Summary
자발 전이성 신장 세포 암종 (RCC) 질병 진행의 모델은 관련 임상 설정에서 치료를 평가하는 데 사용될 수있다. 이 프로토콜은 동소 신장 종양 세포 주입, 적절한 절제를위한 다른 절차를 설명하고, 마지막으로 전이성 부담 및 현지화의 시각 및 생물 발광 점수에 대한 부검 가이드를 간략하게 설명합니다.
Abstract
신장 세포 암 (RCC)에 새로운 실험 치료학의 향상 테스트의 핵심 과제 중 하나는 충실 초기와 말기 전이성 질환의 진행을 요점을 되풀이 모델의 개발이다. 일반적인 종양 이식 모델은 자궁외 또는 소성을 기본 종양 주입을 사용하지만, 몇 가지 임상을 모방 전신 자연 전이성 질환이 (가) 있습니다. 이 프로토콜은 RCC의 질병의 진행은 환자와 유사한 스테이지 개발하는 주요 단계를 설명합니다. 첫째, 동소 종양 세포 주입을 보여 동계 모델 높게 전이성 마우스 종양 세포주를 사용한다. 방법 누출 및 조기 확산을 방지하기 위해 리겔과 함께 세포와 하위 캡슐 공간으로 표면 및 내부 주입이 (가) 있습니다. 다음은 중요한 사전 및 사후 수술 마우스주의, 종양 베어링 신장 (신장 절제술)의 절단에 대한 절차를 설명합니다. 마지막으로, 그것은 모니터링 및 평가하는 데 필요한 단계를 설명마이크로뿐만 아니라 발광 생물 이미징을 포함하여 매크로 전이성 질병의 진행은, 전신 질환 분포를 점수에 대한 자세한 시각적 부검의 가이드를 제공합니다. 프로토콜이 설명의 목적은 미래의 치료 시험의 예측값을 개선하기 위해 임상 적 전이성 RCC 모델의 광범위한 사용을 용이하게하는 것이다.
Introduction
신장 세포 암 (RCC) 환자에서 사망의 주요 원인은 일반적으로 신장에서 성장하는 차 종양 제거 수술을 다음 발생 전신 전이성 질환이다. 그러나 생쥐의 실험적인 치료를 평가하는 거의 임상 종양 모델은 전이성 질환을 포함, 적은 여전히 충실하게 현지화 성장, 수술, 그리고 자연 미세 전이 개시 및 진행 1-3의 임상 단계를 요점을 되풀이하다. 테스트에서이 차이는 때때로 동물 모델에서 볼 눈에 띄는 항 종양 효과는 항상 환자 4 유사 성공적인 치료로 번역되지 않은 새로운 치료법의 평가에서 점점 중요 해지고있다. 결과에 이러한 차이는 지역화 자궁외 또는 소성을 기본 종양 모델과 말기 전이성 질환 5-7 사이의 차이 약물 효능에서 줄기 수 있습니다. RCC의 경우에는, 단지 몇 가지 연구가 확립 채용했다일반적으로 종양 베어링 신장 있었다 모방 환자가 전체 또는 부분적으로 2,3를 제거 자연 재발이 포함 nimal 프로토콜. 마우스 모델 시험이 부족에 대한 이유는 다양합니다. 첫째, 높은 동물의 비용과 종양 세포의 선택 및 전이성 잠재력을 내재 변동성이있다. (예 : 인간 세포주 유도 8-10의 설명 참조) 예를 들어, 사람의 신장 세포주 거의 전이되지 경향이 있고, 소성을 기본 착상 일관 보급 먼 병변을 형성 변이체를 유도 전이성 선택의 여러 라운드를 통해 선택해야 . 반대로, 면역 모델에서 마우스 세포 공격적 행동 경향이 있고, 저 세포 수는 즉각적인 조직 확산 3을 줄이기 매트 리겔로 주입되어야한다. 둘째, 기술 적절한 주입, 수술 적 절제 (절제)을 수행하고, 추적의 어려움 (및 정량화) 자연 metastatiC의 성장은 도전 일 수있다 (자세한 내용은 설명을 참조)이 기술을 사용하면 몇 가지 중요한 변수는 고려가 필요합니다. 이 프로토콜의 목적은 소성을 주입, 절제 (절제), 그리고 자연 전이성 신 세포 암 질환의 감시의 필수 단계 (뿐만 아니라 잠재적 인 함정)를 설명하는 표준화 된 (그리고 널리 보급)에 대한 가이드 라인을 제공하기 위해 과학 실험실 사이에 사용합니다 그 실험적인 치료의 효능을 평가합니다.
