Summary
四维（4D）成像被用于研究中两种类型的核内体的活的脊椎动物神经终端的行为和交互作用。这些小的结构的运动的特征是在三维空间中，从而允许确认如内涵体融合和胞吐作用的事件。
Abstract
四维（4D）光成像已被用于薄的横运动神经末梢内学习的小结构腹行为的袜带蛇的肌肉。原始数据包括3D Z-堆栈延时序列。每个堆栈包含在由400-1,500 nm的分离焦平面收购与萤光光学4-20图像。在采集图像栈，如调整聚焦的步骤，切换激发波长，并在数码相机的操作，是自动的，尽可能最大化图像率和最小化从光照射的组织损伤。采集后，一组图像栈的去卷积，以提高空间分辨率，转化成所需的3D格式，并用于创建4D“电影”，是适合各种基于计算机的分析，这取决于所寻求的实验数据。一个应用是两个阶级内涵体的神经末梢，macroendosomes发现（MES）的动态行为的研究和酸性核内体（AES），其大小（200-800纳米的两种类型）是在或接近衍射极限。获得在每个时间点的三维信息提供了几个优点优于常规延时成像。特别是，规模和结构的运动速度可以一次进行量化比没有的大家关注的焦点损失。从四维成像数据的例子揭示的ME接近质膜和消失，这表明它们是胞吐而不是简单的垂直移动远离焦点的单个平面上。还透露，是公认的融合的ME和AE的，如通过在三个正交投影观看两个含染料结构之间的重叠可视化。
Introduction
活体组织的时间推移成像提供可视化访问动力学结构与功能的关系，不能在成像在单个时间点固定或生活准备将不胜感激。然而，通常的折衷访问的时间信息是在光学分辨率的降低。高数值孔径的油浸目标是因为它们的窄的范围内聚焦的不切实际的活组织，留下水浸泡或干的目标是唯一的选择。此外，通过共聚焦光学系统所带来的增加的分辨率不能被使用在一些生活制剂因光毒性的相对较高水平照明的所需1,2。最后，虽然几个实时或延时的光学技术是可用的提供增强的分辨率，其适用性是有限的制剂，其中感兴趣的结构可以被定位在目标1的几百纳米。中记载的方法使得使用相对低成本的设备，具有通用性，还提供了改进的分辨率相比，更常用的时移技术。它的目的是用于个人实验室以及成像设施。
该方法利用常规落射荧光显微镜，结合一个灵敏的数字照相机和与硬件设计来快速地获得图像集在稍微不同的焦平面（Z-堆栈）。每个z-堆栈数字去卷积，以提高分辨率。三维时间推移（4D）成像的一个特点是移动的细胞器或其他结构的精确跟踪。当正确设置，成像结构不出去的焦点，并在所有三个方向的运动可以观察和量化。因而这是不可能的染色后的结构消失在一个或多个时移的帧仅通过漂流的上方或下方的窄焦平面。该方法也可作为一个敏感的工具，以评估的相互作用和可能的复锡永的小结构。常规落射荧光或接近衍射极限（几百纳米）的结构的共焦图象不确认融合即使合并的图像显示，它们各自的标签3的重叠。融合建议，但它仍然是可能的目的是通过一个距离，该距离低于衍射极限水平或垂直方向分隔开。三或四维成像，相反，允许观看在三个正交方向上的对象。融合在所有三个视图的外观增加了确定性的水平。而且，在一些生活的准备，指挥或推定融合对象的布朗运动提供了进一步的证据时，这两个标签一起移动的时间。当然，当接近衍射极限的确定性在从背景拘泥的结构，或表明它们含有两种染料（融合）的水平，也不是绝对的。如果适用的话，专门技术，如荧光共振能量转移（FRET）4，是比较合适的。
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Protocol
1，染色制备与体外活体染料
- 对于束带蛇解剖协议见Stewart 等人。5和滕等 6爬虫组织保持生理更长的时间，并且以较少的细菌污染，当在低温下保存（见下文）。哺乳动物组织通常保持在室温或更高。
- 溶酶体活体染料染色，溶解染料在寒冷的爬虫类林格氏液1:5,000（0.2微米）。孵育在4℃下持续15分钟。用冷林格多洗几次。尽快形象。
- 对于FM1-43染色用的KCl刺激，淡化色素在高氯化钾铃声1:500（7微米）。在孵育4℃30-60秒最大。用冷林格快速洗三次，约1分钟/冲洗。尽快形象。
- 为FM1-43染色用高渗（蔗糖）的刺激，淡化色素在如上述的0.5M蔗糖铃声。孵育4＆＃176，C为2-5分钟。用冷水洗涤林格如上面步骤1.3。尽快形象。
