Summary

Modellering Spontan metastatisk nyrecellekarsinom (MRCC) hos mus etter Nephrectomy

Published: April 29, 2014
doi:

Summary

Alle modeller av spontan metastatisk nyrecellekarsinom (RCC) sykdomsprogresjon kan brukes for å vurdere behandlinger i en klinisk relevant setting. Denne protokollen demonstrerer ulike prosedyrer for orthotopic nyre svulst celle implantasjon, riktig nefrektomi, og til slutt skisserer en obduksjon guide for visuell og bioluminescent scoring av metastatisk belastning og lokalisering.

Abstract

En av de viktigste utfordringene for økt testing av nye eksperimentelle behandlingsformer i nyrecellekreft (RCC) er utvikling av modeller som trofast rekapitulere tidlig og sent stadium metastatisk sykdom progresjon. Typiske tumorimplantasjonen modellene benytter ektopisk eller orthotopic primærtumor implantasjon, men få er systemisk spontan metastatisk sykdom som etterligner klinisk setting. Denne protokollen beskriver viktige skritt for å utvikle RCC sykdomsprogresjon iscenesetter lik pasienter. Først, bruker den en svært metastatisk mus tumor cellelinje i en syngene modell for å vise orthotopic svulst celle implantasjon. Metoder er overfladiske og indre implantering inn i sub-capsular plass med celler kombinert med matrigel for å unngå lekkasje og tidlig spredning. Neste det beskriver prosedyrene for eksisjon av tumor bærende nyre (nefrektomi), med kritisk pre-og postoperativ mus omsorg. Til slutt, skisserer den nødvendige skritt for å overvåke og vurderemikro-og makrometastatisk sykdom progresjon, inkludert bioluminescent bildebehandling i tillegg gir en detaljert visuell obduksjon guide å score systemisk sykdom distribusjon. Målet med denne protokollen beskrivelse er å legge til rette for utstrakt bruk av klinisk relevante metastatisk RCC modeller for å forbedre den prediktive verdien av fremtidig terapeutisk testing.

Introduction

Den viktigste årsaken til dødelighet hos pasienter med nyrecellekreft (RCC) er systemisk metastatisk sykdom som vanligvis oppstår etter kirurgisk fjerning av en primær tumor vokser i nyrene. Men svært få prekliniske tumormodeller evaluere eksperimentelle behandlingsformer i mus inkluderer metastatisk sykdom, og enda færre trofast rekapitulere de kliniske stadier av lokaliserte vekst, kirurgi, og spontan mikrometastatisk initiering og progresjon 1-3. Dette gapet i testing har blitt stadig viktigere i vurderingen av nye behandlingsformer som noen ganger slående anti-tumor effekter sett i dyremodeller har ikke alltid oversatt til tilsvarende vellykket behandling av pasienter fire. Slike forskjeller i resultater kan stamme fra differensial narkotika efficacies mellom lokaliserte ektopisk eller ortotopiske primærtumormodeller og sent stadium metastatisk sykdom 5-7. I tilfellet med RCC, har bare noen få studier anvendes etablertNimal protokoller som inkluderer spontan tilbakevendende sykdom som etterligner pasienter som vanligvis har hatt svulst bærende nyrer helt eller delvis fjernet 2,3. Årsakene til denne mangelen i musemodell testing varierer. Først, det er den høye dyret kostnader og iboende variabilitet av tumor celleutvalget og metastatisk potensial. For eksempel, menneskelige nyrecellelinjer har en tendens til å sjelden metastaserer, og må velges over flere runder med orthotopic primære implantasjon og metastatisk utvalg å utlede varianter som konsekvent spre og danne fjerne lesjonene (se beskrivelse av en slik human cellelinje avledning 8-10) . Motsatt, mus celler i immunkompetente modeller har en tendens til å oppføre seg aggressivt, og lave celle tall må injiseres med matrigel å redusere umiddelbar systemisk spredning tre. For det andre tekniske problemer i å utføre forsvarlig implantasjon, kirurgisk reseksjon (nefrektomi), og sporing (og kvantifisering) spontan metastatic vekst kan være utfordrende og flere kritiske variabler må vurderes ved ansettelse av denne teknikken (se diskusjon for detaljer). Hensikten med denne protokollen er å beskrive de grunnleggende trinnene (så vel som potensielle fallgruver) av orthotopic implantasjon, reseksjon (nefrektomi), og overvåking av spontan metastatisk RCC sykdom og å tilby en retningslinje for standardisert (og mer utbredt) bruker blant vitenskapelige laboratorier som vurderer effekten av eksperimentelle behandlingsformer.

