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Chemistry

हॉट जैविक कटैलिसीस: इज़ोटेर्माल अनुमापन Calorimetry एंजाइमी प्रतिक्रियाओं विशेषताएँ

Published: April 4, 2014 doi: 10.3791/51487
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Bioinorganic Chemistry, Department of Pharmacy and Biotechnology, University of Bologna

Summary

इज़ोटेर्माल अनुमापन उष्मामिति उपायों गर्मी प्रवाह जारी या रासायनिक प्रतिक्रियाओं में लीन. इस विधि एंजाइम कटैलिसीस यों इस्तेमाल किया जा सकता है. इस पत्र में, वाद्य स्थापना के लिए प्रोटोकॉल, प्रयोग चल रहे हैं, और डेटा विश्लेषण आम तौर पर वर्णित है, और जैक सेम urease द्वारा एंजाइमी यूरिया हाइड्रोलिसिस के लक्षण वर्णन करने के लिए आवेदन किया.

Abstract

इज़ोटेर्माल अनुमापन उष्मामिति (आईटीसी) गर्मी लगभग हर रासायनिक प्रक्रिया को चिह्नित करने के लिए एक आंतरिक जांच के रूप में उपयोग कर, एक रासायनिक प्रतिक्रिया के दौरान जारी या अवशोषित उपाय है कि एक अच्छी तरह से वर्णित तकनीक है. आजकल, इस तकनीक को बड़े पैमाने पर biomolecular बंधन संतुलनों के thermodynamic मानकों का निर्धारण करने के लिए लागू किया जाता है. इसके अलावा, आईटीसी सीधे इस आवेदन अभी underexploited है, भले ही एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के कैनेटीक्स और thermodynamic मानकों (कश्मीर बिल्ली, कश्मीर मीटर, ΔH) को मापने के लिए सक्षम होना करने के लिए प्रदर्शन किया गया है. गर्मी परिवर्तन अनायास एंजाइमी कटैलिसीस के दौरान होने के रूप में, आईटीसी विश्लेषण के तहत प्रणाली के किसी भी संशोधन या लेबलिंग की आवश्यकता नहीं है और समाधान में प्रदर्शन किया जा सकता है. इसके अलावा, विधि सामग्री की छोटी राशि की जरूरत है. इन गुणों आईटीसी जैसे कई अनुप्रयोग, उदाहरण के लिए, दवाओं की खोज में एंजाइम कैनेटीक्स अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य शक्तिशाली और अद्वितीय उपकरण बनाते हैं.

कश्मीर बिल्ली का निर्धारण करने के लिए लागू किया जाता है Canavalia ensiformis (जैक सेम) urease द्वारा यूरिया के enzymatic hydrolysis की कश्मीर मीटर. प्रतिक्रिया की आंतरिक दाढ़ तापीय धारिता (ΔH INT) की गणना की जाती है. इस प्रकार प्राप्त मूल्यों कार्यप्रणाली की विश्वसनीयता का प्रदर्शन, साहित्य की रिपोर्ट में पिछले डेटा के साथ संगत कर रहे हैं.

Introduction

जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं का मात्रात्मक निर्धारण के जीवन के आधार पर जैविक प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है. उष्मामिति मात्रात्मक समाधान में लगभग हर रासायनिक प्रतिक्रिया चिह्नित करने के लिए एक लेबल से मुक्त कार्यप्रणाली प्रदान करता है. इस तकनीक को गर्मी जारी या समय के साथ अवशोषित उपाय है, और इसलिए एक सार्वभौमिक पहचान प्रणाली और प्रतिक्रिया अणुओं (यानी बाध्यकारी ऊष्मा), के रूप में अच्छी तरह से प्रतिक्रिया की दर (यानी कैनेटीक्स) को मापने के लिए की राशि यों के लिए एक बहुत ही सुविधाजनक पद्धति है. विशेष रूप से, इज़ोटेर्माल अनुमापन उष्मामिति (आईटीसी) प्रोटीन ligand, प्रोटीन, प्रोटीन, प्रोटीन, धातु आयनों और प्रोटीन डीएनए बातचीत 1-6 से जुड़े, biomolecular संतुलनों की ऊष्मा को चिह्नित करने के लिए पसंद की विधि के रूप में अपनाया गया है. इस आवेदन की क्षमता अब भी है, हालांकि इसके अलावा, गतिज जानकारी प्रदान करने के लिए आईटीसी की क्षमता, यह एंजाइम कटैलिसीस को मापने के लिए एक बहुत शक्तिशाली सिस्टम बनाता है7-9 को कम करके आंका.

Michaelis निरंतर (कश्मीर मीटर) और उत्प्रेरक दर लगातार (कश्मीर बिल्ली): यह दो गतिज मापदंडों पर निर्भर करता है, प्रतिक्रिया की दर और सब्सट्रेट एकाग्रता के बीच एक संबंध प्रदान करता है के रूप में Michaelis-Menten समीकरण 10, एंजाइमी प्रतिक्रियाओं का एक मात्रात्मक विवरण है . कश्मीर बिल्ली / कश्मीर मीटर अनुपात एक एंजाइम उत्प्रेरक दक्षता के रूप में जाना जाता है. अभ्यास में, एक विशेष प्रतिक्रिया के लिए कश्मीर मीटर के दृढ़ संकल्प और कश्मीर बिल्ली कटैलिसीस का पूरा विवरण प्रदान करता है.

एक ठेठ enzymatic प्रतिक्रिया (चित्रा 1) में, एक सब्सट्रेट (एस) बाद में संक्रमण राज्य में सक्रिय है जो एंजाइम सब्सट्रेट (ते) जटिल बनाने एंजाइम (ई), (ते *) के साथ सूचना का आदान प्रदान. बाद के अंत में विखंडित कि एंजाइम उत्पाद (ईपी) परिसर में बदल जाती है. ये कदमएस निम्नलिखित प्रतिक्रिया से वर्णित हैं.