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Protocol
1. 동소 신장 종양 이식
- 세포 배양
- 이전 동소 이식에 75 %의 포화 상태에 단층으로 마우스 RENCA LUC 세포를 성장.
- 5 % FBS 함유 미디어, 1,000 rpm에서 원심 분리기 세포, 5 분 동안 4 ° C, PBS에 세척을 3 회 반복의 트립신 처리 및 재 부유 다음과 같습니다. 그런 다음 5 × 4 RENCA LUC / 5 μL의 혈청이없는 미디어의 농도로 혈청이없는 배지에서 세포를 재현 탁.
참고 : 변형 또는 사용되는 세포주에 따라 세포가 주입 후 매우 공격적인 마우스 세포의 성장과 보급을 느리게하는 리겔 혈청 무료 매체의 1:1 비율로 재현 탁 할 수있다.
- 수술과 세포 이식
참고 : 모든 동물 연구 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) P에 따라 수행 된 실험 엔드 포인트의 유지 보수 및 결정을 포함하여 여기서 설명rotocol 로스웰 파크 암 연구소의 승인을.- 아이소 플루 란 (2-3 %)을 사용하여 하나의 Balb / C 마우스를 마취. 발을 조이고 충분한 마취를 보장하기 위해 반사를 확인합니다. 건조를 막기 위해 눈에 수의사 연고를 적용합니다. 오른쪽 측면 드러 누움에 마우스를 놓고 앞과 뒷다리 사지 사이에 왼쪽을 면도. 무균 적으로 절개에 대한 영역을 준비하는 등의 요추 영역에 따라 알코올과 요오드를 적용합니다.
- 마지막 리브 및 고관절과 길이 방향으로 1cm의 피부 절개를 시작하는 외과 용 가위를 사용한다. 무딘 해부 가위를 사용하여 피부 아래의 결합 조직을 풉니 다. 복벽에서 길이 방향으로 0.5 cm 절개를 만들기 위해 수술 가위를 사용한다. 살짝 열려있는 상처 주위에 아래로 밀어 곡선 집게를 사용 -이 신장을 외면 화하다 전에 주입 기관의 부드러운 고정화 수 있습니다.
- 제조 된 세포 혼합물 μL 5와 해밀턴 주사기를 넣습니다. 서브 캡슐 IMPLAN에 대한테이션은,이 주입 방법이 사용될 수있다 :
- 표면 : 경 사진 가장자리쪽으로 신장 캡슐 아래의 길이 방향으로 지향 신장, 삽입 바늘 (그러나 실질 위) 병렬 실행. 바늘이 제자리에 있으면, 작은 흰색 거품이 형성 될 때까지의 모든 셀을 주입. 천천히 캡슐에서 바늘을 제거하고 즉시 유출을 흡수하고 세포의 확산을 방지하기 위해 멸균 면봉으로 주입에 얼룩.
- 내부 : 바늘이 눈에 보이는 (하지만 천공하지) 때까지 경 사진 가장자리까지 최종 주입 사이트에 신장 반대의 측면에서 시작으로, 신장의 내부를 서브 캡슐 공간 바늘을 삽입합니다. 흰색 거품 형태 및 면봉 주사 부위가 새는 것을 방지 할 때까지의 모든 셀을 주입.
- 부드럽게 체강에 신장을 반환합니다. 흡수 5-0 Vicryl 봉합사를 사용하여 복부 신체의 벽을 닫습니다. 완료되면, 함께 피부 층을 끌어 승 2 ~ 3 배치클립을 ound. 확인 클립은 확고하고 균등하게 더 상처의 노출을 지키기 위하여 이격되어있다. 이전 복구에 0.9 %의 NaCl 500 ㎕를 피하 25 G 바늘을 사용하여 프레 놀핀 (0.01 ㎎ / ㎖)의 100 μl를 관리 할 수 있습니다. 정기적으로 클립의 위치와 안정성을 모니터링하고, 10 일 이후 제거합니다.
2. 신장 절제술 / 차 종양 제거
- 섹션 (위) 1.2.1과 1.2.2에서 설명한대로 마우스 마취, 고정, 절개, 신장의 노출에 대한 동일한 프로토콜을 따르십시오.
