Summary

Modellazione di Carcinoma renale metastatico spontanea (MRCC) in topi dopo nefrectomia

Published: April 29, 2014
doi:

Summary

Modelli di spontanea carcinoma renale (RCC) progressione della malattia metastatica possono essere usate per valutare i trattamenti in un ambiente clinicamente rilevante. Questo protocollo dimostra procedure diverse per l'impianto ortotopico di cellule tumorali del rene, la corretta nefrectomia, e, infine, delinea una guida necroscopico per il punteggio visiva e bioluminescente di carico metastatico e localizzazione.

Abstract

Una delle sfide chiave per una migliore sperimentazione di nuove terapie sperimentali in carcinoma a cellule renali (RCC) è lo sviluppo di modelli che ricapitolano fedelmente la progressione della malattia metastatica-precoce e tardiva fase. Modelli di tumore impianto tipici utilizzano ectopica o ortotopico impianto tumore primario, ma pochi comprendono la malattia metastatica spontanea sistemica che imita la clinica. Questo protocollo descrive i passaggi chiave per sviluppare la progressione della malattia RCC mette in scena simile ai pazienti. In primo luogo, esso utilizza un mouse linea cellulare tumorale altamente metastatico in un modello singenici visualizzare ortotopico impianto delle cellule tumorali. I metodi includono l'impianto superficiale e interna nello spazio sub-capsulare con celle combinate con Matrigel per evitare perdite e la diffusione precoce. Accanto descrive le procedure per escissione del tumore-cuscinetto rene (nefrectomia), con la critica cure pre-e post-chirurgica del mouse. Infine, si delinea i passi necessari per monitorare e valutaremicro-e macro-progressione della malattia metastatica, tra cui l'imaging bioluminescente e fornisce una guida dettagliata necroscopia visiva di segnare distribuzione malattia sistemica. L'obiettivo di questa descrizione protocollo è facilitare l'uso diffuso di clinicamente rilevanti modelli RCC metastatico a migliorare il valore predittivo di futuri test terapeutico.

Introduction

La principale causa di mortalità nei pazienti con carcinoma a cellule renali (RCC) è la malattia metastatica sistemico che si verifica in genere dopo la rimozione chirurgica di un tumore primario crescente nel rene. Tuttavia, ben pochi modelli tumorali preclinici che valutano terapeutica sperimentale nei topi includono la malattia metastatica, e ancora meno fedelmente ricapitolano le fasi cliniche della crescita localizzata, la chirurgia, e spontaneo iniziazione micro-metastasi e la progressione 1-3. Questo divario nei test è diventato sempre più importante nella valutazione di nuove terapie come a volte sorprendenti effetti anti-tumorali visto in modelli animali non sono sempre tradotti in un successo simile trattamento di pazienti 4. Tali differenze nei risultati possono derivare da efficacies differenziali di droga tra i modelli tumorali localizzate ectopiche o ortotopici primarie e in fase avanzata di malattia metastatica 5-7. Nel caso del RCC, solo pochi studi hanno impiegato istituito unprotocolli Nimal che includono la malattia ricorrente spontanea che imita i pazienti che in genere hanno avuto reni tumore interamente o parzialmente rimosse 2,3. Le ragioni di questa carenza nei test modello murino variano. In primo luogo, vi è il costo elevato degli animali e variabilità intrinseca di selezione delle cellule tumorali e potenziale metastatico. Ad esempio, linee di cellule renali umane tendono a metastatizzare raramente, e devono essere selezionati su più cicli di impianto primario orthotopic e la selezione metastatico derivare varianti che costantemente diffondono e formano lesioni lontane (vedi descrizione di come un essere umano linea di cellule di derivazione 8-10) . Al contrario, le cellule di topo in modelli immunocompetenti tendono a comportarsi in modo aggressivo, e il numero di cellule bassi devono essere iniettati con matrigel per ridurre la diffusione sistemica immediato 3. In secondo luogo, le difficoltà tecniche nello svolgimento corretto impianto, la resezione chirurgica (nefrectomia), e il monitoraggio (e quantificare) metastati spontaneala crescita c può essere difficile e più variabili critiche bisogno considerazione quando si impiegano questa tecnica (vedi la discussione per i dettagli). Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere i passi essenziali (così come potenziali insidie) di impianto ortotopico, la resezione (nefrectomia), e il monitoraggio della malattia spontanea carcinoma renale metastatico e per offrire una linea guida per standardizzata (e più diffusa) utilizzare tra i laboratori scientifici che valutano l'efficacia di terapie sperimentali.

