Hot Biologisk katalyse: Isothermal Titrering kalorimetri at karakterisere enzymatiske reaktioner

Summary

Isotermisk titrering kalorimetri foranstaltninger varmestrøm frigivet eller absorberet i kemiske reaktioner. Denne metode kan anvendes til at kvantificere enzym-katalyse. I dette papir, protokol for instrumental opsætning, eksperiment kører, og dataanalyse beskrives generelt, og anvendes til karakterisering af enzymatisk urea hydrolyse ved sværdbønne urease.

Abstract

Isotermisk titrering kalorimetri (ITC) er et velbeskrevet teknik, der måler varmeafgivelse eller absorberes i løbet af en kemisk reaktion, bruge det som en iboende sonde til at karakterisere næsten enhver kemisk proces. I dag er denne teknik vid udstrækning anvendes til at bestemme termodynamiske parametre for biomolekylær bindende ligevægte. Desuden har ITC vist sig at være i stand til direkte at måle kinetik og termodynamiske parametre (k _kat, K _M, AH) af enzymatiske reaktioner, selv om denne ansøgning er stadig underudnyttet. Som spontant opstår varme ændringer i løbet af enzymatisk katalyse, er ITC ikke kræver nogen ændring eller mærkning af systemet under analyse og kan udføres i opløsning. Desuden fremgangsmåden brug lille mængde materiale. Disse egenskaber gør ITC et uvurderligt, kraftfuld og unikt værktøj til at studere enzymkinetik i flere programmer, såsom, for eksempel lægemiddelforskning.

<p class = "jove_content"> I dette arbejde et eksperimentelt ITC-baserede metode til at kvantificere kinetik og termodynamik enzymatiske reaktioner er grundigt beskrevet. Denne metode anvendes til at bestemme _kcat og K _M af den enzymatiske hydrolyse af urinstof ved Canavalia ensiformis (jack bean) urease. Beregning af indre molære enthalpi (AH _int) i reaktionen udføres. De således opnåede værdier er i overensstemmelse med tidligere data rapporteret i litteraturen, viser pålideligheden af ​​metoden.

Introduction

Kvantitativ bestemmelse af biokemiske reaktioner giver indsigt i de biologiske processer på basis af livet. Kalorimetri tilbyder en etiket-fri metode til kvantitativt karakterisere næsten enhver kemisk reaktion i opløsning. Denne teknik måler den varme, der frigøres eller absorberes over tid, og derfor er et universelt system til påvisning og en meget praktisk metode til at kvantificere mængden af reagerende molekyler (dvs. bindende termodynamik), samt til at måle reaktionshastigheden (dvs. kinetik). Især har isoterm titrering kalorimetri (ITC) er blevet vedtaget som den foretrukne metode til at karakterisere termodynamik biomolekylære ligevægte, der involverer protein-ligand protein-protein, protein-metalioner og protein-DNA interaktioner ^1-6. Desuden evne ITC at tilvejebringe kinetisk information gør det til en meget kraftfuld system til at måle enzymkatalyse, selv om potentialet i denne ansøgning er stadigundervurderet ^7-9.

Michaelis-Menten-ligningen ¹⁰ er en kvantitativ beskrivelse af enzymatiske reaktioner, da det giver en sammenhæng mellem reaktionshastighed og substratkoncentrationen, afhængigt af to kinetiske parametre: Michaelis konstant (K _M), og den katalytiske hastighedskonstant _(kcat) . The _kcat / _KM-forholdet er nævnt som den katalytiske effektivitet af et enzym. I praksis, bestemmelse af K _M og K _kat for en specifik reaktion giver en komplet beskrivelse af katalyse.

I en typisk enzymatisk reaktion (figur 1) et substrat (S) interagerer med enzymet (E), der danner enzym-substrat (ES)-komplekset, der efterfølgende aktiveres i transition state (ES *). Sidstnævnte omdannes til enzym-produkt (EP) kompleks, der i sidste ende dissocierer. Disse skridts er beskrevet ved den følgende reaktion.

(1)

hvor k ₁ er hastighedskonstanten for dannelsen af ES-kompleks, k _-1 er hastighedskonstanten for dissociation af ES-kompleks, mens _kcat er den katalytiske hastighedskonstant eller omsætning nummer.

Ifølge Michaelis-Menten ligningen ^10, kan hastigheden af reaktionen beregnes som:

(2)

hvor K _M = (k _-1 + k _cat) / k ₁ og k _cat = v _max / [E], og v _max er den maksimale hastighed nås, når alt enzym er bundet til substratet.

