Hot Biological Katalyse: Isotermisk Titrering Calorimetry å karakter enzymatiske reaksjoner

Summary

Isoterm titrering kalorimetri tiltak varmestrøm løslatt eller absorberes i kjemiske reaksjoner. Denne metoden kan brukes til å kvantifisere enzymkatalyse. I denne utredningen, protokollen for instrumental oppsett, eksperiment, og dataanalyse er generelt beskrevet, og brukes på karakterisering av enzymatisk urea hydrolyse av jack bønne urease.

Abstract

Isoterm titrering kalorimetri (ITC) er en godt beskrevet teknikk som måler varmen frigitt eller absorbert i løpet av en kjemisk reaksjon, ved hjelp av den som en indre sonde å karakterisere praktisk talt alle kjemisk prosess. I dag er denne teknikken mye brukt til å bestemme termodynamiske parametre for biomolekylære bindende likevekter. I tillegg har ITC blitt vist å være i stand til direkte å måle kinetiske og termodynamiske parametere _{(k, katt,} K _m, AH) av enzymatiske reaksjoner, selv om denne søknaden er fremdeles underutnyttet. Som varme endringer spontant forekomme under enzymatisk katalyse, betyr ITC krever noen modifikasjon eller merking av systemet under analysen og kan utføres i løsning. Videre krever fremgangsmåten lille mengde materiale. Disse egenskapene gjør ITC en uvurderlig, kraftig og unike verktøy for å studere enzymkinetikk i flere applikasjoner, slik som, for eksempel, drug discovery.

<p class = "jove_content"> I dette arbeidet en eksperimentell ITC-basert metode for å kvantifisere kinetikk og termodynamikk av enzymatiske reaksjoner er grundig beskrevet. Denne metoden blir anvendt for å bestemme k _katt og K _M av den enzymatiske hydrolyse av urea ved Canavalia ensiformis (jack bean) urease. Beregning av iboende molar entalpi (AH _int) av reaksjonen utføres. De verdier som således ble oppnådd er i overensstemmelse med tidligere data som er rapportert i litteraturen, noe som viser påliteligheten av metodikk.

Introduction

Kvantitativ måling av biokjemiske reaksjoner gir innsikt i de biologiske prosessene på grunnlag av livet. Kalorimetri tilbyr en etikett-fri metode for å kvantitativt karakterisere nesten enhver kjemisk reaksjon i løsningen. Denne teknikk måler varmen frigitt eller absorbert over tid, og er derfor en universell deteksjonssystem og en meget fordelaktig metode for å kvantifisere mengden av reagerende molekyler (det vil si bindingstermodynamikk), så vel som å måle reaksjonshastigheten (dvs. kinetikk). Spesielt har isoterm titrering kalorimetri (ITC) er vedtatt som metode for valg å karaktertermodynamikken for biomolekylære likevekter, som involverer protein-ligand, protein-protein, protein-metallioner og protein-DNA vekselvirkninger ^1-6. I tillegg gjør evnen til ITC å gi kinetisk informasjon den en meget kraftig system for å måle enzymkatalyse, men potensialet i denne søknaden er fremdelesvurderes ^7-9.

Den Michaelis-Menten ligningen ¹⁰ er en kvantitativ beskrivelse av enzymatiske reaksjoner, da det gir et forhold mellom reaksjonshastighet og substratet konsentrasjon, avhengig av to kinetiske parametre: Michaelis konstant (K _M), og den katalytiske hastighetskonstant (k _katt) . Den k _cat / K _M-forhold er omtalt som den katalytiske effektiviteten av et enzym. I praksis bestemmelse av K _M og k _katt for en bestemt reaksjon gir en fullstendig beskrivelse av katalyse.

I en typisk enzymreaksjon (figur 1), et substrat (S) kommuniserer med enzym (E) som danner det enzym-substrat (ES)-kompleks, som deretter aktiveres i overgangstilstand (ES *). Den sistnevnte omdannes til den enzymprodukt (EP)-kompleks som til slutt spaltes. Disse trinns er beskrevet ved den følgende reaksjon.

(1)

hvor k er _en hastighetskonstanten for dannelsen av ES-komplekset, k _-1 er hastighetskonstanten for dissosiering av ES-komplekset, mens k _katt er det katalytiske hastighetskonstant eller omsetning nummer.

I henhold til Michaelis-Menten ligningen ^10, kan reaksjonshastigheten beregnes som:

(2)

hvori K _M = (k _-1 + k _cat) / k ₁ og k _cat = v _max / [E], med v _max er den maksimale hastighet er nådd når alle enzymet er bundet til underlaget.