(1)

कश्मीर 1 ते जटिल, कश्मीर -1 के गठन के लिए दर स्थिर है जहां कश्मीर बिल्ली उत्प्रेरक दर लगातार या कारोबार संख्या है, जबकि ते परिसर की हदबंदी के लिए दर स्थिर है.

: Michaelis-Menten समीकरण 10 के अनुसार, प्रतिक्रिया की दर के रूप में गणना की जा सकती

(2)

जिसमें कश्मीर मीटर = (कश्मीर -1 + K बिल्ली) / कश्मीर 1 और कश्मीर बिल्ली = वी मैक्स / [ई], वी मैक्स सभी एंजाइम सब्सट्रेट करने के लिए बाध्य है जब तक पहुँच अधिक से अधिक वेग होने के साथ.

इज़ोटेर्माल अनुमापन कैलोरीमीटर यूरिया के enzymatic हाइड्रोलिसिस चिह्नित करने के लिए इस अध्ययन में इस्तेमाल साधन है. इस उपकरण दो गढ़ा के आकार की कोशिकाओं (चित्रा 1) से युक्त एक adiabatic ढाल से बना है. इन संकीर्ण पहुँच ट्यूबों के साथ बाहर से जुड़े हैं. संदर्भ सेल आम तौर पर पानी के साथ या विश्लेषण के लिए इस्तेमाल विलायक से भर जाता है, जबकि नमूना सेल (सी ए 1.4 मिलीग्राम), एंजाइम समाधान के साथ भरी हुई है. आमतौर पर सब्सट्रेट समाधान के सीए. 0.3 मिलीलीटर युक्त एक लंबी सुई और संलग्न एक हलचल चप्पू के साथ एक घूर्णन सिरिंज, नमूना सेल पर मुहिम शुरू की है. एक शीतलक डिवाइस एक "सेल प्रतिक्रिया नेटवर्क" का उपयोग कर, नमूना और संदर्भ सेल और तापमान के बीच के अंतर की गणना करता है, यह गर्मी जोड़ने या घटाकर शून्य पर इस अंतर को बनाए रखता है. प्रयोग के दौरान, सब्सट्रेट एक निरंतर चुना तापमान पर एंजाइम समाधान में इंजेक्ट किया जाता है. जब एनzymatic प्रतिक्रिया जारी या अवशोषित गर्मी की राशि उत्पाद अणुओं में परिवर्तित कर रहे हैं कि सब्सट्रेट अणुओं की संख्या के अनुपात है, जगह लेता है. इसके अलावा, गर्मी प्रवाह की दर सीधे प्रतिक्रिया की दर से संबंधित है. मापा डेटा, प्रारंभिक आधारभूत से गर्मी का पता लगाने की एक विचलन (चित्रा 1) के रूप में प्रदर्शित होने, (μcal / सेक) नमूना सेल में होने वाली गर्मी प्रवाह के लिए आनुपातिक है जो नमूना सेल, करने के लिए साधन के द्वारा आपूर्ति की ताप विद्युत का प्रतिनिधित्व समय के साथ.

चित्रा 1
चित्रा 1. एंजाइमी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के इज़ोटेर्माल अनुमापन कैलोरीमीटर के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (नमूना सेल में) वहाँ का एक परिवर्तन में परिणाम एंजाइम समाधान में (इंजेक्शन सिरिंज में) सब्सट्रेट का अनुमापन पर होने वाली एक enzymatic प्रतिक्रियानमूना सेल और संदर्भ सेल लगातार तापमान के बीच का अंतर रखने की जरूरत कैलोरीमीटर, द्वारा जारी मॉल शक्ति. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

कुल मिलाकर, गर्मी परिवर्तन (क्यू) प्रतिक्रिया (ΔH) और बदले में कुल मात्रा टाइम्स द्वारा एकाग्रता दिया जाता है जो (एन), उत्पन्न उत्पाद के moles की संख्या की दाढ़ तापीय धारिता के लिए आनुपातिक है:

(3)

उत्पाद गठन समय के साथ प्रतिक्रिया की दर से मेल खाती है (डी पी / डीटी),, इस तरह के संबंध के माध्यम से एक ही समय (डीक्यू / डीटी) से अधिक उत्पन्न गर्मी की राशि से संबंधित हो सकते हैं:

(4)

इस समीकरण के अनुसार, एक Michaelis-Menten प्राप्त करने के क्रम में यह) कुल दाढ़ तापीय धारिता ΔH मैं मापने के लिए आवश्यक है साजिश, और विभिन्न सब्सट्रेट सांद्रता में द्वितीय) गर्मी प्रवाह dQ / डीटी. आमतौर पर, यह दो अलग अलग प्रयोगों में किया जाता है: पहला प्रयोग (विधि 1, एम 1) में, सब्सट्रेट एंजाइम समाधान में इंजेक्ट किया जाता है और पूरा सब्सट्रेट रूपांतरण के लिए गर्मी मापा जाता है; दूसरे प्रयोग (विधि 2, एम 2) में, सब्सट्रेट के एकाधिक इंजेक्शन प्रदर्शन कर रहे हैं और गर्मी उत्पादन की दर अलग सब्सट्रेट सांद्रता में मापा जाता है. डेटा के इन दो सेट गतिज मापदंडों कश्मीर मीटर और कश्मीर बिल्ली प्राप्त करने के लिए पर्याप्त हैं.

वर्तमान अनुच्छेद में, आईटीसी का उपयोग कर प्रदर्शन एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के लिए गतिज मापदंडों का निर्धारण करने के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल में वर्णित है. हम Canavalia ensiformis यूरिया द्वारा यूरिया hydrolysis के लिए विधि लागूएसई, एक संदर्भ प्रणाली के रूप में. इस पद्धति का उपयोग करके प्राप्त परिणामों और साहित्य में डेटा की रिपोर्ट के बीच अच्छे समझौते के इस दृष्टिकोण की विश्वसनीयता को दर्शाता है.

