confocal של מבנים סמוכים לגבול ההשתברות (כמה מאה ננומטר) לא לאשר מיזוג גם אם תמונות התמזגו להראות חפיפה של התוויות שלהם 3. היתוך הוא הציע, אבל זה עדיין אפשרי שהאובייקטים מופרדים אופקי או אנכי על ידי מרחק שהוא מתחת לגבול ההשתברות. שלוש או הדמיה ארבעת ממדים, לעומת זאת, מאפשרת צפייה באובייקטים בכל אחד משלושה כיוונים מאונך. המראה של היתוך בכל שלוש התצוגות מגדיל את רמת הוודאות. וגם, בכמה הכנות חיים, בבימוי או תנועה הבראונית של אובייקטים התמזגו putatively מספקת הוכחה נוספת, כאשר שני התוויות לנוע יחד בזמן. כמובן, כאשר סמוך לגבול השתברות רמת הוודאות במבני הבחנה מהרקע, או שמראה שהם מכילים שני צבעים (היתוך), אינה מוחלטת. אם טכניקות ישימות, מיוחדות, כגון העברת הקרינה תהודה אנרגיה (סריג)4, הם מתאימים יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. כתם ההכנה עם Supravital צבעים
- לפרוטוקול נתיחת נחש הבירית לראות סטיוארט et al. 5 וטנג et al. 6 רקמות זוחלות נשארה פיסיולוגיות לזמנים ארוכים יותר, ועם פחות זיהום חיידקים, כאשר כל הזמן בטמפרטורות נמוכות (ראה להלן). רקמות יונקים בדרך כלל נשמרו בטמפרטורת חדר ומעלה.
- עבור מכתים צבע חיוני lysosomal, לפזר את הצבע ב1:5,000 הקר הזוחל אצבעות פתרון (0.2 מיקרומטר). דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לשטוף מספר פעמים עם אצבעות קרות. תמונה בהקדם האפשרי.
- לFM1-43 צביעה באמצעות גירוי KCl, לדלל את הצבע ב-high-KCl האצבעות 1:500 (7 מיקרומטר). דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 30-60 מרבי שניות. שטוף במהירות שלוש פעמים עם אצבעות קרות, ~ דקות 1 / שטיפה. תמונה בהקדם האפשרי.
- לFM1-43 צביעה באמצעות גירוי hypertonic (סוכרוז), לדלל את הצבע ב0.5 M אצבעות סוכרוז כאמור לעיל. דגירה על 4 & #176; C למשך 2-5 דקות. שטוף כמו בשלב 1.3 לעיל עם אצבעות קרות. תמונה בהקדם האפשרי.
- עבור מכתים FM1-43 באמצעות גירוי חשמלי, ראה טנג et al. 6 בקצרה, ההכנה ממוקמת מנה המכילה תמיסת מלח פיזיולוגית וצבע. עצב מגורה עם רכבת מתוכנת מראש של 200 μsec פולסים מלבניים (~ 7 V, 30 הרץ, 18 μsec). שטוף כמו בשלב 1.3 לעיל עם אצבעות קרות. תמונה בהקדם האפשרי.
2. הגדר את ההכנה להדמיה
- לכוון את ההכנה כך שמבנים של עניין הם קרובים ככל האפשר למטרת מיקרוסקופ.
- אם נעשה שימוש במיקרוסקופ הפוכה, לנצל את תא תחתון שמכיל להחליק את מכסה עגול דק. בדרך כלל, חדר ההדמיה צריך תחתית נירוסטה דקה עם תלוש 25 מ"מ קוטר # 1 זכוכית עובי כיסוי במרכז. אם נעשה שימוש במיקרוסקופ זקוף, coverslip תחתון הוא לא חובה אבל שימושיכדי לאפשר הדמיה עם אור מועבר (למשל התערבות ההפרש לעומת זאת, DIC) כדי לכוון את הדגימה ולאתר אובייקטים של עניין.
- בחר אובייקטיבי מתאים לקבל את ההחלטה ב3D הגבוהה ביותר האפשרית. ישנן פשרות בין צמצם מספרי (na), מרחק עבודה, הגדלה, וסוג של עדשה (יבש, מים ונפט טבילה). להכנות דקות כמו תרביות רקמה, מטרות נפט הן הטובות ביותר. השימוש במיקרוסקופ זקוף, לצוף להחליק את מכסה על האמבט המימית, ולהשתמש בשמן טבילה בין החלק העליון של להחליק את המכסה והאובייקטיבי.