- 부드럽게 꼬리 끝에서 연결하는 지방 조직과 신장의 두개골 끝에서 부신을 제거하여 신장을 분리 포셉의 두 번째 쌍을 사용합니다. 부드럽게 신장을 잡을 경우, 요관 주위에 두 배 매듭, 신장 동맥 및 정맥을 만들기 위해 흡수 5-0 Vicryl 봉합사를 사용합니다. 천천히 안전하고 신장을 제거하는 매듭 위에 잘라. 바로 혈액 손실, 또는이의 흔적이 부족 보류의 위험이있는 경우요관, 동맥 및 정맥에 봉합하고 매듭 위에 잘라 대신 가위를 cauterizer를 사용합니다.
- 신장이 제거되면, 연결 동맥에서 출혈에 대해주의 깊게 확인하고 필요한 경우 cauterizer를 사용합니다. 5-0 Vicryl을 사용하여 복부 신체의 벽을 닫습니다. 함께 피부 층을 당겨 1.2.4에 설명 된대로 같은주의 사항을 다음 2-3 상처 클립을 배치합니다. 밀접하게 출혈 고통의 흔적, 또는 제한된 이동성을위한 수술 후 매일 동물을 모니터링 할 수 있습니다. 안전하게 동물에 대한 제도적 지침을 따르십시오.
3. 엔드 포인트에서의 전이성 진행 상황 및 지역화를 모니터링
- 전이성 질병 정량화 : 바이오 루미 네 센트 모니터링
- 이전 루시퍼 라제 형질 세포를 사용하여 전이를 모니터링하고 Xenogen IVIS 이미징 시스템 (11, 12)를 사용하여 정량을 위해 정돈에 기재된 방법을 참조.
- 전이성 분포의 비교 평가를위한 시각적 부검 가이드기
- 등의 증세, 호흡 곤란, 체중 감소, 등의 엔드 포인트를 사용하여 기관의 지침에 따라 동물을 희생
참고 : 자연 전이성 진행이 매우 다양하고 신속한 될 수있는 동물의 근접 모니터링이 중요합니다. - 낮은 하악골에 흉강을 계속 요도 위의 절개를 시작하기 위해 외과 용 가위를 사용합니다. 복부 벽의 근육으로부터 피부를 분리하는 무딘 종단 가위를 사용합니다.
- 팔과 다리를 따라 절개를 시작합니다. 껍질 피부 떨어져. 밀접하게 피부 근막과 결절 복부 벽을 검토 한 후 표면 림프절 : 사타구니, 상완, 겨드랑이와 피상적 인 자궁.
- 복벽에 절개를하여 격막까지 왼쪽과 오른쪽 측면을 따라 잘라. 하나의 수평 잘라 내장을 베어 복부 벽의 앞 부분을 제거합니다.
- 내장 f를 그대로 모양을 검사또는 크게 주목할만한 종양. 또한 위장의 내용을 참고; 비어있는 경우, 마우스를 먹을 수있게되지 않았을 수 있습니다. 내용이 어두우면,이 상부 / 하부 위장관 출혈의 증거를 나타낼 수 있습니다.
- 시각적으로 각 마우스 그룹의 총 점수를 할당, 종양의 존재 여부에 대한 각 기관의 점수 (그룹 당 4 동물 그림 1D-I에서 예제로 사용).
주 1) : 림프절의 확대는 반드시이 종양의 성장을 의미하지는 않는다; 그것은 크게 크기의 아주 확고 흰 색 경우, 그것은 가능성이 전이성 결절이다. 2) 복부에 과도한 우유 또는 흐린 액체가 복수를 나타냅니다. 복수는 특히 간장과 위장의 엽 (叶) 사이의 복부 장기에 고체 축적을 포함 할 수있다. 3) 같은 폐 등의 장기를 들어, 여러 결절 (예를 들어 13 참조) 현재와 개별 동물 사이의 비교에 대해 계산 될 수 있습니다. - 신중하게 물총 병에서 제거하고 PBS로 세척하여 간, 비장, 신장, 췌장 : 개별 복부 장기의 심한 종양 또는 이상을 확인합니다.
- 복부 장기를 제거한 후, 요추, 천골, 신장, 및 장간막 림프절 등 복부 림프절을 검사한다.
- 전이성 확산의 증거를 다이어프램을 평가합니다.
참고 : 다이어프램에 광범위한 확산이 고심한 흔적 또는 호흡의 손실로 이어지는, 그것의 수축력을 잃게 될 수 있습니다. - 다이아 프램을 제거하고 폐와 심장을 노출하는 전두엽 부분을 제거, 흉강 두 측면 절개를합니다.