- 为FM1-43染色通过电刺激，见滕等 6简要地说，将制剂置于含有生理盐水溶液和染料烹调。神经受到刺激与200微秒矩形脉冲（〜7伏，30赫兹，18微秒）预编程的火车。用冷水洗涤林格如上面步骤1.3。尽快形象。
2配置准备成像
- 定向制备，使得感兴趣的结构尽可能接近到显微镜物镜。
- 如果倒置显微镜时，利用室，其底部包含了一个薄的圆盖滑。通常，成像室应具有一薄的不锈钢底部用25毫米直径的＃1厚度的玻璃盖玻片在中心。如果一个堂堂正正的显微镜时，不需要底盖玻片，但很有用允许成像透射光（ 如微分干涉相衬，DIC）的定向标本，并找到感兴趣的对象。
- 选择一个合适的目标，以获得尽可能高的3D解决。有折衷的数值孔径（NA），工作距离，放大，和类型的镜头中（干燥的，水和油浸渍）。对于薄筹备样组织文化，石油的目标是最好的。使用直立显微镜，漂浮在水浴盖玻片，并用盖玻片的顶部和物镜之间的浸油。
- 如果反卷积软件使用时，供应商可能对某些目标提供预定的点扩散函数（点扩展函数）。如果没有这样的信息提供，或者如果不支持的客观选择，通过荧光成像网点或类似的衍射极限的物体7,8确定的PSF。
3，建立场所需的深度和IMA数GES每定时帧期望
- 选择场的总深度，使移动或相互作用的利益结构不消失或不能聚焦，因为他们移动在z方向。在z域应该略微超过该细胞或细胞过程被成像的垂直尺寸。对于脊椎动物电机端子，15-20微米是典型的。
- 计算所需的聚焦的每个增量z轴的步骤。沿z轴的分辨率的变化取决于目标的属性;它是在xy平面上的分辨率的四分之一左右。如果任共焦成像，或解卷积软件被使用时，沿z轴的分辨率得到了改善。提高最终解决方案通过在z方向5深思熟虑过采样，可以参看下面的步骤3.3。一个典型的步进间隔，取值范围从400-1,500 nm的40-100X的目标。灯应每个z步图像之间关门了。
- 选择每个Z-堆栈的图像的数量，即场的所希望的深度除以通过该步骤的时间间隔。的时间来完成的典型的Z-堆栈是1-10秒。快速移动的物体（100纳米/秒）可以出现模糊的3D图像堆栈，因为每个图像平面对应一个稍微不同的时间点。此外，每个额外的图像有助于漂白和光毒性可能（见讨论）。如果上述任何一种情况涉及，选择较大的z步，收集每个堆叠较少的图像。利用图像插值软件（下面的步骤6.3）后补偿。
4，选择定时帧速率
选择通过实验的速度是刚刚足够的顺利解决随时间的变化，如运动，相互作用或融合事件9。根据抽样可以产生运动伪影（抽样误差），而过采样增加不必要的曝光。收集一个单长序列或来自同一制剂中，每个具有相对小的总的时间间隔（几重复序列 5，完成所有实时成像为一个特定的准备 爬虫类制剂通常保持强劲的〜1-2小时，更长，如果冷却。 6，分析数据根据所需用途
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Representative Results
所示的数据是从蛇神经肌肉端子（参见低和高放大视图在图3中，内吞染料（FM1-43）的吸收产生的雾度，填补各布顿）和，尤其是macroendosomes（MES）和酸性核内体（AES）在这些端子5。 ME的由大容量的内吞作用的神经活动10时创建的，其数量随时间呈指数下降后的活动已经停止6。利用四维实时成像是确定的ME走向质膜和迅速消失，这表明他们的号码，因为他们中的一些exocytose降低。所有这些的ME是在一个时间点出现（和之前的那些），并完全消失在下一个时间点（和那些以后）。因而需要消失的时间小于我们的帧间隔（短至30秒），与胞吐作用是一致的。另一种理论，不支持的四维数据，是的ME通过V的萌芽慢慢消散esicles，直到他们消失。囊泡出芽时6，但至少有一些的ME要么过程中或出芽后5胞吐。 图1和 Movie S1说明了我两个延时帧之间消失。注定要消失的ME并没有改变形状或亮度在两个或多个帧（N = 16），这将在电影（短暂的刺激后开始几个分钟）的时间内一直缓慢消散一致。 ME的消失是在常规的时间推移先前观察到的，但它是可能的结构只是简单地离开焦点的平面。此外，从各种角度（ 动画S1）的观察证实，ME的消失是突然。与传统的实时成像（看从单一的角度， 例如在xy平面图像）的人为干扰限制了研究者以确认结构是不变的能力。如工件往往存在在一个视图，而不是其他。