- אם תוכנת deconvolution משמשת, הספק עשוי לספק פונקציות שנקבעו מראש נקודת התפשטות (PSFs) למטרות מסוימות. אם אין מידע כזה מסופק, או אם מטרה שאינה נתמכת נבחרה, לקבוע את כוחות הביטחון הפלסטיניים על ידי הדמיה ממוזערת ניאון או אובייקטים עקיפה מוגבל דומים 7,8.
3. להקים את עומק הרצוי של שדה ומספר ImaGES הרצוי לכל מסגרת זמן לשגות
- בחר בעומק הכולל של שדה, כך שהעברה או אינטראקציה מבנים של עניין לא נעלמים או ללכת מחוץ לפוקוס, כאשר הם עוברים בכיוון-z. Z-השדה צריך מעט לחרוג מהממד האנכי של התא בתהליך או תא להיות הדמיה. למסופים מנוע חוליות, 15-20 מיקרומטר הוא טיפוסי.
- לחשב את צעד Z-ציר צורך שלכל תוספת של מוקד. החלטה לאורך ציר Z-משתנה בהתאם מאפיינים של המטרה; זה בערך רבע מרזולוצית מישור XY. אם אחד confocal הדמיה או תוכנת deconvolution משמשת, ברזולוציה Z-ציר משופרת. שפר את ההחלטה סופית על ידי דגימת יתר מכוונת בכיוון-z 5, אבל ראית גם צעד 3.3 להלן. מרווח צעד אופייני הוא בטווח של 400-1,500 ננומטר למטרות 40-100X. אור צריך להיות מוגף מבין כל תמונת Z-צעד.
- בחר את מספר התמונות לZ-מחסנית, כלומר העומק הרצוי של שדה מחולקעל ידי מרווח הצעד. זמן כדי להשלים את Z-מחסנית טיפוסית הוא 1-10 שניות. אובייקטים הנעים במהירות (100 ננומטר / sec) יכולים להופיע מטושטשים בערימת תמונת 3D משום שכל מטוס תמונה מתאים לנקודת זמן שונה במקצת. כמו כן, כל תמונה נוספת תורמת לphotobleaching וphototoxicity האפשרי (ראה דיון). אם אחד המצב נוגע, לבחור Z-צעד גדול יותר כדי לאסוף פחות תמונות לכל מחסנית. לפצות מאוחר יותר באמצעות תוכנת אינטרפולציה תמונה (שלב 6.3 בהמשך).
4. בחר מסגרת שיעור הזמן לשגות
בחירה לפי ניסויי שיעור, כי הוא פשוט מספיק כדי לפתור בצורה חלקה משתנה עם זמן, כגון תנועה, אינטראקציות או אירועי היתוך 9. על פי דגימה יכולה לייצר חפצי תנועה (טעויות דגימה), ואילו דגימת יתר שלא לצורך מגדילה את החשיפה לאור. לאסוף או רצף ארוך אחד או כמה רצפים חוזרים ונשנים של אותה הכנה, כל אחד עם סך מרווח קטן יחסית בזמן ( 5. להשלים את כל הדמית החיה להכנה מסוימת הכנות זוחלים בדרך כלל להישאר חזקות עבור ~ שעה 1-2, יותר אם מקוררות. 6. לנתח את הנתונים על פי שימוש רצוי
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הנתונים שמוצגים הם ממסופי התוקפת נחש (לראות תצוגות ההגדלה נמוכות וגבוהות באיור 3; צבע endocytic (FM1-43) הספיגה יוצר אובך שממלא כל אחד בוטון), ובפרט, macroendosomes (MES) וendosomes חומצי (AES) בתוך מסופים אלה 5. MES נוצרים על ידי אנדוציטוזה בתפזורת במהלך פעילות עצבית 10 ומספרם יורד באופן אקספוננציאלי עם זמן לאחר הפעילות חדלה 6. שימוש בהדמיה לחיות 4D היה לקבוע אם MES לנוע לעבר קרום הפלזמה ובמהירות נעלמת, טוען כי מספרם יורד כי חלק מהם exocytose. כל MES כגון נכחו