Den isotermiske titrering kalorimeter er det instrument, der anvendes i denne undersøgelse for at karakterisere den enzymatiske hydrolyse af urinstof. Dette instrument består af en adiabatisk skjold indeholder to opfundet-formede celler (fig. 1). Disse er forbundet til ydersiden med smalle adgang rør. Prøvecellen (ca. 1,4 ml) er fyldt med enzymopløsningen, mens Cellereferencen generelt er fyldt med vand eller med opløsningsmidlet, der anvendes til analysen. En roterende sprøjte med en lang nål og en mixeren tilknyttet, der sædvanligvis indeholder ca. 0,3 ml substratopløsning er monteret på prøvecellen. En termoelektrisk anordning måler forskellen i temperatur mellem prøven og referencen celle og ved hjælp af en "celle-feedback netværk", det fastholder denne forskel på nul ved at tilføje eller fratrække varme. Under eksperimentet substratet sprøjtes ind enzymopløsningen ved en konstant valgte temperatur. Når enzymatic reaktion finder sted, den mængde varme, der frigøres eller absorberes er proportional med antallet af substratmolekyler, der omdannes til produkt-molekyler. Desuden er hastigheden af ​​varmestrømmen direkte relateret til hastigheden af ​​reaktionen. De målte data, der optræder som en afvigelse af varme spor fra den indledende baseline (figur 1), repræsenterer den termiske effekt (μcal / sek) leveres af instrumentet til prøven celle, der er proportional med varmestrøm forekommer i prøven celle over tid.

Figur 1. Skematisk repræsentation af isotermisk titrering-kalorimeter at undersøge enzymatiske reaktioner. En enzymatisk reaktion under titrering af substratet (i injektionssprøjten) i enzymopløsning (i prøvecellen) resulterer i en ændring af den thermal effekt frigivet af kalorimeteret, nødvendig for at holde forskellen i temperatur mellem prøven celle og cellereferencen konstant. Klik her for at se større billede.

Samlet set varmeændring (Q) er proportional med den molære enthalpi af reaktionen (AH) og antallet af mol-produkt genereret (n), som igen er givet ved den samlede volumen gange koncentrationen:

(3)

Produktet formation over tid (dP / dt), der svarer til den reaktionshastighed, kan således være relateret til mængden af ​​varme, der genereres i løbet af samme tid (dQ / dt) gennem relationen:

(4)

Ifølge denne ligning med henblik på at opnå en Michaelis-Menten plot det er nødvendigt at måle i) den samlede molære enthalpi AH, og ii) varmestrøm dQ / dt ved forskellige substratkoncentrationer. Normalt er denne udført i to forskellige eksperimenter: i det første eksperiment (metode 1 M1) substratet injiceres i enzymopløsningen og varmen for komplet substrat omdannelse måles; i det andet eksperiment (Metode 2, M2), er flere injektioner af substrat udføres, og hastigheden af varmeproduktion måles ved forskellige substratkoncentrationer. Disse to sæt af data er tilstrækkelige til at udlede de kinetiske parametre K _M og k _kat.

I denne artikel er en generel protokol til at bestemme de kinetiske parametre for enzymatiske reaktioner udført ved hjælp af ITC beskrevet. Vi har anvendt den metode til at urea hydrolyse af Canavalia ensiformis ureaselv som et referencesystem. Den gode aftale mellem de opnåede ved hjælp af denne metode resultater og de rapporterede data i litteraturen viser pålideligheden af ​​denne fremgangsmåde.

Protocol

1.. Forberedelse Prøver Forbered 2 ml enzymopløsning og 0,5 ml substratopløsning for hver forsøgskørsel. Fortyndes koncentrerede stamopløsninger af enzym og substrat i pufferopløsninger med identisk sammensætning for at minimere den varme fortynding og blanding under substrattilsætning. Vælg pufferbetingelserne forhold, der er tilstrækkelig til at forhindre pH-ændring i løbet af eksperimentet. For eksempel, 20 mM HEPES pH 7 er tilstrækkelig til målinger ved neutral pH. …

Representative Results

Urease (EC 3.5.1.5, urea amidohydrolase) er en multisubunit nikkel-holdige enzym i Archea, bakterier, encellede eukaryoter og planter. Dette protein virker i det sidste trin af organisk kvælstof mineralisering, katalyserer hydrolyse af urea til ammoniak og carbamat, som spontant nedbrydes til at give et andet molekyle af ammoniak og bikarbonat (ligning 6) 12. (6) <p class="jo…

Discussion

Betydningen af ITC at studere enzymatisk aktivitet med hensyn til de eksisterende metoder

Ud over sin klassiske applikationer for at studere bindende ligevægte, isotermiske titrering kalorimetri giver en pålidelig og hurtig metode til at karakterisere enzymatiske reaktioner i opløsning ved hjælp af varmen fra reaktionen som en sonde, uden at det kræver systemet ændring eller mærkning. De kinetiske parametre _kcat og K _M opnås s?…

Materials

HEPES	Sigma	H3375	dissolving in water and adjusting pH with NaOH
TRIZMA-Base	Sigma	T1503	dissolving in water and adjusting pH with HCl
Sodium dihydrogen phosphate	Riedel-de-Haen	4270	dissolving in water
Sodium phosphate dibasic	Riedel-de-Haen	30427	dissolving in water
Urea	Sigma	U4128	dissolving in water at 40 °C
Canavalia ensiformis urease (type C-3)	Sigma	U0251	dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C
VP-ITC on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)	SYS13901	instrument
VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)		data acquisition software supplied with the instrument