电子显微镜的研究表明，在电机端子内涵体的体积小，近光10的衍射极限。因此，这些融合的内涵体不能完全从近空间关联区别在光照水平。 ME会被标记FM1-43（绿色荧光）和AES与溶酶体活体染料（红荧光）。结构，发荧光的两种颜色（黄色显示）的4D影像纪录偶尔说。使用适当的软件，以便检查在附近和内部的表观结构体素的两个标签的重合中产生的观点从各种角度对这些双标记，并因此明显地稠合的内体， 图2示出一个假定的稠合的AE-ME从三个正交方向观看。一种观点是xy平面;其它视图是正交于该平面，并给对方。使用这种方法，发现体素无论是重叠的，因为在这个例子中，或者说，它们显然并没有在一个或多个可视平面。 电影S2中显示了相同的推定的稠合的AE-ME呈现为一个交互式虚拟现实显示器（在3维充分转动）。
数字反卷积是一种有用的工具，以提高三维的，以及分辨率4D图像，从常规和共聚焦显微镜11。解卷积是一个数值，迭代过程来补偿，在一定程度上，对于目标的限定空间分辨率使用。此解决方案的特点是客观的点扩散函数的3D由一个无穷小的点的图像所占的体积。从理论上说，去卷积恢复会导致如果目标是完美的图像， 图3是两个不同的数据集，每个显示为对红色，绿色的anaglyphs一个三维体积图。右侧图像显示的清晰度典型的改善数字去后卷积的图像栈。
图1一个macroendosome（ME）与细胞膜表面接触后消失。蛇神经肌肉制备物电在FM1-43的存在刺激。使用四维成像如方法中所述，并在6个时间点（60秒间隔）被显示为“三维体积的意见”来说明的Z深度的单个布顿的收集数据。一个ME可以观察到移离Y轴（红色虚线）在几个帧的时间点5和6之间消失之前，只要消失之前，在ME似乎是位于布顿的血浆膜（FM1-43囊泡划定染色或“阴霾”; 见图3图例）。在ME没有重新出现在稍后的时间点（数据未示出，参见电影S1）。比例尺，2微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
电影S1：ME的4D时间推移消失意见 点击这里观看电影。在图1中显示的相同的原始数据集显示为“4D容积视图”在一个较低的放大倍率。原来的时间推移序列包含8个时间点，每组由60秒分开;播放的是4帧/秒。该序列是短暂暂停在每个24 3D绕y轴（15度/步）旋转步骤的开始提请注意即将被消失ME（红色箭头）。需要注意的是ME的是可见的，接近布顿（细胞膜）的边缘，消失，并且不返回，在所有观看角度。因为较低的z轴分辨率相比，XY分辨率，在ME的造型显得延长和缩短根据观看角度。图像被导出为QuickTime影片，并使用QuickTime Pro的注释。比例尺，2微米。
图2。一个假定的核内体融合的正交视图。一个神经肌肉准备依次沾上溶酶体活体染料（红色）标记AES和FM1-43（绿色）使用0.5M的蔗糖刺激如描述的方法来标记的ME。从4D电影的一个时间点的数据都显示为三个方向的三维体积的看法。在顶部（面板1-3）是从上面（xy平面）的传统观点。在中间（板4-6）垂直于xy平面视图和在大红色箭头（任意方向）。在底部（面板7-9）是一个视图相互垂直，以上述两种观点，在大的蓝色箭头的方向。一个ME（绿色）的标志是一个绿色的箭头;两路AES（红色）的标志是红色箭头。同时含有染料（黄色）内体的特点是在面板3，6黄色箭头，和9。注意红色和绿色同样在完成所有三个正交投影重叠的。比例尺，2微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
电影S2：含有的ME和酸性内涵体的不良图像的交互式旋转 。点击这里观看电影 图2中的数据集显示配置为一个完全可旋转3D图像（QuickTime虚拟REALITY格式;用鼠标旋转图像从任何方向看）。推测的融合ME / AE仍然从各个角度黄色。
图3。反卷积增强3D空间分辨率。两种典型的蛇神经分别终端，在低（顶部）显示，高（底部）的放大倍率和刺激FM1-43染色过程中。 FM1-43的背景“阴霾”，由于个体50纳米囊泡的标签，显示终端boutons内其中的ME被限制的形状。数据显示为三维容积意见红绿的anaglyphs（深度可以用红绿或红蓝眼镜可视化;红色的左眼，注意轴突在左上角降入从上述终端的平面）。左图：原始数据;右图：数据后，反褶积。注意在ME的分辨率的显著改善。顶部面板：电刺激;示整个终端（〜30×50微米）（相同的原始数据， 如图1和电影S1;比例尺，10微米）。底板：氯化钾刺激;放大显示四个单独的boutons（〜3×5微米;比例尺，2微米）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