בנקודת זמן אחת (ואלה לפני) ונעלמו לחלוטין בנקודה בפעם הבאה (ואלו שיבואו אחרי). כך את הזמן הנדרש להיעלמות היה פחות מהמרווח שלנו מסגרת (קצר ככל 30 שניות) ועולה בקנה אחד עם exocytosis. תאוריה חלופית, אינו נתמכת על ידי נתונים 4D, היא שMES להתפוגג באיטיות דרך ניצנים של vesicles עד שהם נעלמים. ניצני שלפוחית מתרחש 6, אבל לפחות חלק MES הם exocytosed או במהלך או אחרי ניצני 5. איור 1 והסרט S1 להמחיש את ההיעלמות שלי בין שתי מסגרות הזמן לשגות. MES עתיד להיעלם לא שינה צורה או בהירות על פני שתיים או יותר מסגרות (N = 16), אשר היה בקנה אחד עם פיזור איטי בתקופה של הסרט (מתחיל כמה דקות לאחר גירוי קצר) הזמן. היעלמותי הייתה שנצפתה קודם לכן בזמן לשגות קונבנציונלי, אבל זה היה אפשרי, כי המבנים שפשוט עזבו את המטוס של מוקד. יתר על כן, צפייה ממגוון רחב של נקודות מבט (סרט S1) אישרה כי היעלמותי הייתה פתאומית. עם הדמיה חיה קונבנציונלית (מסתכל מנקודת מבט אחת, לדוגמא מטוס תמונת XY) צורכי רעש להגביל את יכולתו של החוקר כדי לאשר שמבנה נותר ללא שינוי. ממצאים כאלה הם לעתים קרובות בהווהבתצוגה אחת אך לא לאחרים.
מחקרים במיקרוסקופ אלקטרונים הראו כי endosomes במסופי מנוע קטנה בגודלם, בסמוך לגבול ההשתברות של 10 אור. מכאן שילוב של endosomes אלה לא ניתן להבחין לחלוטין מעמותת מרחבי קרובה ברמת אור. MES תויגו עם FM1-43 (ירוק-fluorescing), ו-AES עם צבע lysosomal חיוני (אדום fluorescing). מבנים שזרח בשני הצבעים (מופיע צהוב) נרשמו מדי פעם ברשומות תמונת 4D. באמצעות תוכנה מתאימה, נופים של endosomes שכותרתו הכפולה ולכן התמזגו כנראה אלה ממגוון רחב של פרספקטיבה נוצרו במטרה לבחון את צירוף מקרים של שתי התוויות בvoxels קרובים ובתוך המבנה הנראית לעין. איור 2 מראה AE-ME התמזגו משוערת כפי שנצפו משלושה כיוונים מאונך. דעה אחת היא מישור XY; התצוגות האחרות הן המאונכות למישור זה וזה לזה. באמצעות שיטה זו נמצאה כי voxelsאו חפיפה, כמו בדוגמא זו, או שהם לא עשו במטוסי צפייה אחת או בצורה ברורה יותר. סרט S2 מציג את אותו משוער התמזגו AE-ME מוצג כתצוגה אינטראקטיבית וירטואלית למציאות (rotatable באופן מלא ב 3 ממדים).
deconvolution דיגיטלית היא כלי שימושי כדי לשפר את הרזולוציה של 3D, כמו גם תמונות 4D, ממיקרוסקופים קונבנציונליים וconfocal 11. Deconvolution היא תהליך מספרי, איטרטיבי שמפצה, במידה מסוימת, לרזולוציה מרחבית מוגבלת של המטרה בשימוש. החלטה זו מאופיינת כאובייקטיבית של נקודת התפשטות פונקציה-3D שנכבש על ידי דמותה של נקודה זעירה בנפח. בתאוריה, deconvolution משחזרת את התמונה שתביא אם המטרה היתה מושלמת. איור 3 היא תצוגת 3D נפח של שתי מערכות נתונים שונות, שכל אחד מוצגות כזוג anaglyphs האדום וירוק. התמונות ממש להראות שיפור טיפוסי בחדות לאחר דה הדיגיטליתפיתול של ערימת התמונה.