Den isotermiske titrering kalorimeteret er instrumentet brukt i denne studie for å karakterisere den enzymatiske hydrolyse av urea. Dette instrumentet består av en adiabatisk skjold som inneholder to innførte formede celler (figur 1). Disse er koblet til utsiden med smale tilgangs rør. Prøvecellens (ca. 1,4 ml) blir lastet med enzym-oppløsningen, mens referansecelle er vanligvis fylt med vann eller med oppløsningsmidlet som brukes for analysen. En roterende sprøyte med en lang nål og en røre paddle festet, vanligvis inneholdende ca. 0,3 ml av substrat-løsning, er montert på prøvecellen. En termoelektrisk enhet måler forskjellen i temperatur mellom prøven og referansecellen og, ved hjelp av en "celle tilbakekoblingsnettverk", opprettholder det denne forskjellen til null ved å legge til eller trekke varme. Under eksperimentet er substratet sprøytet inn i enzymløsning på en konstant valgt temperatur. Når det nozymatic reaksjon finner sted, hvor mye varme som frigis eller absorberes, er proporsjonal med antallet av substrat-molekyler som er omdannet til produkt-molekyler. I tillegg er hastigheten av varmestrømmen er direkte relatert til graden av reaksjonen. De målte data, som vises som et avvik av varme spor fra basislinje (figur 1), representerer den termiske effekt (μcal / sek) som leveres av apparatet til prøvecellen, som er proporsjonalt med varmestrømmen som forekommer i prøven cellen over tid.

Figur 1. Skjematisk fremstilling av isotermisk titrering kalorimeteret for å studere enzymatiske reaksjoner. An enzymatiske reaksjon oppstår ved titrering av substratet (i injeksjonssprøyten) inn i enzym-løsning (i prøvecellen) resulterer i en endring av den thermal kraft frigjøres av kalorimeteret, nødvendig for å holde forskjellen i temperatur mellom prøvecellen og referansecellen konstant. for å vise større bilde.

Totalt sett er den varmeendring (Q) proporsjonal med den molare entalpi av reaksjon (AH) og antall mol produkt ble generert (n), som i sin tur er gitt av det totale volumet ganger konsentrasjonen:

(3)

Produktet dannelse over tid (dP / dt), som svarer til reaksjonshastigheten, kan således være relatert til mengden av varme som genereres i samme tid (dQ / dt) ved forholdet:

(4)

I henhold til denne ligningen, for å oppnå en Michaelis-Menten plotte det er nødvendig å måle i) det totale molare entalpi AH, og ii) den varmestrøm dQ / dt på forskjellige substrat-konsentrasjoner. Vanligvis blir dette utført i to forskjellige eksperimenter: I det første eksperiment (metode 1, M1), blir substratet sprøytet inn i enzym-oppløsningen og varmen for fullstendig substrat omdanning blir målt; i det andre forsøk (metode 2, M2), er flere injeksjoner av substratet utføres, og graden av varmeproduksjonen blir målt ved forskjellige substrat-konsentrasjoner. Disse to sett med data er tilstrekkelig til å avlede de kinetiske parameterne K _M og k _katt.

I denne artikkelen, er en generell protokoll for å bestemme kinetiske parametere for enzymatiske reaksjoner som utføres ved hjelp av ITC beskrevet. Vi brukt metoden til urea hydrolyse av Canavalia ensiformis urease, som et referansesystem. Den god overensstemmelse mellom resultatene oppnådd ved hjelp av denne fremgangsmåte og de data som er rapportert i litteraturen viser påliteligheten til denne fremgangsmåten.

Protocol

En. Forbereder Samples Forbered 2 ml enzymløsning og 0,5 ml av substrat-løsning for hver forsøkskjøring. Fortynn konsentrerte stamløsninger av enzym og substrat i bufferoppløsninger som har lik sammensetning for å redusere varmen av fortynning og blanding under substratet tilsetningen. Velg bufferbetingelser som er tilstrekkelig til å forhindre pH-endring i løpet av eksperimentet. For eksempel, i 20 mM HEPES pH 7 tilstrekkelig for målinger ved nøytral pH. MERK: Ved proton u…

Representative Results

Urease (EC 3.5.1.5; urea amidohydrolase) er en multisubunit nikkelholdig enzym som finnes i Archea, bakterier, encellede eukaryote og planter. Dette protein fungerer i det siste trinnet av organisk nitrogen minera, katalysering av hydrolyse av urea til ammoniakk og karbamat, som spontant spaltes til å gi et andre molekyl av ammoniakk og bikarbonat (Ligning 6) 12. (6) <p class…

Discussion

Betydningen av ITC å studere enzymatisk aktivitet med hensyn til eksisterende metoder

I tillegg til sin klassiske programmer for å studere bindende likevekter, gir isoterm titrering kalorimetri en pålitelig og rask metode for å karakterisere enzymatiske reaksjoner i løsning ved hjelp av reaksjonsvarmen som en sonde, uten å kreve system modifikasjon eller merking. Den kinetiske parameterne k _katt og K _M blir vanligvis oppnådd gje…

Materials

HEPES	Sigma	H3375	dissolving in water and adjusting pH with NaOH
TRIZMA-Base	Sigma	T1503	dissolving in water and adjusting pH with HCl
Sodium dihydrogen phosphate	Riedel-de-Haen	4270	dissolving in water
Sodium phosphate dibasic	Riedel-de-Haen	30427	dissolving in water
Urea	Sigma	U4128	dissolving in water at 40 °C
Canavalia ensiformis urease (type C-3)	Sigma	U0251	dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C
VP-ITC on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)	SYS13901	instrument
VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)		data acquisition software supplied with the instrument