四维成像的最重要方面是光线照射的持续时间和强度的管理。光漂白减小图像信号与噪声的比，并且可以是有问题的或不依赖于多种因素，包括选择的荧光团。到生物体组织（光毒性）的非特异性损伤有关，光漂白，并且有时可以使用为目的而设计2,12或通过检查形态与合适的明场光学，如微分干涉对比（DIC）的荧光探针来识别。
这是可能的，但是，以诱导发生在光水平远低于与光漂白和光毒性相关联的大小的生理效应。例如，在使用多个制剂的早期实验中，每一个固定在刺激后不同的时间，在该ME的简要刺激消失后随时间的速率，测定6。由于是标准的做法吨Ø尽量减少褪色，制剂蒙在鼓里，直到他们观看。使用四维实时成像时被执行类似的实验，有更多的ME保持整个实验过程中（〜20-60分钟），并没有消失。除了使用没有实际记录，从而限制了光线照射到在开始和一个单一的3D画面在最后一帧相同的实时成像协议的，恢复的内吞体消失的预期总体率的固定制剂。
进一步的故障诊断表明消失率为部分成反比和实验期间单调相关的总的光曝光。不成功的尝试通过常规和多光子共聚焦光学系统，以减少曝光后，问题是由购买〜3倍以上感光摄像头（ 表1）终于解决了。因此建议类似的比较可以如果可能作出，这取决于用户的应用。如果若干家族process或过渡被证明随着时间的推移，确认不存在由于强度或照明的总持续时间修改。光毒性和光漂白的染料特有的。例如，我们看到一个终端的无显著褪色经过反复四维成像采用FM1-43（350个人光曝光超过30分钟）。使用类似的染料，SGC5（ 表1）相同的成像协议，然而，导致一些衰落和，据推测，光毒性，以及（数据未显示）。
除由数字解卷积提供改进（如果使用的话和共聚焦光学系统，未示出），所述的简单的方法提供了没有“超级”分辨率。然而，该方法有观察生活的结构，特别是移动的，其大小等于或大于衍射极限稍大时提高实际或直观的分辨率的优点。从不同的角度观察物体，includi的能力纳克介绍在三个正交平面，引导研究者以一个结构是否实际存在高于噪声电平，以及是否它是由一个或多个荧光团标记的。例如，在设计用于定量的ME和AE的数量和大小的实验中，这是可能的，以确认该结构是从不同的角度可见的，并且每个维度（因而其三维体积）为范围内的典型为结构。结构的位置也更加明确，例如，轴突，神经终端等内。而不是高于或低于它。相反，当视野被限制或者到一个单一的二维图像平面或三维数据的单个突起，推定的结构常常被证明是“噪声”。类似地，假定的双标记的结构常常被证明是两个结构中出现重合从一个观看角度（或2），但不能从所有。从三个正交方向的可视化蒸发散提供了一个标准和常规标准来评估胞内体或类似结构中的定量和统计学分析使用的存在，大小，和标签的特性。
所描述的方法是实用的，可用于在许多实验室中找到的那种类型的常规的视频显微镜。该仪器是通用的，而不是专门的，和相对便宜。而具体到特定的显微镜软件被用在这里，无论是图像采集和数据处理为开源软件，可以产生类似的结果13。技术（包括反褶积），也适用于单相和多光子共焦成像具有类似的优点，只要光照射由所使用的生活制剂的耐受性。在未来，设计上的改进将进一步提高实用四维实时成像。这些包括，主要是，硬件增强聚焦的速度和激发/发射过滤器茶nging，和更敏感的视频摄像机的可用性。
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Disclosures
作者宣称没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项工作是由卫生部资助NS-024572（至RSW）美国国家研究院的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| SGC5 | Biotium, Hayward, CA | 70057 | Final conc: 10 mM |