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Protocol

1. तैयारी नमूने

  1. एंजाइम समाधान के 2 मिलीलीटर और प्रत्येक प्रयोगात्मक चलाने के लिए सब्सट्रेट समाधान के 0.5 मिलीलीटर तैयार करें. सब्सट्रेट अलावा दौरान कमजोर पड़ने और मिश्रण की गर्मी को कम करने के लिए समान संरचना होने बफर समाधान में एंजाइम और सब्सट्रेट केंद्रित शेयर समाधान पतला.
    1. प्रयोग के दौरान पीएच परिवर्तन को रोकने के लिए पर्याप्त हैं कि बफर की स्थिति चुनें. उदाहरण के लिए, 20 मिमी HEPES पीएच 7 तटस्थ पीएच माप के लिए पर्याप्त है.
      नोट: प्रोटॉन विनिमय शामिल है वे प्रतिक्रिया की मापी ΔH को प्रभावित है, क्योंकि प्रयोग किया बफ़र्स की protonation enthalpies, विचार किया जाना चाहिए. विश्लेषण के तहत प्रणाली पर बफर या additives अणुओं के संभावित विशिष्ट प्रभाव को ध्यान में रखा जाना चाहिए. कार्बनिक विलायकों (जैसे DMSO) एंजाइम समाधान में शामिल कर रहे हैं, सब्सट्रेट समाधान में बिल्कुल एक ही एकाग्रता में उन्हें जोड़ने.
    2. एम 1 प्रयोग के लिए, शुरूएनएम रेंज में एंजाइम एकाग्रता (जैसे 1 एनएम) के साथ और एंजाइम एकाग्रता से और कश्मीर मीटर ऊपर परिमाण के कम से कम तीन आदेश उच्च एक सब्सट्रेट एकाग्रता के साथ.
    3. M2 प्रयोग के लिए, PM-एनएम रेंज में एंजाइम एकाग्रता (जैसे 15 बजे) के साथ शुरू करते हैं. सिरिंज में substrate एकाग्रता मिमी रेंज (जैसे 400 मिमी) में है.
      नोट: एकल इंजेक्शन एम 1 प्रयोग में, सांद्रता प्रयोगात्मक समय के साथ उत्पाद में कुल सब्सट्रेट रूपांतरण प्राप्त करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए. इसलिए, एंजाइम की एकाग्रता एंजाइम की दर पर निर्भर करता है: कम कश्मीर बिल्ली के साथ एंजाइमों अध्ययन के तहत कर रहे हैं, उच्च एंजाइम सांद्रता (10 माइक्रोन) का उपयोग किया जाना चाहिए. दूसरी ओर, M2 प्रयोग में इस्तेमाल एंजाइम सांद्रता इंजेक्शन सब्सट्रेट केवल मामूली (5% से कम) का सेवन किया और एंजाइम की प्रतिक्रिया स्थिर अवस्था में आय है कि आश्वस्त करना होगा. इस कारण से, उच्चएंजाइम दक्षता, आवश्यक एंजाइम एकाग्रता कम. प्रयोग के अंत में, नमूना सेल में सब्सट्रेट एकाग्रता कश्मीर मीटर से अधिक होना चाहिए.
  2. सावधानी से 280 एनएम, वर्णमिति, बीसीए assays 11 पर एक उचित विश्लेषणात्मक प्रक्रिया (जैसे absorbance के साथ एंजाइम और सब्सट्रेट सांद्रता की जांच. यह thermodynamic और गतिज मापदंडों का सही और विश्वसनीय गणना प्राप्त करने के लिए आवश्यक है.
  3. समाधान के पीएच मापने और एंजाइम और सब्सट्रेट समाधान दोनों के पीएच बेमेल (0.05 पीएच इकाइयों ±) प्रयोगात्मक शर्तों के तहत कम से कम है कि सत्यापित.

2. प्रयोग का प्रदर्शन

नोट: एक ही प्रक्रिया दोनों एक दूसरे के बाद प्रदर्शन कर रहे हैं जो एम 1 और M2 प्रयोग के लिए लागू किया जाना चाहिए.

