Histerektomi örneklerden primer endometrial stromal hücre kültürü sistemlerinin kurulması, önceki araştırma amaçlayan geniş bir dizi takip için değerli bir biyolojik teknik ve çok önemli bir adımdır. Burada, insan hasta cerrahi olarak kesilmiş dokuları endometriyal stromal kültürleri oluşturmak için kullanılan iki yöntem tarif eder.
Pek çok çabalar vitro hücre kültür sistemleri kurmak için tahsis edilmiştir. Bu sistemler, in vivo işlemler geniş bir model numarası tasarlanmıştır. İnsan endometriyal örnekleri kaynaklanan hücre kültürü sistemleri bir istisna vardır. Uygulamalar normal siklik fizyolojik süreçler böyle jinekolojik kanserler, bulaşıcı hastalıklar ve üreme eksiklikleri gibi endometrial patolojilerin değişir. Burada, biz, cerrahi rezeksiyon, endometrial histerektomi örneklerden birincil endometrial stromal hücreler kurmak için iki yöntem sağlar. İlk yöntem, "kazıma yöntemi" olarak adlandırılır ve ikinci yöntem adlandırılır ise, cerrahi ya da tıraş bıçakları kullanılarak, mekanik kazıma içeren bir "tripsin yöntemi." Bu ikinci yöntem, hücrelerin ayrılmasını teşvik etmek için birincil ve tripsin enzimatik aktivitesini kullanır hücre akıbet. Biz dijital görüntü ve mikroskobu ile adım-adım yöntemi açıklamak. Ayrıca providkantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonları (qPCR) ve immünfloresansta (IF) üzerinden endometrial stromal hücre hatları doğrulamak için e örnekleri.
Insan uterus gövdesi üç tabakadan, perimetrium (ya da salgılı zarı), myometrium ve endometrium oluşur. Bu tabakaların her biri ayırt endometrial hücre serilerini kurmak için önemli bir adımdır. Perimetrium rahim en dış tabaka ve ince, seröz hücrelerden oluşur. Myometrium kalın, orta rahim tabakası ve yumuşak kas hücrelerinin oluşur. Endometrium rahim iç tabaka olarak tanımlanmıştır ve epitel ve stromal hücre popülasyonları içerir.
Endometrium ayrıca olan kök hücre popülasyonunun yaklaşık olarak her 28 günde bir 1 functionalis tabaka yeniden doldurmak için hipotezi basalis tabaka halinde bölünmüştür. İnsan endometrium tabakası functionalis hormonları dolaşan yanıt önemli biyokimyasal ve morfolojik değişikliklere uğrar. Bu hormonlar hipofiz bezi ve yumurtalıklar türetilir.
bir üreme döngüsü koordine üretim ve hormonlar sonuçların serbest. Üreme döngüsü potansiyel embriyo implantasyon olaylar için endometrium hazırlamak için tasarlanmıştır. İnsanlarda, üreme döngüsü "adet döngüsü" olarak bilinen ve üç evreye ayrılır – çoğalma, salgı ve adet. Salgı faz functionalis olgunlaşması ile işaretlenmiş ise çoğalma fazı functionalis endometrial tabakanın proliferasyonunu içerir. Spesifik olarak, hücre dışı değişiklikler, salgılar ve hücresel farklılaşma potansiyel implantasyonu işaret etmektedir. Implantasyon salgı aşamasının bitiminden önce oluşmazsa, functionalis endometrium tabakası adet aşamasında dökülüyor. Âdet ve functionalis tabakasının dökülmesini tetikleyen olayların önemi hala tartışılmaktadır. İnsanlarda, bu adet bilinen özel bir orta salgı faz farklılaşması olayın sonucu olduğunu ortaya edilmiştir"spontane sidualizasyonu" 2 olarak. Bu yazıda, iki endometrial stromal hücre izolasyon yöntemleri için detaylı metodoloji sağlamak ve bu yaklaşımların etkinliğini göstermek için immünofloresans ve dijital görüntülerin bir arada kullanın. Ayrıca, yaygın olarak uygulanır endometriyal stromal hücre izolasyonu teyit etmek için kendiliğinden desidualizasyon in vitro modelde kullanılan a.