איור 1. Macroendosome (ME) נעלם לאחר מגע לכאורה עם קרום פלזמה. הכנת עצבים שרירים נחש הייתה מגורה חשמלי בנוכחות FM1-43. הנתונים נאספו באמצעות ההדמיה 4D כמתואר בשיטות ומוצגים כ" נופי נפח 3D "בשש נקודות זמן (60 מרווח שניות) כדי להמחיש את Z-עומק באוטון אחת. ME ניתן לצפות מתרחק מהציר Y (קו אדום מקווקו) על פני כמה מסגרות לפני שנעלם בין נקודות זמן 5 ו -6. רגע לפני ההיעלמות, ME מופיע להיות ממוקם בקרום הפלזמה של באוטון (שמסומן על ידי FM1-43 שלפוחית מכתים או "ערפל"; ראה איור אגדה 3). לי שלא יופיע שוב בנקודות זמן מאוחר יותר (מידע לא מוצג; לראות הסרט S1). סרגל קנה מידה, 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הסרט S1:. צפיות זמן לשגות 4D של ME היעלמות לחץ כאן לצפייה בסרט. אותו סט הנתונים גולמי המוצג באיור 1 מוצג כ" מבט נפח 4D "בהגדלה נמוכה. רצף הזמן לשגות המקורי כולל 8 נקודות זמן, כל אחד בנפרד על ידי 60 שניות; השמעה היא ב 4 מסגרות / sec. הרצף הוא עצר לרגע בתחילת כל אחת מ24 3D צעדי סיבוב על ציר ה-Y (15 מעלות / צעד) כדי למשוך תשומת לב ונעלם לי (חץ אדום) בקרוב-להיות ל. שים לב שME הוא גלוי, מתקרב לקצה בוטון (קרום פלזמה), נעלמת, ולא מחזיר, בכל פרספקטיבות הצפייה. בגלל הרזולוציה Z-ציר נמוך יותר בהשוואה לרזולוצית XY, את הצורה שלי נראית להאריך ולקצר בהתאם לצפיית פרספקטיבה. תמונות יוצאו כסרט QuickTime, ומבואר באמצעות QuickTime Pro. סרגל קנה מידה, 2 מיקרומטר.
איור 2. צפיות אורתוגונלית של endosome התמזגו משוער. הכנת שרירים עצב הייתה מוכתמת ברצף עם צבע lysosomal חיוני (אדום) לתייג AES וFM1-43 (ירוק) כדי לתייג MES באמצעות 0.5 M גירוי סוכרוז כמתואר בשיטות. נתונים מנקודת זמן אחת בסרט 4D מוצגים כהשקפות נפח 3D בשלוש אוריינטציות. בחלקו העליון (פנלים 1-3) היא ההשקפה המקובלת מלמעלה (מישור XY). באמצע (פנלים 4-6) היא תצוגת ניצב למישור XY ובכיוון (השרירותי) של החץ האדום הגדול. בשורה תחתונה (פנלים 7-9) היא תצוגה הדדית בניצב לשני ההשקפות לעיל, בכיוון החץ הכחול הגדול. ME (ירוק) מסומן בחץ ירוק; שני AES (אדום) מסומנים על ידי חצים אדומים. Endosome המכיל את שני הצבעים (צהוב) מסומן בחץ צהוב בלוחות 3, 6, ו -9. הערה חפיפה של אדום וירוק הוא מוחלט באותה מידה בכל שלוש התחזיות המאונכות. סרגל קנה מידה, 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
MOVIE S2:. סיבוב אינטראקטיבי של תמונה המכילה MES וendosomes חומצי AES. לחץ כאן לצפייה בסרט סט נתונים של איור 2 מוצג מוגדרת כתמונת 3D rotatable באופן מלא (ריאלי וירטואלי QuickTimeפורמט ty; להשתמש בעכבר כדי לסובב את התמונה לצפייה מכל כיוון). המשוערת התמזגו ME / AE נשאר צהוב מכל הבחינות.
איור 3. Deconvolution משפר רזולוציה מרחבית 3D. שני מסופים טיפוסיים עצב נחש, המוצגים בנמוך (למעלה) והגדלה גבוהה (בחלק תחתון) בהתאמה ומוכתמת בזמן גירוי עם FM1-43. FM1-43 "אובך", רקע בשל תיוג של שלפוחית 50 ננומטר בודד, מראה את הצורה של boutons מסוף שבמסגרתו MES מוגבלים. הנתונים מוצגים כanaglyphs אדום ירוק דעות נפח 3D (עומק יכול להיות דמיינו עם משקפיים אדום ירוק או אדום כחול; אדום בעין שמאל; האקסון הערה בחלק השמאלי עליון יורד אל המטוס של מסוף מלמעלה). פנלים משמאל: הנתונים גולמיים; לוחות מימין: נתונים לאחרdeconvolution. שים לב לשיפור המשמעותי ברזולוציה של MES. לוחות העליונים: גירוי חשמלי; כל מסוף מוצג (~ 30 x 50 מיקרומטר) (אותו מידע גולמי כמו באיור 1 והסרט S1; סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר). פנלים תחתון: גירוי KCl; מוגדל כדי להראות ארבעה boutons הבודד (~ 3 x 5 מיקרומטר; סרגל קנה מידה, 2 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההיבט הקריטי ביותר של ההדמיה 4D הוא ניהול של המשך ועוצמת חשיפה לאור. Photobleaching יורד יחס אות לרעש בתמונה ויכול להיות בעייתי או לא תלוי בגורמים שונים, לרבות בחירה של fluorophores. נזק ספציפי לרקמת חיה (phototoxicity) קשור לphotobleaching, ולעתים ניתן לזהות באמצעות בדיקות ניאון נועדו למטרה 2,12 או על ידי בדיקה של מורפולוגיה עם אופטיקה brightfield המתאימה, כגון התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC).