| FM1-43FX | Invitrogen, Carlsbad, CA | F35335 | Final conc: 7 mM |
| LysoTracker Red | Invitrogen, Carlsbad, CA | L7528 | Final conc: 0.2 mM |
| Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2.5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High KCl Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 86 mM | ||
| KCl | 60 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High Sucrose Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2.5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| Sucrose | 0.5 M (17.1 g/50 ml) | ||
| Axioplan 200 inverted microscope | Carl Zeiss, Thornwood, NY | www.zeiss.com | |
| N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm | Carl Zeiss, Thornwood, NY | www.zeiss.com | |
| DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher | Sutter Instruments, Novato, CA | 175W Xenon arc lamp | www.sutter.com |
| Lambda 10-2 emission filterwheel switcher | Sutter Instruments, Novato, CA | www.sutter.com | |
| Sensicam CCD camera | Cooke Instruments, Tonawanda, NY | www.cookecorp.com | |
| Cascade 512 CCD camera | Photometrics, Tucson, AZ | www.photometrics.com | |
| Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins | |||
| Software | |||
| Slidebook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO | Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation | www.intelligent-imaging.com |
| IMARIS 7.5.2 | Bitplane, South Windsor, CT | Drift correction; 3D and 4D data presentation | www.bitplane.com |
| AfterEffects CS6 | Adobe, San Jose, CA | Drift correction | www.adobe.com |
| ImageJ 1.46 | National Institutes of Health, Bethesda, MD | Multiple plugins available; Stereo pair construction | http://rsbweb.nih.gov/ij |
| Zeiss LSM | Carl Zeiss, Thornwood, NY | Stereo pair construction | www.zeiss.com |
References
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