Protocol

1. Ortotopico Rene Tumore impianto Cell Culture Prima di impianto ortotopico, crescere le cellule del mouse Renca LUC come un monostrato al 75% di confluenza. Seguendo tripsinizzazione e risospensione in 5% FBS contenente supporti, centrifugare le cellule a 1.000 rpm, 4 ° C per 5 minuti, ripetendo 3 volte per lavare in PBS. Poi sospendere nuovamente le cellule in mezzi privi di siero ad una concentrazione di 5 x 10 4 Renca LUC / 5 dei media privo di siero m…

Representative Results

La figura 1A mostra uno schema che illustra le procedure descritte in questa sintesi protocollo. Diversi fattori importanti devono essere considerati per ogni passaggio. Ad esempio, nel passo 1 mostra due metodi per sub-capsulare impianto del tumore cellule nel rene. Le cellule tumorali possono essere impiantati nello spazio sub-capsulare con un piccolo bianco-bolla confermando il posizionamento localizzata di cellule con perdite evitate grazie attenta rimozione dell'ago e tampone eccesso fuoriuscit…

Discussion

Lo scopo di questo protocollo è quello di valutare metastasi spontanea clinicamente rilevante utilizzando un modello di topo tumore singenici per descrivere le tecniche di impianto / resezione. Attualmente, la maggior parte degli studi preclinici che valutano nuove terapie sperimentali non comprendono lo studio della malattia metastatica e solo pochi ricapitola le fasi di crescita del tumore primario, la resezione chirurgica, e l'eventuale spontanea diffusione metastatica. Ad oggi, modelli murini geneticamente (GEM…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo grati al laboratorio del Dr. Robert S. Kerbel (Università di Toronto, Sunnybrook Research Institute, Toronto, Canada) per l'assistenza tecnica e la competenza nello sviluppo di questa procedura. Vorremmo anche ringraziare il Dott. Sandra Sexton e il Roswell Park Cancer Institute Dipartimento di Laboratorio risorse animali. Questo lavoro è stato sostenuto da un premio da Roswell Park Alliance Foundation (a JMLE).

Materials

DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine Corning 10-013-CV
FBS Invitrogen 10437-028
0.25% Trypsin EDTA Corning 25-053-CL
1x DPBS without Calcium & Magnesium Corning 21-031-CV
Matrigel BD Biosciences 354234 must be kept on ice
Artifical tears-lubricant opthalmic ointment Akorn Animal Health 17478-162-35
Pocket pro pet trimmer Braintree scientific CLP9931B
Alcohol swab VWR 326895
Betadine solution swab VWR 67618-152-01
MICRO DISSECTING sissors straight,blunt – 25mm blades – 4.5"  Southpointe surgical RS-5982
Iris Forceps, serrated, curved, 10cm long Kent scientific INS15915 need two of these
10µl Hamilton syringe Hamilton 7635-01
30G, 45 degree, RN needle Hamilton 7803-07
Sterile cotton tipped appicator VWR 10805-144
High temperature cautery kit Kent scientific INS500392
5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle  Ethicon J834
Reflex clip applier for 7mm clips Kent scientific INS500343
Reflex clips, 7mm, non-sterile Kent scientific INS500344
Removing forceps, 12cm lone Kent scientific INS500347
0.9% Sodium Chloride Baxter Healthcare 2B1322
Buprenorphine 0.01mg/mL
25G 5/8" needle VWR BD305122
1mL syringe w/out needle VWR BD309659
D-Luciferin Gold Bio technology LUCK-1G

References

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Cite This Article
Tracz, A., Mastri, M., Lee, C. R., Pili, R., Ebos, J. M. L. Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy. J. Vis. Exp. (86), e51485, doi:10.3791/51485 (2014).

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