- 부드럽게 잡고 들어 올려 식도와 심장 위의 기관을 절단하여 폐와 심장을 제거합니다. 결절에 대한 조직을 평가합니다. 마음을 꽉 잡고. 탄력 일관성의 부족은 종양의 존재를 나타낼 수 있습니다.
- 두개골을 통해 선형으로 절단하는 수술 가위를 사용합니다. 부드럽게 t까지 두개의 작은 조각을 제거그는 뇌 전체가 노출됩니다. 눈에 보이는 결절 또는 이상 색소 침착에 대한 뇌 전반에 걸쳐 봐.
- 등의 증세, 호흡 곤란, 체중 감소, 등의 엔드 포인트를 사용하여 기관의 지침에 따라 동물을 희생
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Representative Results
그림 1A는이 프로토콜의 개요에 설명 된 절차를 요약 한 회로도를 보여줍니다. 몇 가지 중요한 요인은 각 단계에 대한 고려되어야한다. 예를 들어, 단계 1에서 그 신장에 서브 캡슐 종양 세포 이식을위한 두 가지 방법을 도시한다. 종양 세포는 바늘의주의 제거와 보라고 초과 탈출 유체 (그림 1B-I)에 의해 방지 누설 세포의 지역화 된 위치를 확인하는 작은 흰색 거품과 서브 캡슐 공간에 이식 할 수 있습니다. 누출을 방지하기 위해, 셀은 서브 캡슐 형상의 공간 (도 1b-II)에 도달하기 위해 내부적으로 제 주입 및 혈류로 종양 세포의 초기 분포를 방지하기 위해 매트 리겔과 결합 될 수있다. 신장의 외과 적 제거를 위해, 정확한 타이밍은 사용되는 세포주의 성장 및 전이 잠재력에 달려있다. 최적의 신장 절제술의 방법은 마우스의 고통과 회복을 최소화하기 위해 빠르고,하지만 제어, 수술을 포함한다. 티요관, 신장 동맥과 정맥을 닫습니다 Vicryl의 광명과 보안 매듭 (그림 1C 참조) 출혈 방지하는 데 매우 중요한 역할을합니다. 소작을 사용해야하지만, 과잉 출혈의 가능성이 개입을 필요로하는 경우에만. 마지막으로, 비 침습적 생물 발광 평가에 의한 자발적인 질병의 추적은 계속 신비로운 병변과 성장의 모니터링뿐만 아니라, 엔드 포인트에서 정량화 (그림 1D 참조) 할 수 있습니다. 그러나, 자발적인 전이 모델에서 루시 페라 표지 세포의 사용은 때때로 형질 전환 유전자를 발현하지 않을 수 있으며 따라서 항상 선택 또는 장기 종양 성장의 여러 라운드 후 표시되지 않을 수 있습니다 변종의 클론 종양 세포의 선택으로 이어질 수 있습니다. 이 경우, 임상 적으로 관련된 조직 학적 분석이 가능하지 않을 경우, 기술적 (재정의) 마이크로 전이성 병변을 식별하기 위해 수행되거나 될 수 있으며, 시각적 매크로 전이성 질환을 평가하는 시각적 채점 방법 prese의 피상적 수단으로 사용될 수있다장기 조직에 병변의 후부 / 부재 (그림 1D-i 및 1D-II).