זה אפשרי, עם זאת, כדי לגרום להשפעה פיזיולוגית המתרחשת ברמות האור נמוכים בהרבה מסדר גודל של אלה הקשורים photobleaching וphototoxicity. לדוגמא, בניסויים מוקדמים באמצעות הכנות מרובות, כל אחד קבוע בזמן שונה לאחר גירוי, בקצב שבי MES נעלם עם זמן לאחר גירוי קצר נמדד 6. כהוא לא מקובלo למזער דהייה, הכנות נשמרו בחושך עד שהם נתפסו. כאשר ניסויים דומים בוצעו באמצעות הדמיה החיה 4D, הרבה יותר MES נשאר לאורך כל הניסוי (~ 20-60 דק ') ולא נעלם. שימוש באותו פרוטוקול הדמיה חיה, פרט לא ממש הקלטה וכך להגביל את החשיפה לאור למסגרת אחת 3D בתחילת ומסגרת אחת בסוף, החזיר את השיעור הכולל הצפוי של היעלמות endosome לזה של הכנות קבועות.
פתרון בעיות נוספות הצביעו על כך שקצב ההיעלמות היה בחלקו, ביחס הפוך ומונוטונית הקשורים לחשיפה לאור בסך הכל במהלך ניסוי. לאחר ניסיונות לא מוצלחים לצמצום חשיפה באמצעות אופטיקה confocal הקונבנציונלית וmultiphoton, הבעיה נפתרה סוף סוף על ידי רכישה של מצלמה 3x ~ רגישה יותר (טבלה 1). מומלץ כי השוואות דומות תיעשה במידת האפשר, בהתאם ליישום של המשתמש. אם חלק process או מעבר הוא להיות מתועד לאורך זמן, לוודא שאין שינוי מיוחס לעצימות או את משך זמן כולל של תאורה. Phototoxicity וphotobleaching הם צבע ספציפי. לדוגמא, אנחנו לא ראינו שום הדמיה משמעותית דהייה חזרו אחרי 4D ממסוף אחד (350 חשיפות בודדות אור על 30 דקות) באמצעות FM1-43. אותו פרוטוקול ההדמיה באמצעות צבע דומה, SGC5 (טבלה 1), לעומת זאת, הביא כמה ודהייה, יש להניח, phototoxicity כמו גם (מידע לא מוצג).
הפרט לשיפורים המסופקים על ידי deconvolution הדיגיטלית (ואופטיקה confocal אם משתמש בו; לא מוצג), השיטה הפשוטה שתוארה לא מספקת רזולוציה "סופר". עם זאת, יש לו את השיטה יש את היתרון של שיפור רזולוציה מעשית או אינטואיטיבי בעת צפייה במבני מגורים, מרגשים במיוחד אלה, שגודלם הוא באו מעט גדולה יותר לגבול ההשתברות. היכולת להציג אובייקטים מנקודתי מבט שונים, includiמצגת ng בכל אחד משלושה מטוסים מאונך, מנחה את החוקר באשר לשאלה האם מבנה אכן קיים מעל לרמת הרעש והאם הוא מתויג על ידי fluorophores אחד או יותר. לדוגמא, בניסויים שנועדו לכמת את המספר והגודל של MES ו-AES, ניתן היה לאשר כי המבנה היה נראה מנקודתי מבט שונות, וכי כל ממד (ולכן הנפח תלת ממדים שלה) היה בטווח אופייני לכך מבנה. מיקומו של מבנה מוגדר גם טוב יותר, למשל, בתוך האקסון, מסוף עצב וכו '. ולא מעל או מתחתיו. לעומת זאת, כאשר שדה הראייה היה מוגבל או למטוס תמונת 2D בודד או להקרנה של נתונים 3D, מבנים המשוערת לעתים קרובות הוכיחו את עצמו "רעש". בדומה לכך, מבנים שכותרתו כפולים משוערים לעתים קרובות הוכיחו ששני מבנים שהופיעו ביחד מנקודת מבט אחת צפייה (או שתיים), אבל לא מכל. ויזואליזציה משלושה direc מאונךtions מספק סטנדרטי ושגרתי קריטריון להערכת מאפייני קיום, גודל, וסימון של endosomes או מבנים דומים לשימוש בניתוחים כמותיים וסטטיסטיים.