  1. नमूना सेल और इंजेक्शन सिरिंज निर्माता के अनुसार साफ कर रहे हैं कि सत्यापित करेंनिर्देश. आसुत जल से यंत्र के साथ प्रदान की लोडिंग सिरिंज भरें, धीरे, नमूना सेल में सुई डालने सेल को भरने और एक ही सिरिंज का उपयोग तरल हटा दें. इस विधि का प्रयोग, बफर के साथ दो बार आसुत जल के साथ दो बार नमूना सेल धोने और.
  2. ध्यान से हवा के बुलबुले के गठन से बचने, लोडिंग सिरिंज का उपयोग एंजाइम समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ नमूना सेल लोड करें. यह सेल स्टेम के शीर्ष बाहर फैल धीरे धीरे जब तक सेल में समाधान इंजेक्षन. सीए के एक उछाल का उत्पादन. समाधान के 0.25 एमएल सेल में. दो बार दोहराएँ. यह कदम नमूना सेल में फंस हवाई बुलबुले को हटा.
  3. सेल स्टेम और सेल बंदरगाह के बीच कगार पर लोड हो रहा है सिरिंज की सुई जगह और किसी भी अतिरिक्त समाधान निकालने.
  4. VP-दर्शक कार्यक्रम आरंभ और, कंप्यूटर इंटरफेस से वांछित प्रयोगात्मक तापमान नीचे के तापमान 3 डिग्री सेल्सियस तक आईटीसी साधन संतुलित करना. यह लंबे समय संतुलन से बचने के लिए आवश्यक हैनिष्क्रिय भूमिका निभाई ठंडा डिवाइस के कारण प्रयोग से पहले की अवधि,.
  5. ऊपर एक ही प्रक्रिया के साथ आसुत जल के साथ संदर्भ सेल भरें. उच्च ईओण ताकत या उच्च osmolality साथ बफ़र्स नमूना समाधान में हैं, एक ही बफर एक संदर्भ समाधान के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  6. एक पतली सिलिकॉन ट्यूब का उपयोग कर, इंजेक्शन सिरिंज का भरण बंदरगाह के लिए एक प्लास्टिक सिरिंज लिंक. पानी इंजेक्शन सिरिंज भरा है यह दर्शाता है कि शीर्ष भरने बंदरगाह से बाहर आता है, जब तक पानी में सुई टिप रखने और ड्राइंग इंजेक्शन सिरिंज भरें. फिर पानी से सिरिंज टिप चाल और हवा खींचना, इंजेक्शन सिरिंज खाली करने के लिए. इस प्रक्रिया के साथ, बफर के साथ इंजेक्शन सिरिंज धोने, और इस प्रणाली के माध्यम से हवा खींचना. बाद में, ट्यूब के नीचे समाधान की छोटी राशि छोड़ रहा है, ध्यान से आकर्षित और पूरी तरह से इंजेक्शन सिरिंज भरें, सब्सट्रेट समाधान के 0.5 मिलीलीटर युक्त एक संकीर्ण ट्यूब में इंजेक्शन की सुई जगह है.
  7. सेकंप्यूटर इंटरफेस, प्रेस "बंद भरण बंदरगाह". सिलिकॉन लोड हो रहा ट्यूब निकालें. प्रेस "मिटाएँ और फिर से भरना" इंजेक्शन सिरिंज किसी भी हवाई बुलबुले बेदखल करने के लिए और थोक समाधान में वापस उन्हें निष्कासित करने की अनुमति देने के लिए बटन. दो बार दोहराएँ.
  8. किसी भी बूंदों को हटाने और नमूना सेल में इंजेक्शन सिरिंज की सुई स्थान के लिए किनारों पर पोंछ, इंजेक्शन सिरिंज ले जाएँ.
  9. कंप्यूटर पर, उपयुक्त चल रहा मानकों सेट. प्रयोगात्मक एंजाइम और सब्सट्रेट सांद्रता संकेत दिया जा सकता है.
    1. एम 1 प्रयोग में, reproducibility सत्यापित करने के लिए सब्सट्रेट के कम से कम दो अतिरिक्त (5-30 μl) की स्थापना की. प्रत्येक इंजेक्शन के बीच अंतर समय सुनिश्चित करने के लिए काफी बड़े (जैसे 1000 सेकंड) सेट करें कि अगले अलावा पहले आधारभूत की गर्मी संकेत देता है.
    2. M2 प्रयोग में, (उदाहरण के लिए 15 एक्स 5-10 μl) इंजेक्शन एकाधिक सेट. प्रणाली के लिए अनुमति इंजेक्शन (जैसे 180 सेकंड) के बीच अंतराल सेटप्रत्येक इंजेक्शन के बाद नए आधारभूत की ताप विद्युत tabilize.
      नोट: M2 प्रयोग में इंजेक्शन के बीच रिक्ति समय माप स्थिर राज्य शर्तों के तहत किया जा करने की अनुमति, सब्सट्रेट का एक महत्वपूर्ण राशि के रूपांतरण से बचने के लिए काफी कम किया जाना चाहिए.
    3. M2 प्रयोग में, जिसका इसी मूल्य बाद में डेटा विश्लेषण के दौरान खारिज कर दिया है पहले इंजेक्शन, के लिए छोटी मात्रा में (उदाहरण के लिए 2 μl) का उपयोग करें. दरअसल, यह अक्सर सिरिंज टिप के माध्यम से प्रारंभिक सब्सट्रेट प्रसार की वजह से कलाकृतियों को प्रस्तुत करता है, और सिरिंज सुई में फंस हवाई बुलबुले की उपस्थिति के लिए.
    4. संदर्भ सत्ता सेट, आधारभूत प्रतिक्रिया के समक्ष पेश किया जाएगा, जिसमें लगभग 20 के स्तर के एक मूल्य पर, शुरू होता है. फिर प्रयोगात्मक एंजाइम और सब्सट्रेट सांद्रता को परिभाषित करने और प्रयोग के लिए एक नाम चुना है.
    5. आमतौर पर 25 डिग्री सेल्सियस पर, प्रयोगात्मक तापमान परिभाषित करें आईटीसी की अनुमति देता है 2 के बीच काम कर रहे तापमान डिग्री सेल्सियस और 80 डिग्री सेल्सियस प्रयोग चलाने के लिए तैयार है. प्रयोग शुरू करने के लिए प्रेस "प्रारंभ" बटन.
  10. प्रयोग समाप्त हो गया है, निर्माता के निर्देशों के अनुसार नमूना सेल और सिरिंज साफ.
  11. कम से कम एक या दो बार डेटा के reproducibility की जांच करने के लिए प्रयोग दोहराने.