Protocol

En. Orthotopic Nyre tumorimplantasjonen Cell Culture Før orthotopic implantasjon, vokse mus Renca LUC celler som en monolayer til 75% konfluens. Etter trypsinering og resuspensjon i 5% FBS inneholdende media, sentrifuger cellene ved 1000 rpm, 4 ° C i 5 min, gjentatt tre ganger for å vaske i PBS. Deretter resuspender cellene i serum-fritt media til en konsentrasjon på 5 x 10 4 Renca LUC / 5 mL serumfritt medium. Merk: Avhengig av variant eller …

Representative Results

Figur 1a viser en skjematisk skisserte prosedyrene som er beskrevet i denne protokollen sammendraget. Flere viktige faktorer må vurderes for hvert trinn. For eksempel, i trinn 1 viser det to metoder for sub-kapsulært tumorcelle implantasjon inn i nyrene. Tumor-celler kan bli implantert inn i sub-capsular plass med en liten hvit-boble som bekrefter den lokaliserte plasseringen av celler med lekkasje hindres ved forsiktig fjerning av nålen og swabbing skytende væskeutslipp (figur 1B-i).</stron…

Discussion

Hensikten med denne protokoll er å vurdere klinisk relevant spontan metastatisk sykdom ved hjelp av en syngen tumor mus modell for å beskrive implantasjon / reseksjon teknikker. Foreløpig gjør de fleste av prekliniske studier som evaluerte nye eksperimentelle behandlingsformer ikke inkluderer studier av metastatisk sykdom og bare få rekapitulere stadier av primær tumorvekst, kirurgisk reseksjon, og eventuell spontan metastatisk spredning. Til dags dato, genmanipulerte mus modeller (GEMMs) genereres å lokke fram s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi er takknemlige til laboratoriet av Dr. Robert S. Kerbel (University of Toronto, Sunnybrook Research Institute, Toronto, Canada) for teknisk hjelp og ekspertise i utviklingen av denne prosedyren. Vi vil også gjerne takke Dr. Sandra Sexton og Roswell Park Cancer Institute Institutt for Forsøksdyr Resources. Dette arbeidet ble støttet av en pris fra Roswell Park Alliance Foundation (til JMLE).

Materials

DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine Corning 10-013-CV
FBS Invitrogen 10437-028
0.25% Trypsin EDTA Corning 25-053-CL
1x DPBS without Calcium & Magnesium Corning 21-031-CV
Matrigel BD Biosciences 354234 must be kept on ice
Artifical tears-lubricant opthalmic ointment Akorn Animal Health 17478-162-35
Pocket pro pet trimmer Braintree scientific CLP9931B
Alcohol swab VWR 326895
Betadine solution swab VWR 67618-152-01
MICRO DISSECTING sissors straight,blunt – 25mm blades – 4.5"  Southpointe surgical RS-5982
Iris Forceps, serrated, curved, 10cm long Kent scientific INS15915 need two of these
10µl Hamilton syringe Hamilton 7635-01
30G, 45 degree, RN needle Hamilton 7803-07
Sterile cotton tipped appicator VWR 10805-144
High temperature cautery kit Kent scientific INS500392
5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle  Ethicon J834
Reflex clip applier for 7mm clips Kent scientific INS500343
Reflex clips, 7mm, non-sterile Kent scientific INS500344
Removing forceps, 12cm lone Kent scientific INS500347
0.9% Sodium Chloride Baxter Healthcare 2B1322
Buprenorphine 0.01mg/mL
25G 5/8" needle VWR BD305122
1mL syringe w/out needle VWR BD309659
D-Luciferin Gold Bio technology LUCK-1G

References

  1. Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).
  2. Souza, B. M., Chaves, K. B., Chammas, R., Schor, N., Bellini, M. H. Endostatin neoadjuvant gene therapy extends survival in an orthotopic metastatic mouse model of renal cell carcinoma. Biomed. Pharmacother. 66, 237-241 (2012).
  3. Amagai, Y., et al. Combination therapy of interleukin-2 and sorafenib improves survival benefits and prevents spontaneous pulmonary metastasis in murine renal cell carcinoma models. Jpn. J. Clin. Oncol. 40, 503-507 (2010).
  4. Steeg, P. S., et al. Preclinical Drug Development Must Consider the Impact on Metastasis. Clin. Cancer Res. 15, 4529-4530 (2009).
  5. Guerin, E., Man, S., Xu, P. A model of postsurgical advanced metastatic breast cancer more accurately replicates the clinical efficacy of antiangiogenic drugs. Cancer Res. 73, 2743-2748 (2013).
  6. Day, C. P., Carter, J., Bonomi, C., Hollingshead, M., Merlino, G. Preclinical therapeutic response of residual metastatic disease is distinct from its primary tumor of origin. Int. J. Cancer. 130, 190-199 (2012).
  7. Ebos, J. M., Kerbel, R. S. Antiangiogenic therapy: impact on invasion, disease progression, and metastasis. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 210-221 (2011).
  8. Naito, S., Walker, S. M., Fidler, I. J. In vivo selection of human renal cell carcinoma cells with high metastatic potential in nude mice. Clin. Exp. Metastasis. 7, 381-389 (1989).
  9. Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation in essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice. Cancer Metastasis Rev. 9, 145-165 (1990).
  10. Saiki, I., et al. Characterization of the invasive and metastatic phenotype in human renal cell carcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 9, 551-566 (1991).
  11. Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J. Vis. Exp. 42 (1942), (2010).
  12. Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses. J. Vis. Exp. (45), (2010).
  13. Ebos, J. M., et al. Accelerated metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis. Cancer Cell. 15, 232-239 (2009).
  14. Yang, O. C., Maxwell, P. H., Pollard, P. J. Renal cell carcinoma: translational aspects of metabolism and therapeutic consequences. Kidney Int. 84 (4), 667-681 (2013).

Play Video

Cite This Article
Tracz, A., Mastri, M., Lee, C. R., Pili, R., Ebos, J. M. L. Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy. J. Vis. Exp. (86), e51485, doi:10.3791/51485 (2014).

View Video