Diğer gruplar kolajenaz 4,12,13,15-18 kullanan çoğu endometriyal stromal kültürleri, hazırlanması için bir yöntem tarif adapte edilmiştir. Bu yazıda, ekonomik nedenler ve tripsin ve / veya jilet uygun kullanılabilirliği için bizim laboratuvarda tarafından kullanılan her ikisi de iki basitleştirilmiş temel endometrial stromal kültür yöntemleri için metodoloji ve kanıt sağladı.
Bizim iki yöntem kıyaslarken, hem başarıyla uygulanabilir birincil kültürle…
The authors have nothing to disclose.
Biz onların görüntüleme ve mikroskop ekipman kullanımı için Dr Thao'nun Dang ve onun laboratuar üyelerinin ortak çabaları teşekkür ederim. Biz de rahim dokusu ile bize sağlamak için Biorepository ve Doku Araştırma Tesisi (BTRF) çekirdek, Jeff Harper ve Virginia Üniversitesi sakinlerine teşekkür ederim. Biz Şematik Bakış ile yardım için Karol szlachta teşekkür ederim.
0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin | Hyclone | SH3023602 or SH30004202 | |
1.7 micro Centrifuge Tube | Genesee Scientific | 22-272A | |
1µl,20µl, 200ml and 1000µl Pipette | Genesee Scientific | 24-401,24-402, 24-412, 24-430 | |
15ml Conical Tube | Hyclone | 339650 | |
50ml Conical Tube | Hyclone | 339652 | |
6cm Cell Culture Dish | Thermo scientific | 12-556-002 | |
8 well Chambers | Thermo Scientific | AB-4162 | |
Acetate | Fisher scientific | C4-100 | |
AMV RT Enzyme/Buffer | Bio Labs | M077L | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1605-100 | |
Buffered Zinc Formalin | Thermo | 59201ZF | |
Charcoal strip FBS | Fisher | NC9019735 | |
Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
Cover slip | Fisher Brand | 12-544D | |
Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | B7880 | |
DMEM/High Glucose | Hyclone | SH30243FS | |
dNTP | Bioline | BIO-39025 | |
Donkey Anti Goat -TRITC | Santa Cruz | SC-3855 | |
Donkey Serum | Jackson’s lab | 017-000-002 | |
E Cadherin Antibody | Epitomics | 1702-1 | |
Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-1 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 03-600-511 | |
Fungizone Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
GAPDH Probe | Life Technologies | HS99999905 | |
Glycogen | 5Prime | 2301440 | |
Goat Anti Mouse -FITC | Jackson’s Lab | 115-096-003 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
Medroxyprogesterone acetate (MPA) | Sigma | M1629 | |
MeOH (Methanol) | Fisher Scientific | A4-08-1 | |
Mounting Media (w/DAPI) | Vector Labratories | H-1500 | |
N6 DNA Oligos | Invitrogen | ||
Number 15 Scraper | BD | 371615 | |
Pan Cytokeratin Mouse mAB | Cell Signaling | 4545 | |
PBS (phosphate buffered saline) | Fisher Scientific | BP-399-4 | |
Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X | Hyclone | SV30082.01 | |
PML Anti Goat Anti body | Santa Cruz | SC-9862 | |
Primer(s) | Eurofins | ||
RPMI | Hyclone | SH30027FS | |
RPMI (Phenol free) | Gibco | 11835 | |
Sybr Green | Thermo Scientific | AB-4162 | |
Taqman | Thermo | AB-4138 | |
Trizol | Life Technologies | 15596018 | |
Vimentin Antibody | Epitomics | 4211-1 |