등의 하위 캡슐 이식 수술 후 전이성 질환의 주입 (1 단계를 포함하여 수술 절차의 그림 1. A) 도식), 수술 적 절제 / 신장 절제술 (2 단계), 평가 (3 단계). B) 예 (I) 수술 절제 절차 (I)와 이식 종양 수술 후 자연 전이성 질환하여 난의 (II). D) 평가) 평가하는 시각 채점 시스템과 절제 신장의 대표 이미지의 표면 및 (II) 내부 기술. C) 예 질병 분포 (대표 4 동물의 5 개 그룹의 결과), 및 II) 발광 생물 즉시 데이터를 이전과 이후 희생 숨어하기antitatively 마이크로 및 매크로 전이성 병변을 평가하면. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜의 목적은 주입 / 절제 기술을 설명하기 위해 동계 종양 마우스 모델을 이용하여 임상 관련 자발적 전이성 질환을 평가하는 것이다. 현재, 새로운 실험적인 치료를 평가하는 전임상 연구의 대부분은 전이성 질환의 연구에 포함되지 않습니다 만 몇 가지 기본 종양의 성장, 수술 적 절제, 그리고 궁극적으로 자연 전이성 확산의 단계를 요점을 되풀이하다. 지금까지 유전자 조작 마우스 모델 (GEMMs가) 자발적 신장 세포 질병의 진행 (요약은 14 참조) 말기 전이와 수술 적 치료 전략을 포함하지 않는다을 유도하기 위해 생성 지금까지보고되지 않았다. 따라서, 자연 전이성 신 세포 암의 연구는 현재 동소 종양 세포 주입의 모델로 제한됩니다. 이 모델은 이전에 2,3를 개발되었습니다 만,이 프로토콜은 널리 특히에, 새로운 치료법의 평가에 사용되지그것이 가장 예측이있을 수 있습니다 수술 전후의 설정. 이 프로토콜은 세부 사항에 치료 평가에 더 광범위한 사용을 용이하게 할 수있다 필요한 절차를 단계별로 가이드를 목표로하고있다. 설명 된 기술을 수행하는 잠재적 인 함정의 측면에서, 결과에 영향을 미칠 수있는 몇 가지 중요한 고려 사항이 있습니다. 첫째, 주입 다음과 같은 종양 세포의 누출은 복막 질병의 확산으로 이어질 수 있으므로 초기 지역화 차 성장을 대표하지. 둘째, 최적의 절제 시간은 사용 된 각각의 세포주에 대해 설정해야합니다. 너무 일찍 종양 베어링 신장의 외과 적 절제가 너무 늦게 수술을하고, 지역화되지 않은 질병 (일반적으로 비장) 오르간 정착으로 이어질 수 있습니다 질병의 확산 (즉,이 치료 될 수있다), 그리고 수술을 할 수없는 경우가 있기 때문에 중요하다 그리고 가능하지 초기 마우스 복구 할 수 있습니다. 마지막으로, 생물 발광과 자연 전이성 질환을 모니터링의와 동시에해야합니다질병으로 동물의 사망률의 제도적 지침 모니터링 표지판 trict 준수는 현지화 및 전반적인 영향 모두의 측면에서 매우 다양 할 수있다. 동물 실험의 적절한 통계 전력을 공급 포함 할 모든 변화를 허용하고 더 충실 임상 질병의 진행 및 치료 반응을 요점을 되풀이합니다. 우리가 증명 기법을 성공적으로 임상 종양 모델에서 임상 적 관련성을 향상을 목표로 현지화 된 소성을 RCC 및 수술 후 재발을 요점을 되풀이하는 데 사용한이 문서에서 함께 촬영
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는이 절차의 개발에 기술적 인 도움과 전문 지식에 대한 박사 로버트 S. Kerbel (토론토 대학, 서니 브룩 연구소, 토론토, 캐나다)의 실험실에 감사하고 있습니다. 우리는 또한 박사 산드라 교회의 머슴과 실험 동물 자원의 로스웰 파크 암 연구소 부서에 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 (JMLE에) 로즈웰 파크 얼라이언스 재단의 수상에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Invitrogen | 10437-028 | |
| 0.25% Trypsin EDTA | Corning | 25-053-CL | |
| 1x DPBS without Calcium & Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | must be kept on ice |
| Artifical tears-lubricant opthalmic ointment | Akorn Animal Health | 17478-162-35 | |
| Pocket pro pet trimmer | Braintree scientific | CLP9931B | |
| Alcohol swab | VWR | 326895 | |
| Betadine solution swab | VWR | 67618-152-01 | |
| MICRO DISSECTING sissors straight,blunt - 25 mm blades - 4.5" | Southpointe surgical | RS-5982 | |
| Iris Forceps, serrated, curved, 10 cm long | Kent scientific | INS15915 | need two of these |
| 10 µl Hamilton syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 30 G, 45 degree, RN needle | Hamilton | 7803-07 | |
| Sterile cotton tipped appicator | VWR | 10805-144 | |
| High temperature cautery kit | Kent scientific | INS500392 | |
| 5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle | Ethicon | J834 | |
| Reflex clip applier for 7 mm clips | Kent scientific | INS500343 | |
| Reflex clips, 7 mm, non-sterile | Kent scientific | INS500344 | |
| Removing forceps, 12 cm long | Kent scientific | INS500347 | |
| 0.9% Sodium Chloride | Baxter Healthcare | 2B1322 | |
| Buprenorphine 0.01 mg/ml | |||
| 25 G 5/8" needle | VWR | BD305122 | |
| 1 ml syringe w/out needle | VWR | BD309659 | |
| D-Luciferin | Gold Bio technology | LUCK-1G |
References
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