3. डेटा विश्लेषण

  1. विश्लेषण कार्यक्रम से, "डेटा पढ़ें" बटन पर क्लिक करें, और प्रदर्शन किया M2 प्रयोग की. आईटीसी फ़ाइल जहां स्थित है फ़ोल्डर में नेविगेट. "प्रकार की फ़ाइलें" की पुस्तक नीचे तीर पर क्लिक करें और "एंजाइम परख (यह?)" का चयन करें. बाद में, क्लिक करें और M2 प्रयोग की. आईटीसी फ़ाइल खोलें.
  2. 5 समीकरण के अनुसार एम 1 प्रयोग की वक्र को एकीकृत से प्रतिक्रिया के ΔH प्राप्त करते हैं.
    "चौड़ाई =" 126 "/> (5)
    1. "डेटा पढ़ें" बटन पर क्लिक करें, और प्रदर्शन किया एम 1 प्रयोग की फ़ाइल. आईटीसी का चयन करें. उत्पत्ति का प्रयोग, एक चोटी से युक्त विभिन्न भागों में पता लगाने के विभाजन और एक. Opj फ़ाइल के रूप में प्रत्येक चोटी बचा. एक इंजेक्शन एम 1 प्रयोग, एकीकृत और प्राप्त क्षेत्र मूल्य विभाजन के thermogram में आधारभूत विचलन से, जिसके परिणामस्वरूप पहली शिखर को इसी फ़ाइल खोलें, μcal में व्यक्त, नमूना सेल में अंतिम सब्सट्रेट एकाग्रता से, माइक्रोन में व्यक्त और सेल मात्रा से 5 समीकरण, प्रतिक्रिया के ΔH के अनुसार, निर्धारित करने, लीटर में व्यक्त किया.
    2. एम 1 प्रयोग की दूसरी शिखर के लिए एक ही प्रक्रिया को दोहराएँ और दो ​​ΔH मापन के लिए एक औसत मूल्य प्राप्त करते हैं.
  3. प्रत्येक इंजेक्शन के बाद मूल आधार रेखा और नए आधारभूत के बीच अंतर को मापने M2 प्रयोग से dQ / डीटी का निर्धारण करते हैं. ई कन्वर्टसमीकरण 4 के अनुसार प्रतिक्रिया दरों को xperimental डेटा, एम 1 प्रयोग में प्राप्त तापीय धारिता मूल्य का उपयोग और Michaelis-Menten समीकरण को डेटा फिट.
    1. विश्लेषण कार्यक्रम से, "डेटा पढ़ें" बटन पर क्लिक करें, और प्रदर्शन किया M2 प्रयोग की फ़ाइल. आईटीसी का चयन करें. "प्रकार की फ़ाइलें" की पुस्तक नीचे तीर पर क्लिक करें और "एंजाइम परख (यह?)" का चयन करें.
    2. एंजाइम परख संवाद बॉक्स चार मॉडलों में से एक को चुनने की अनुमति, खुलता है. खिड़की से - "केवल सब्सट्रेट विधि 2" का चयन करें.
    3. ΔH विंडो में 4.2 कदम में प्राप्त ΔH के मूल्य से संकेत मिलता है.
    4. फिटिंग प्रक्रिया में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एकाग्रता मूल्यों की जाँच करने के लिए "एकाग्रता" बटन पर क्लिक करें. "औसत समय (पी)" बटन पर क्लिक करें. संवाद बॉक्स डिफ़ॉल्ट मान बदलने के लिए या स्वीकार करने का अवसर दे रही है खोलता है. यह मान प्रत्येक सुई से पहले समय का प्रतिनिधित्व करता हैआयन जिसमें साधन मूविंग प्रत्येक सब्सट्रेट एकाग्रता में सत्ता के स्तर को निर्धारित करने की शक्ति संकेत. डिफ़ॉल्ट मूल्य की पुष्टि करने के लिए ठीक क्लिक करें.
    5. "शून्य वाई अक्ष" बटन पर क्लिक करें. कर्सर y = 0 में जगह के लिए, एक बिंदु डबल क्लिक करने के लिए अनुमति पार बाल में बदल जाता है. सिर्फ पहला इंजेक्शन बिंदु से पहले डबल क्लिक करें.
    6. गणना दर बटन पर क्लिक करें. दर (खाते कमजोर पड़ने प्रभाव में ले) नमूना सेल की मात्रा के लिए अनुमापन के दौरान जोड़ा सब्सट्रेट विभाजित करके प्राप्त सब्सट्रेट एकाग्रता, बनाम साजिश रची है. इस आपरेशन कश्मीर मीटर और कश्मीर बिल्ली प्राप्त करने के लिए लगाया जा सकता है कि एक ठेठ Michaelis-Menten साजिश देता है.
    7. कुछ अंक नष्ट कर दिया जाना चाहिए, "truncate डेटा" बटन का चयन करें. बुरा डेटा अंक और दर्ज मार्कर या प्रेस में से एक पर डबल क्लिक करें बाहर करने के लिए डेटा मार्कर ले जाएँ.
    8. वक्र फिट और करने के लिए "मॉडल के लिए फिट 'समारोह का प्रयोग करेंगतिज स्थिरांक प्राप्त करते हैं.

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Representative Results

Urease (ईसी 3.5.1.5, यूरिया amidohydrolase) archea, बैक्टीरिया, कोशिकीय eukaryotes और पौधों में पाया जाने वाला एक multisubunit निकल युक्त एंजाइम है. अनायास अमोनिया और बाइकार्बोनेट (समीकरण 6) 12 के एक दूसरे अणु देने के लिए मिटता जो अमोनिया और carbamate के लिए यूरिया की hydrolysis उत्प्रेरित जैविक नाइट्रोजन खनिज के अंतिम चरण में यह प्रोटीन कार्य करता है,.

(6)

