إنشاء نظم الثقافة الابتدائية بطانة الرحم انسجة الخلايا من عينات استئصال الرحم هي تقنية البيولوجية قيمة وخطوة حاسمة قبل متابعة مجموعة واسعة من ويهدف البحث. هنا، نحن تصف طريقتين تستخدم لإنشاء الثقافات اللحمية من أنسجة بطانة الرحم جراحيا مقطوعة من المرضى من البشر.
وقد كرس الكثير من الجهود لإنشاء نظم في خلية ثقافة المختبر. تم تصميم هذه النظم في تصميم نموذج لعدد كبير من العمليات في الجسم الحي. نظم زراعة الخلايا الناشئة من عينات بطانة الرحم الإنسان ليست استثناء. وتتراوح التطبيقات من العمليات الفسيولوجية دوري طبيعية لأمراض الرحم مثل سرطانات أمراض النساء، والأمراض المعدية، وأوجه القصور الإنجابية. هنا، ونحن نقدم طريقتين لإنشاء خلايا انسجة بطانة الرحم الأساسي من مقطوعة جراحيا العينات استئصال الرحم بطانة الرحم. يشار الأسلوب الأول باسم "أسلوب تجريف"، ويتضمن تجريف الميكانيكية باستخدام شفرات الحلاقة أو الجراحية في حين يسمى الطريقة الثانية "طريقة التربسين." يستخدم هذا الأسلوب الأخير في النشاط الأنزيمي من التربسين لتعزيز الفصل بين الخلايا الأولية و ثمرة الخلية. نحن لتوضيح خطوة بخطوة منهجية من خلال الصور الرقمية والمجهري. ونحن كما قدمأمثلة الإلكترونية للتحقق من صحة بطانة الرحم خطوط الخلايا اللحمية في الوقت الحقيقي عبر تفاعلات البلمرة الكمية (QPCR) والمناعي (IF).
ويتكون جسم الإنسان الرحم من ثلاث طبقات، وperimetrium (أو المصلية)، وعضل الرحم، وبطانة الرحم. تميز كل من هذه الطبقات هي خطوة مهمة لإنشاء خطوط الخلايا بطانة الرحم. وperimetrium هو الأكثر الخارجي طبقة من الرحم ويتكون من خلايا المصلية رقيقة. عضل الرحم هو، طبقة وسطى سميكة من الرحم وتتألف من خلايا العضلات الملساء. يتم التعرف على بطانة الرحم والطبقة الداخلية للرحم، ويشمل الظهارية وخلايا انسجة السكان.
تنقسم بطانة الرحم الى مزيد من الطبقة القاعدية التي هو الافتراض السكان الخلية لإعادة ملء طبقة طبقة وظيفية كل ما يقرب من 28 أيام 1 الجذعية. طبقة من بطانة الرحم وظيفي الإنسان يخضع لتغيرات كيميائية حيوية والصرفية كبير في استجابة لتعميم الهرمونات. وتستمد هذه الهرمونات من الغدة النخامية والمبايض.
الإنتاج منسقة والإفراج عن نتائج الهرمونات في دورة الإنجابية. تم تصميم دورة التكاثر لتحضير بطانة الرحم لغرس الجنين الأحداث المحتملة. في البشر، ومن المعروف أن دورة التكاثر باسم "الدورة الشهرية" وينقسم إلى ثلاث مراحل – التكاثري، إفرازية، والحيض. المرحلة التكاثري ينطوي على انتشار وظيفي طبقة بطانة الرحم في حين وضعت المرحلة إفرازية بواسطة ظيفي النضج. على وجه التحديد، والتعديلات خارج الخلية، إفرازات، وتمايز الخلايا يشير إلى غرس المحتملة. إذا لم تحدث زرع قبل نهاية المرحلة إفرازية، وتسليط طبقة بطانة الرحم وظيفي أثناء مرحلة الحيض. لا تزال قيد المناقشة على أهمية الحيض والأحداث التي تؤدي إلى سفك طبقة طبقة وظيفية. في البشر، وقد طرحت أن الحيض هو نتيجة لحدث معين منتصف المرحلة إفرازية التمايز المعروفكما "decidualization عفوية" 2. في هذا المخطوط، ونحن نقدم منهجية مفصلة لكلتا الطريقتين العزلة خلية انسجة بطانة الرحم، واستخدام مزيج من المناعي والصور الرقمية لإثبات فعالية هذه النهج. بالإضافة إلى ذلك، نحن نطبق التي يشيع استخدامها في نموذج المختبر من decidualization عفوية لتأكيد بطانة الرحم العزلة الخلايا اللحمية.