המתודולוגיה שתוארה היא מעשית שבוידאו מיקרוסקופ קונבנציונלי מהסוג שנמצא במעבדות רבות ניתן להשתמש בם. המכשור הוא תכליתי ולא מיוחד, וזול יחסית. בעוד תוכנה ספציפית למיקרוסקופ מסוים שימשה כאן, תוכנת קוד פתוח עבור שתי רכישת תמונה ועיבוד נתונים יכולה להניב תוצאות דומות 13. טכניקות (כולל deconvolution) החלות על confocal הדמיה יחידה וmultiphoton עם יתרונות דומים, כל עוד חשיפה לאור הוא נסבל על ידי הכנת החיים בשימוש. בעתיד, שיפורי עיצוב ויחזקו ההדמיה לחיות 4D השירות. אלה כוללים, בעיקר, בחומרה המשפרת את המהירות של התמקדות וצ'ה מסנן עירור / פליטהnging, וזמינות של אפילו יותר רגיש מצלמות וידאו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות גרנט NS-024,572 (לRSW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| SGC5 | Biotium, Hayward, CA | 70057 | Final conc: 10 mM |
| FM1-43FX | Invitrogen, Carlsbad, CA | F35335 | Final conc: 7 mM |
| LysoTracker Red | Invitrogen, Carlsbad, CA | L7528 | Final conc: 0.2 mM |
| Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2.5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High KCl Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 86 mM | ||
| KCl | 60 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High Sucrose Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2.5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| Sucrose | 0.5 M (17.1 g/50 ml) | ||
| Axioplan 200 inverted microscope | Carl Zeiss, Thornwood, NY | www.zeiss.com | |
| N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm | Carl Zeiss, Thornwood, NY | www.zeiss.com | |
| DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher | Sutter Instruments, Novato, CA | 175W Xenon arc lamp | www.sutter.com |
| Lambda 10-2 emission filterwheel switcher | Sutter Instruments, Novato, CA | www.sutter.com | |
| Sensicam CCD camera | Cooke Instruments, Tonawanda, NY | www.cookecorp.com | |
| Cascade 512 CCD camera | Photometrics, Tucson, AZ | www.photometrics.com | |
| Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins | |||
| Software | |||
| Slidebook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO | Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation | www.intelligent-imaging.com |
| IMARIS 7.5.2 | Bitplane, South Windsor, CT | Drift correction; 3D and 4D data presentation | www.bitplane.com |
| AfterEffects CS6 | Adobe, San Jose, CA | Drift correction | www.adobe.com |
| ImageJ 1.46 | National Institutes of Health, Bethesda, MD | Multiple plugins available; Stereo pair construction | http://rsbweb.nih.gov/ij |
| Zeiss LSM | Carl Zeiss, Thornwood, NY | Stereo pair construction | www.zeiss.com |
References
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M.
- Tinevez, J. -Y., et al. A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope. Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).
- Snapp, E. L., Hegde, R. S. Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells. Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).
- Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. Late" macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals. J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).
- Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons. J. Physiol. 582, 243-262 (2007).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19, 373-385 (1999).
- Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).
- Cromey, D. W. Digital images are data: and should be treated as such. Methods Mol. Biol. Taatjes, D. J., Roth, J. 931, 1-27 (2013).
- Teng, H., Wilkinson, R. S. Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals. J. Neurosci. 20 (21), 7986-7993 (2000).
- Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals. J. Neurosci. 19 (12), 4855-4866 (1999).
- Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L. Challenges and recent advances in live cell bioimaging. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. Mendez-Vilas, A., Diaz, J. , 1495-1505 (2010).
- Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software. J. Vis. Exp. (49), (2011).