यह प्रतिक्रिया मानव स्वास्थ्य और कृषि के क्षेत्र में 13 के लिए नकारात्मक प्रभाव से जिम्मेदार है जो पर्यावरण के पीएच की एक समग्र वृद्धि का कारण बनता है. पौधों में, urease की प्राथमिक भूमिका arginase व्युत्पन्न यूरिया 14 से पोषक तत्व नाइट्रोजन पुनरावृत्ति करने के लिए है. प्लांट ureases आम तौर पर 2 + 15 आयनों नी दो के साथ एक सक्रिय साइट युक्त प्रत्येक सबयूनिट के साथ एक 6 होमोसेक्सुअल hexamers हैं. उनमें से,Canavalia ensiformis (जैक सेम) urease (JBU) 1926 16 में सघन होने वाली पहली प्रोटीन की गई है. तब से, कई अध्ययनों से बड़े पैमाने पर कई स्रोतों से 13, 17 से ureases की संरचनात्मक और enzymatic गतिविधि की विशेषता है. इसलिए, JBU की ureolytic गतिविधि मात्रात्मक एंजाइमी कटैलिसीस का निर्धारण करने में आईटीसी की प्रयोज्यता प्रदर्शित करने के लिए एक प्रतिनिधि प्रतिक्रिया के रूप में चुना गया था. ΔH = -10.5 किलो कैलोरी / मोल का मान urease समाधान में यूरिया सब्सट्रेट इंजेक्शन लगाने और प्रतिक्रिया पूरा करने के लिए आगे बढ़ने के लिए अनुमति देकर परिणामस्वरूप थर्मल पावर को एकीकृत करके एक एम 1 प्रयोग (2A चित्रा) में मापा गया था. एक M2 प्रयोग (चित्रा 2 बी) में पंजीकृत थर्मल सत्ता समीकरण 4 (चित्रा -2) का उपयोग कर प्रतिक्रिया दर को परिवर्तित कर दिया गया. Michaelis-Menten समीकरण को प्राप्त आंकड़ों के फ़िट में JBU के लिए गतिज मापदंडों प्रदान की20 मिमी HEPES पीएच 7 कश्मीर बिल्ली = 30,200 सेकंड -1 और कश्मीर मीटर = 3.45 मिमी, के साथ समझौते में पहले से डेटा 18, 19 रिपोर्ट में.

चित्रा 2
चित्रा 2. आईटीसी. JBU (प्रकार सी 3) द्वारा निर्धारित urease द्वारा यूरिया हाइड्रोलिसिस lyophilized एंजाइम (नाममात्र गतिविधि 1,538 यू / मिलीग्राम) के रूप में खरीदा और अंतिम एकाग्रता के लिए 20 मिमी HEPES पीएच 7 के साथ पतला था. प्रतिक्रिया मिश्रण में एंजाइम की एकाग्रता शुद्ध एंजाइम की गतिविधि को खरीदा उत्पाद की निर्धारित गतिविधि की तुलना द्वारा गणना की गई, इसी लिए 6,200 यू / शुद्ध एंजाइम 20 के मिलीग्राम, और 545 केडीए के एक दाढ़ जन होने की सूचना होमोसेक्सुअल hexameric प्रोटीन. 2 एक्स 5 μl injec के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन एम 1 प्रयोग में मनाया (ए) ताप विद्युत,(नमूना सेल में) 1 एनएम JBU में (इंजेक्शन सिरिंज में) 20 मिमी यूरिया का माहौल. इंजेक्शन के बीच 750 सेकंड की दूरी प्रारंभिक मूल्य की ओर लौटने आधारभूत अनुमति देने के लिए आवेदन किया था. प्रतिक्रिया की तापीय धारिता 5 समीकरण के अनुसार, प्रत्येक चोटी और दो ​​मानों के औसत के एकीकरण से गणना की है. मूल्य पाठ में सूचना दी है. (बी) 15 बजे JBU में 400 मिमी यूरिया (20 एक्स 5 μl इंजेक्शन) titrating द्वारा प्राप्त M2 प्रयोग में मनाया ताप विद्युत,. 180 सेकंड के एक रिक्ति प्रणाली स्थिर राज्य स्तर तक पहुँचने और बनाए रखने के लिए अनुमति देने के लिए, इंजेक्शन के बीच लागू किया गया था. विभिन्न सब्सट्रेट सांद्रता में dQ / डीटी के बाद इसके अलावा आधारभूत के विस्थापन के रूप में प्राप्त की है. कमजोर पड़ने से गर्मी अकेले बफर में सब्सट्रेट titrating द्वारा प्रदर्शन एक रिक्त प्रयोग (ग्रे), के रूप में दिखाया गया है. (सी) चित्रा 2 बी में आधारभूत विस्थापन का उपयोग कर प्रतिक्रिया दर को परिवर्तित कर दिया गयासमीकरण 4. प्राप्त आंकड़ों (भरा वर्गों) के फ़िट 2 समीकरण उपयोग किया गया था, और एक ठोस पंक्ति के रूप में प्रतिनिधित्व किया है. फिट से प्राप्त कश्मीर मीटर का मूल्य और कश्मीर बिल्ली पाठ में रिपोर्ट कर रहे हैं.

एम 1 प्रयोग में मापा कुल गर्मी परिवर्तन विश्लेषण के तहत प्रतिक्रिया के दौरान होने वाली सभी घटनाओं की राशि का प्रतिनिधित्व करता है, और बफर से प्रोटॉन रिहाई या तेज, यदि लागू हो, सहित शामिल सभी प्रक्रियाओं की दाढ़ तापीय धारिता पर निर्भर करता है. प्रतिक्रिया प्रणाली एक बफर समाधान में प्रोटॉन का अधिग्रहण में जो एक सामान्य प्रक्रिया में, बफर प्रतिक्रिया कक्ष के भीतर अतिरिक्त गर्मी का निर्माण, प्रोटॉन विज्ञप्ति. इसलिए, मापा ΔH (ΔH एपीपी) स्पष्ट है, और प्रतिक्रिया (ΔH INT) के आंतरिक ΔH, साथ ही बफर के आयनीकरण तापीय धारिता (ΔH आयन), और Exchang ii) संख्या भी शामिल हैप्रोटॉन (एन) आईएनजी समीकरण 7 अनुसार:

(7)

इस समीकरण का प्रयोग, एम 1 प्रयोगों में, हम विभिन्न आयनीकरण enthalpies साथ बफ़र्स में यही प्रयोग का प्रदर्शन, और बफर के लिए विशिष्ट ΔH आयन के एक समारोह के रूप में मापा ΔH एप्लिकेशन की साजिश रचने और एन ΔH INT निर्धारित कर सकते हैं. परिणामस्वरूप रेखीय प्रतिगमन से, एन ढलान से प्राप्त होता है: एक सकारात्मक ढलान बफर से जारी प्रोटॉन का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि एक नकारात्मक ढलान, बफर द्वारा अधिग्रहीत प्रोटॉनों को दर्शाता है, ΔH INT Y-अक्ष पर अवरोधन से ली गई है.

