子宮摘出標本からの一次子宮内膜間質細胞培養系を確立することは、貴重な生物学的な手法と先行研究の目的の広大な配列を追求する重要なステップである。ここでは、ヒト患者の外科的に切除された子宮内膜組織からの間質培養物を確立するために使用される2つの方法を記載する。
多くの努力が、インビトロ細胞培養系で確立するために専念している。これらのシステムは、in vivoでの膨大な数のプロセスをモデル化するように設計されている。人間の子宮内膜のサンプルから生じる細胞培養システムも例外ではありません。アプリケーションでは、通常のサイクリックな生理的プロセスからこのような婦人科癌、感染症、生殖不備などの子宮内膜の病変の範囲です。ここでは、外科的に切除、子宮内膜子宮摘出標本からの一次子宮内膜間質細胞を確立するための2つの方法を提供する。第一の方法は、「削り法」と呼ばれ、第2の方法と呼ばれるのに対して、外科的または剃刀の刃を用いて機械的掻き取りを組み込んで、「トリプシン法」この後者の方法は、細胞の分離および原発を促進するために、トリプシンの酵素活性を使用し細胞伸長。私たちは、デジタル画像や顕微鏡を通してステップバイステップの方法論を示している。我々はまた、提供します:定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(定量PCR)及び免疫蛍光(IF)を介して、子宮内膜間質細胞株を検証するための電子例。
ヒト子宮コーパス3層、子宮外膜(又は漿膜)、子宮筋層及び子宮内膜から構成されている。これらの層のそれぞれを区別することは、子宮内膜細胞株を確立するための重要なステップである。子宮外膜は子宮の最も外側の層であり、薄い、漿液細胞からなる。子宮筋層の厚さの中間層であり、平滑筋細胞からなる。子宮内膜は、子宮の内層として同定され、上皮および間質細胞集団を含む。
子宮内膜は、さらに、その幹細胞集団は、約28日ごとに1 functionalis層を再増殖すると仮定されている基底層に細分される。ヒト子宮内膜のfunctionalis層は、ホルモンの循環に応じて、重要な生化学的および形態学的変化を受ける。これらのホルモンは、下垂体や卵巣から派生しています。
ザ·コーディネートの生産と生殖周期におけるホルモンの結果のリリース。生殖周期は、潜在的な胚着床イベントの子宮内膜を作製するように設計されている。ヒトでは、生殖周期」は、月経周期」として知られており、3つの段階に分け – 増殖、分泌、および月経。分泌期がfunctionalis成熟によってマークされているのに対し、増殖期はfunctionalis子宮内膜層の増殖を伴う。具体的には、細胞外の変化、分泌物、および細胞分化は、潜在的な注入を知らせる。注入は分泌期の終了前に発生しない場合は、functionalis子宮内膜層は月経期の間に流されている。月経とfunctionalis層の脱落をトリガーするイベントの重要性はまだ議論されています。ヒトでは、月経が知られている特定の中間分泌期の分化事象の結果であると提起されている「自発的脱落膜化」2など。本稿では、両方の子宮内膜間質細胞の単離方法の詳細な方法論を提供し、これらのアプローチの有効性を実証するために、免疫蛍光、デジタル画像の組み合わせを使用する。加えて、我々は一般的に適用される子宮内膜間質細胞の単離を確認するために、自発的な脱落膜化のインビトロモデルにおいて使用される。
他のグループについておよびコラゲナーゼ4,12,13,15-18を利用するほとんどが子宮内膜間質培養物を調製するための方法を適応している。本稿では、我々は経済的な理由とトリプシンの便利な利用可能性および/またはカミソリの刃のために私たちの研究室で利用され、どちらも2単純化された主要な子宮内膜間質培養法のための方法論と証拠を提供した。
我々の2つ?…
The authors have nothing to disclose.
我々は彼らのイメージング顕微鏡設備の使用のために博士タオダンと彼女の研究室のメンバーの共同の努力に感謝します。我々はまた、子宮組織を私たちに提供するためのバイオレポジトリーおよび組織研究施設(BTRF)コア、ジェフ·ハーパー、バージニア大学の住民に感謝。私たちは、回路図の概要のヘルプはカロルSzlachtaに感謝します。
0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin | Hyclone | SH3023602 or SH30004202 | |
1.7 micro Centrifuge Tube | Genesee Scientific | 22-272A | |
1µl,20µl, 200ml and 1000µl Pipette | Genesee Scientific | 24-401,24-402, 24-412, 24-430 | |
15ml Conical Tube | Hyclone | 339650 | |
50ml Conical Tube | Hyclone | 339652 | |
6cm Cell Culture Dish | Thermo scientific | 12-556-002 | |
8 well Chambers | Thermo Scientific | AB-4162 | |
Acetate | Fisher scientific | C4-100 | |
AMV RT Enzyme/Buffer | Bio Labs | M077L | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1605-100 | |
Buffered Zinc Formalin | Thermo | 59201ZF | |
Charcoal strip FBS | Fisher | NC9019735 | |
Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
Cover slip | Fisher Brand | 12-544D | |
Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | B7880 | |
DMEM/High Glucose | Hyclone | SH30243FS | |
dNTP | Bioline | BIO-39025 | |
Donkey Anti Goat -TRITC | Santa Cruz | SC-3855 | |
Donkey Serum | Jackson’s lab | 017-000-002 | |
E Cadherin Antibody | Epitomics | 1702-1 | |
Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-1 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 03-600-511 | |
Fungizone Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
GAPDH Probe | Life Technologies | HS99999905 | |
Glycogen | 5Prime | 2301440 | |
Goat Anti Mouse -FITC | Jackson’s Lab | 115-096-003 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
Medroxyprogesterone acetate (MPA) | Sigma | M1629 | |
MeOH (Methanol) | Fisher Scientific | A4-08-1 | |
Mounting Media (w/DAPI) | Vector Labratories | H-1500 | |
N6 DNA Oligos | Invitrogen | ||
Number 15 Scraper | BD | 371615 | |
Pan Cytokeratin Mouse mAB | Cell Signaling | 4545 | |
PBS (phosphate buffered saline) | Fisher Scientific | BP-399-4 | |
Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X | Hyclone | SV30082.01 | |
PML Anti Goat Anti body | Santa Cruz | SC-9862 | |
Primer(s) | Eurofins | ||
RPMI | Hyclone | SH30027FS | |
RPMI (Phenol free) | Gibco | 11835 | |
Sybr Green | Thermo Scientific | AB-4162 | |
Taqman | Thermo | AB-4138 | |
Trizol | Life Technologies | 15596018 | |
Vimentin Antibody | Epitomics | 4211-1 |