Modellering Spontan metastatisk nyrecellekarsinom (MRCC) hos mus etter Nephrectomy

Summary

Alle modeller av spontan metastatisk nyrecellekarsinom (RCC) sykdomsprogresjon kan brukes for å vurdere behandlinger i en klinisk relevant setting. Denne protokollen demonstrerer ulike prosedyrer for orthotopic nyre svulst celle implantasjon, riktig nefrektomi, og til slutt skisserer en obduksjon guide for visuell og bioluminescent scoring av metastatisk belastning og lokalisering.

Abstract

En av de viktigste utfordringene for økt testing av nye eksperimentelle behandlingsformer i nyrecellekreft (RCC) er utvikling av modeller som trofast rekapitulere tidlig og sent stadium metastatisk sykdom progresjon. Typiske tumorimplantasjonen modellene benytter ektopisk eller orthotopic primærtumor implantasjon, men få er systemisk spontan metastatisk sykdom som etterligner klinisk setting. Denne protokollen beskriver viktige skritt for å utvikle RCC sykdomsprogresjon iscenesetter lik pasienter. Først, bruker den en svært metastatisk mus tumor cellelinje i en syngene modell for å vise orthotopic svulst celle implantasjon. Metoder er overfladiske og indre implantering inn i sub-capsular plass med celler kombinert med matrigel for å unngå lekkasje og tidlig spredning. Neste det beskriver prosedyrene for eksisjon av tumor bærende nyre (nefrektomi), med kritisk pre-og postoperativ mus omsorg. Til slutt, skisserer den nødvendige skritt for å overvåke og vurderemikro-og makrometastatisk sykdom progresjon, inkludert bioluminescent bildebehandling i tillegg gir en detaljert visuell obduksjon guide å score systemisk sykdom distribusjon. Målet med denne protokollen beskrivelse er å legge til rette for utstrakt bruk av klinisk relevante metastatisk RCC modeller for å forbedre den prediktive verdien av fremtidig terapeutisk testing.

Introduction

Den viktigste årsaken til dødelighet hos pasienter med nyrecellekreft (RCC) er systemisk metastatisk sykdom som vanligvis oppstår etter kirurgisk fjerning av en primær tumor vokser i nyrene. Men svært få prekliniske tumormodeller evaluere eksperimentelle behandlingsformer i mus inkluderer metastatisk sykdom, og enda færre trofast rekapitulere de kliniske stadier av lokaliserte vekst, kirurgi, og spontan mikrometastatisk initiering og progresjon ^1-3. Dette gapet i testing har blitt stadig viktigere i vurderingen av nye behandlingsformer som noen ganger slående anti-tumor effekter sett i dyremodeller har ikke alltid oversatt til tilsvarende vellykket behandling av pasienter ^fire. Slike forskjeller i resultater kan stamme fra differensial narkotika efficacies mellom lokaliserte ektopisk eller ortotopiske primærtumormodeller og sent stadium metastatisk sykdom ^5-7. I tilfellet med RCC, har bare noen få studier anvendes etablertNimal protokoller som inkluderer spontan tilbakevendende sykdom som etterligner pasienter som vanligvis har hatt svulst bærende nyrer helt eller delvis fjernet ^2,3. Årsakene til denne mangelen i musemodell testing varierer. Først, det er den høye dyret kostnader og iboende variabilitet av tumor celleutvalget og metastatisk potensial. For eksempel, menneskelige nyrecellelinjer har en tendens til å sjelden metastaserer, og må velges over flere runder med orthotopic primære implantasjon og metastatisk utvalg å utlede varianter som konsekvent spre og danne fjerne lesjonene (se beskrivelse av en slik human cellelinje avledning ^8-10) . Motsatt, mus celler i immunkompetente modeller har en tendens til å oppføre seg aggressivt, og lave celle tall må injiseres med matrigel å redusere umiddelbar systemisk spredning ^tre. For det andre tekniske problemer i å utføre forsvarlig implantasjon, kirurgisk reseksjon (nefrektomi), og sporing (og kvantifisering) spontan metastatic vekst kan være utfordrende og flere kritiske variabler må vurderes ved ansettelse av denne teknikken (se diskusjon for detaljer). Hensikten med denne protokollen er å beskrive de grunnleggende trinnene (så vel som potensielle fallgruver) av orthotopic implantasjon, reseksjon (nefrektomi), og overvåking av spontan metastatisk RCC sykdom og å tilby en retningslinje for standardisert (og mer utbredt) bruker blant vitenskapelige laboratorier som vurderer effekten av eksperimentelle behandlingsformer.