समीकरण 6 में मनाया के रूप में, बफर से एक प्रोटॉन एच + के अधिग्रहण में समग्र यूरिया हाइड्रोलिसिस प्रतिक्रिया का परिणाम है. तदनुसार, के रूप में डीऊपर मानते, प्रतिक्रिया की गर्मी बफर deprotonation का योगदान भी शामिल है. हाइड्रोलिसिस प्रतिक्रिया की आंतरिक ΔH की गणना करने के लिए, तीन एम 1 प्रयोगों INT ΔH. तीन अलग ΔH आयन द्वारा विशेषता विभिन्न बफ़र्स (HEPES, TrisHCl, फॉस्फेट), में प्रदर्शन किया गया और बफर से रिहा प्रोटॉन की संख्या, से गणना अवरोधन और समीकरण 7 के अनुसार प्रयोगात्मक डेटा के रैखिक फिट की ढलान (चित्रा 3), पहले से हेलिकोबेक्टर urease 7 द्वारा उत्प्रेरित ही प्रतिक्रिया के लिए डेटा की रिपोर्ट के साथ पूर्ण समझौते में क्रमश: -14.7 किलो कैलोरी / मोल और 0.98 थे. हमारे ज्ञान करने के लिए, कोई डेटा thermodynamic अब तक, JBU के लिए सूचित किया गया है.

चित्रा 3
ΔH INT का निर्धारण. अलग बफ़र्स (भरा वर्गों) में ΔH अनुप्रयोग के मूल्यों में 20 मिमी HEPES (ΔH आयन = 4.88 किलो कैलोरी / मोल) में एम 1 प्रयोगों प्रदर्शन द्वारा निर्धारित किया गया है, 20 मिमी TrisHCl (ΔH आयन = 11.34 किलो कैलोरी / मोल), और 20 मिमी फॉस्फेट (ΔH आयन = 0.86 किलो कैलोरी / मोल) 21. रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण प्रतिक्रिया की ΔH INT निर्धारित करने की अनुमति दी डेटा के (ठोस लाइन), और साथ ही प्रोटॉनों की संख्या यूरिया कारोबार के दौरान विमर्श किया.

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Discussion

मौजूदा तरीकों के संबंध में enzymatic गतिविधि का अध्ययन करने के लिए आईटीसी का महत्व

बंधन संतुलनों अध्ययन करने के लिए अपने शास्त्रीय अनुप्रयोगों के अलावा, इज़ोटेर्माल अनुमापन उष्मामिति व्यवस्था परिवर्तन या लेबलिंग की आवश्यकता के बिना, एक जांच के रूप में प्रतिक्रिया की गर्मी का उपयोग कर समाधान में एंजाइमी प्रतिक्रियाओं को चिह्नित करने के लिए एक विश्वसनीय और तेजी से विधि प्रदान करता है. काइनेटिक मापदंडों बिल्ली कश्मीर और कश्मीर मीटर आमतौर पर उत्पाद गठन (या सब्सट्रेट खपत) सतत या टूटनेवाला assays में नजर रखी है, जिसमें समय पाठ्यक्रम प्रयोगों का एक सेट के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं. आमतौर पर, सब्सट्रेट या उत्पाद एकाग्रता विशेषता तरंग दैर्ध्य प्रकाश absorbance या प्रतिदीप्ति द्वारा मापा जाता है. हालांकि, ज्यादातर substrates और / या उत्पादों spectroscopically सक्रिय नहीं हैं, और इसलिए एक क्रोमोफोर या fluorophore प्रतिक्रिया पालन करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, के साथ, assays युग्मितमध्यम श्रेणी के उत्पाद के साथ एक और प्रतिक्रिया के लिए एक सब्सट्रेट जा रहा कटैलिसीस के उत्पाद, नियोजित किया जा सकता है. इन विधियों, हालांकि, कश्मीर मीटर और कश्मीर बिल्ली के निर्धारित मूल्यों की सटीकता को कम कि अतिरिक्त चर परिचय. इसके अलावा, पारंपरिक तरीकों का उपयोग कर छोटे ligands द्वारा एंजाइम निषेध के लक्षण वर्णन स्पेक्ट्रोस्कोपी परख की विश्वसनीयता को बदल सकता है जो छोटे ligand ही, के absorbance या प्रतिदीप्ति से जटिल हो सकता है. वैकल्पिक तरीकों उत्पाद की मात्रा मास स्पेक्ट्रोमेट्री या क्रोमैटोग्राफी का उपयोग मात्रा निर्धारित है, जिसमें बंद कर दिया प्रवाह तकनीक, शामिल है. इन तकनीकों में बहुत ही सटीक और विश्वसनीय हैं, लेकिन समय लगता है और नियमित विश्लेषण के लिए महंगे हैं. जांच जारी की है कि या अवशोषित गर्मी है, आईटीसी प्रयोगों में पीछा किया, लगभग सभी रासायनिक प्रतिक्रियाओं की एक आंतरिक गुण है. इसलिए आईटीसी विश्लेषण के तहत प्रणाली के किसी भी संशोधन या लेबलिंग की आवश्यकता नहीं है. इसके अलावा, टीउनकी तकनीक, सरल और तेज है सामग्री की छोटी राशि की आवश्यकता है और समाधान 22, 23 में किया जा सकता है.