وقد وصفت جماعات أخرى وتكييفها منهجية لإعداد الثقافات انسجة بطانة الرحم، وهي في معظمها تستخدم كولاجيناز 4،12،13،15-18. في هذا المخطوط، قدمنا المنهجية والدليل على طريقتين مبسطة الأولية بطانة الرحم الثقافة اللحمية، وكلاهما تستخدم من قبل مختبرنا لأسباب اقتصادية ?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر الجهود التعاونية الدكتور ثاو دانغ وأعضاء مختبر لها لاستخدام معدات التصوير والمجهر بهم. كما نشكر Biorepository والأنسجة مرفق البحوث (BTRF) الأساسية، جيف هاربر، والمقيمين في جامعة فيرجينيا لتزويدنا أنسجة الرحم. نشكر كارول Szlachta للمساعدة في تخطيطي لمحة عامة.
0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin | Hyclone | SH3023602 or SH30004202 | |
1.7 micro Centrifuge Tube | Genesee Scientific | 22-272A | |
1µl,20µl, 200ml and 1000µl Pipette | Genesee Scientific | 24-401,24-402, 24-412, 24-430 | |
15ml Conical Tube | Hyclone | 339650 | |
50ml Conical Tube | Hyclone | 339652 | |
6cm Cell Culture Dish | Thermo scientific | 12-556-002 | |
8 well Chambers | Thermo Scientific | AB-4162 | |
Acetate | Fisher scientific | C4-100 | |
AMV RT Enzyme/Buffer | Bio Labs | M077L | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1605-100 | |
Buffered Zinc Formalin | Thermo | 59201ZF | |
Charcoal strip FBS | Fisher | NC9019735 | |
Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
Cover slip | Fisher Brand | 12-544D | |
Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | B7880 | |
DMEM/High Glucose | Hyclone | SH30243FS | |
dNTP | Bioline | BIO-39025 | |
Donkey Anti Goat -TRITC | Santa Cruz | SC-3855 | |
Donkey Serum | Jackson’s lab | 017-000-002 | |
E Cadherin Antibody | Epitomics | 1702-1 | |
Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-1 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 03-600-511 | |
Fungizone Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
GAPDH Probe | Life Technologies | HS99999905 | |
Glycogen | 5Prime | 2301440 | |
Goat Anti Mouse -FITC | Jackson’s Lab | 115-096-003 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
Medroxyprogesterone acetate (MPA) | Sigma | M1629 | |
MeOH (Methanol) | Fisher Scientific | A4-08-1 | |
Mounting Media (w/DAPI) | Vector Labratories | H-1500 | |
N6 DNA Oligos | Invitrogen | ||
Number 15 Scraper | BD | 371615 | |
Pan Cytokeratin Mouse mAB | Cell Signaling | 4545 | |
PBS (phosphate buffered saline) | Fisher Scientific | BP-399-4 | |
Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X | Hyclone | SV30082.01 | |
PML Anti Goat Anti body | Santa Cruz | SC-9862 | |
Primer(s) | Eurofins | ||
RPMI | Hyclone | SH30027FS | |
RPMI (Phenol free) | Gibco | 11835 | |
Sybr Green | Thermo Scientific | AB-4162 | |
Taqman | Thermo | AB-4138 | |
Trizol | Life Technologies | 15596018 | |
Vimentin Antibody | Epitomics | 4211-1 |