Protocol

En. Orthotopic Nyre tumorimplantasjonen Cell Culture Før orthotopic implantasjon, vokse mus Renca LUC celler som en monolayer til 75% konfluens. Etter trypsinering og resuspensjon i 5% FBS inneholdende media, sentrifuger cellene ved 1000 rpm, 4 ° C i 5 min, gjentatt tre ganger for å vaske i PBS. Deretter resuspender cellene i serum-fritt media til en konsentrasjon på 5 x 10 4 Renca LUC / 5 mL serumfritt medium. Merk: Avhengig av variant eller …

Representative Results

Figur 1a viser en skjematisk skisserte prosedyrene som er beskrevet i denne protokollen sammendraget. Flere viktige faktorer må vurderes for hvert trinn. For eksempel, i trinn 1 viser det to metoder for sub-kapsulært tumorcelle implantasjon inn i nyrene. Tumor-celler kan bli implantert inn i sub-capsular plass med en liten hvit-boble som bekrefter den lokaliserte plasseringen av celler med lekkasje hindres ved forsiktig fjerning av nålen og swabbing skytende væskeutslipp (figur 1B-i).</stron…

Discussion

Hensikten med denne protokoll er å vurdere klinisk relevant spontan metastatisk sykdom ved hjelp av en syngen tumor mus modell for å beskrive implantasjon / reseksjon teknikker. Foreløpig gjør de fleste av prekliniske studier som evaluerte nye eksperimentelle behandlingsformer ikke inkluderer studier av metastatisk sykdom og bare få rekapitulere stadier av primær tumorvekst, kirurgisk reseksjon, og eventuell spontan metastatisk spredning. Til dags dato, genmanipulerte mus modeller (GEMMs) genereres å lokke fram s…

Materials

DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine	Corning	10-013-CV
FBS	Invitrogen	10437-028
0.25% Trypsin EDTA	Corning	25-053-CL
1x DPBS without Calcium & Magnesium	Corning	21-031-CV
Matrigel	BD Biosciences	354234	must be kept on ice
Artifical tears-lubricant opthalmic ointment	Akorn Animal Health	17478-162-35
Pocket pro pet trimmer	Braintree scientific	CLP9931B
Alcohol swab	VWR	326895
Betadine solution swab	VWR	67618-152-01
MICRO DISSECTING sissors straight,blunt – 25mm blades – 4.5"	Southpointe surgical	RS-5982
Iris Forceps, serrated, curved, 10cm long	Kent scientific	INS15915	need two of these
10µl Hamilton syringe	Hamilton	7635-01
30G, 45 degree, RN needle	Hamilton	7803-07
Sterile cotton tipped appicator	VWR	10805-144
High temperature cautery kit	Kent scientific	INS500392
5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle	Ethicon	J834
Reflex clip applier for 7mm clips	Kent scientific	INS500343
Reflex clips, 7mm, non-sterile	Kent scientific	INS500344
Removing forceps, 12cm lone	Kent scientific	INS500347
0.9% Sodium Chloride	Baxter Healthcare	2B1322
Buprenorphine 0.01mg/mL
25G 5/8" needle	VWR	BD305122
1mL syringe w/out needle	VWR	BD309659
D-Luciferin	Gold Bio technology	LUCK-1G