प्रोटोकॉल और संभव संशोधनों के भीतर महत्वपूर्ण कदम

प्रतिक्रिया विश्लेषण आम तौर पर विभिन्न सब्सट्रेट सांद्रता में समय के साथ प्रतिक्रिया और गर्मी परिवर्तन की कुल दाढ़ तापीय धारिता प्रदान जो दो अलग प्रयोगों में किया जाता है. अच्छी गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए, प्रयोग जांच की शुरुआत में विस्तार से योजना बनाई जानी चाहिए. उनके सही मूल्य डेटा विश्लेषण में विश्वसनीय मापदंडों की गणना के लिए आवश्यक है के रूप में प्रोटीन और सब्सट्रेट सांद्रता ध्यान से, निर्धारित किया जाना चाहिए. बफर रचना और एंजाइम और सब्सट्रेट समाधान दोनों के पीएच सब्सट्रेट अलावा दौरान मिश्रण की गर्मी को कम करने के लिए, समान होना चाहिए. यह आम तौर पर एक डायलिसिस या एक आकार exclu प्रदर्शन द्वारा सुनिश्चित किया जाता हैप्रयोग चल रहा है, और सब्सट्रेट भंग करने के लिए स्तंभ से eluting बफर उपयोग करने से पहले एंजाइम समाधान पर सायन क्रोमैटोग्राफी कदम. एक नियंत्रण प्रयोग कमजोर पड़ने से गर्मी घटाना या यह नगण्य है सत्यापित करने के क्रम में, एंजाइम के अभाव में प्रतिक्रिया बफर में इंजेक्शन सब्सट्रेट के समान समाधान के साथ किया जाना चाहिए.

डेटा विश्लेषण आम तौर पर निर्माता द्वारा प्रदान आईटीसी के मूल कार्यक्रम के साथ किया जाता है. अगर जरूरत डेटा विश्लेषण के लिए पसंद का एक वैकल्पिक कार्यक्रम, नियोजित किया जा सकता.

तकनीक की समस्या निवारण और सीमाएं

एक अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात प्रतिक्रिया प्रणाली वाद्य पता लगाने सीमा पर काबू पाने के लिए आईटीसी सेल में काफी गर्मी पैदा करने के लिए अनुमति देता है एक दर पर आय केवल तभी प्राप्त होता है. यह आमतौर पर 1 मिनट -1 से कश्मीर बिल्ली उच्चतर के साथ सिस्टम के लिए हासिल की है. इस मामले में,आईटीसी के लिए मूल सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से कच्चे डेटा से Michaelis-Menten साजिश की गणना करता है, और nonlinear कम से कम वर्गों प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग, यह कश्मीर बिल्ली और कश्मीर मीटर मूल्यों की गणना करता है. इस विश्लेषण कोई महत्वपूर्ण उत्पाद निषेध हो जाती है. एम 1 प्रयोग में बाद में इंजेक्शन प्रारंभिक आधारभूत पर लौटने के लिए समय ले रहा दूसरा शिखर की शक्ति का पता लगाने के साथ अलग अलग आकार के साथ चोटियों और, विशेष रूप से, उत्पादन जब उत्तरार्द्ध आम तौर पर दिख रहा है. उत्पाद निषेध होता है, उद्देश्य विशेष के समीकरणों के साथ लागू पसंद का एक और सॉफ्टवेयर,, इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

हर एंजाइमी प्रणाली की आंतरिक अंतर है, और के लिए इष्टतम चल शर्तों (यानी एंजाइम और सब्सट्रेट सांद्रता, संख्या और इंजेक्शन की मात्रा में अंतर रखने का समय, आदि) के निर्धारण, एक प्राथमिकताओं मात्रा निर्धारित नहीं किया जा सकता है जो अलग प्रतिक्रियाओं द्वारा निर्मित विभिन्न गर्मी को देखते हुए एक विशिष्ट प्रणाली कभी कभी आर कुछ खोजपूर्ण titrations equire.

विश्लेषण के दौरान देखभाल के विश्लेषण के तहत प्रणाली के अनुसार प्रयोगात्मक शर्तों का चयन करने के लिए लागू किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, फॉस्फेट enzymatic प्रतिक्रिया 24, 25 के कुल दर कम हो जाती है फॉस्फेट बफर में प्रयोग का प्रदर्शन, इसलिए urease द्वारा यूरिया हाइड्रोलिसिस रोकता है, और.

ऐप्लकेशन

Enzymatic प्रतिक्रिया की कैनेटीक्स निर्धारित किया गया है, प्रतिक्रिया प्रतिस्पर्धी जनरल निषेध समीकरण 8 26, (कश्मीर आईसी) का उपयोग करते हुए, को मापने के लिए आदेश में, विभिन्न प्रकार और नमूना सेल में एंजाइम inhibitors की सांद्रता की उपस्थिति में दोहराया जा सकता है इस प्रकार हमें निषेध के विभिन्न प्रकार के बीच भेद करने के लिए अनुमति अप्रतिस्पर्धी (कश्मीर यूआईसी) निषेध स्थिरांक,.

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अंत में, इस पद्धति ऐसी दवा स्क्रीनिंग में ही दवा और औद्योगिक अनुप्रयोगों के लिए एंजाइम inhibitors की एक बड़ी संख्या में परीक्षण करने के लिए एक तेजी से और आर्थिक मार्ग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

विशेषता उर्वरक उत्पाद कंपनी (SFP) इस अध्ययन के लिए आवश्यक धन उपलब्ध कराने के लिए स्वीकार किया है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Sigma H3375 dissolving in water and adjusting pH with NaOH
TRIZMA-Base Sigma T1503 dissolving in water and adjusting pH with HCl
Sodium dihydrogen phosphate Riedel-de-Haen 4270 dissolving in water
Sodium phosphate dibasic Riedel-de-Haen 30427 dissolving in water
Urea Sigma U4128 dissolving in water at 40 °C
Canavalia ensiformis urease (type C-3) Sigma U0251 dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C
VP-ITC on Origin 7.0 MicroCal (GE Healthcare) SYS13901 instrument 
VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0 MicroCal (GE Healthcare) data acquisition software supplied with the instrument

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Mazzei, L., Ciurli, S., Zambelli, B. Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions. J. Vis. Exp. (86), e51487, doi:10.3791/51487 (2014).

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