פונקציונליות ניטור ומורפולוגיה של כלי דם גויס על ידי גורמים מופרשים על ידי תאים מניבי גידול בצמיחה מהיר
Summary
We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).
Abstract
Assay תקע matrigel תת-עורי בעכברים הוא שיטת הבחירה להערכת in vivo של גורמים פרו ואנטי-angiogenic. בשיטה זו, גורמים רצויים מוכנסים ג'ל ECM-לחקות קר-הנוזלי ש, לאחר הזרקה תת עורית, מתמצק ליצירת סביבה מחקה את הסביבה בסרטן. מטריצה זו מאפשרת החדירה של תאי מארח, כגון תאי אנדותל, ולכן, ההיווצרות של כלי דם.
במסמך זה אנו מציעים בדיקה חדשה ששונתה תקע matrigel, אשר יכול להיות מנוצלת כדי להמחיש את פוטנציאל angiogenic של בריכה של גורמים המופרשים על ידי תאי סרטן, בניגוד לגורם ספציפי (למשל, bFGF וVEGF) או סוכן. התקע המכיל ג'ל ECM-לחקות מנוצל כדי להציג את המארח (כלומר, עכבר) עם בריכה של גורמים המופרשים לCM של תאי גליובלסטומה מניב גידול בצמיחה מהירה. שתארנו השוואה מקיפה של פוטנציאל angiogenic של עברגליובלסטומה U-87 MG אדם והשיבוט הנגזר הרדום שלה, במודל מערכת זו, המציגה אנגיוגנזה המושרית בU-87 התאים MG ההורים. CM הוא הוכן על ידי סינון תקשורת שנאספו מצלחות תרבית רקמה ומחוברות של שני שורות תאים הבאים דגירה 48 שעות. מכאן, שהוא מכיל גורמים היחידים המופרשים על ידי התאים, ללא התאים עצמם. שתוארה כאן הוא השילוב של שתי שיטות הדמיה, microbubbles הדמיה אולטרסאונד חומר ניגוד וendomicroscopy fibered-confocal intravital, לאפיון מדויק, בזמן אמת של המידה, המורפולוגיה ופונקציונליות של כלי דם חדש שיוקמו בתוך התקעים.
Introduction
Assay אנגיוגנזה תקע matrigel תואר לראשונה על ידי Kibbey et al. בשנת 1992, שבו הוא משמש להערכת גירוי אנגיוגנזה ידי SIKVAV פפטיד (Ser-איל-ליס-Val-עלא-Val) 1. בניגוד למבחני אנגיוגנזה אחרים in vivo, כמו אנגיוגנזה קרנית העכבר או מבחני קרום chorioallantoic חומוס, assay זה הוא קל יחסית לביצוע 2. ג'ל ECM-לחקות המוזרק עלול להכיל תאים, פרו-angiogenic או תרכובות ו / או גורמים אנטי-angiogenic. כאשר אנו מעריכים את הפעילות של תרכובת אנטי angiogenic, התקע בדרך כלל מכיל תערובת של גורם כלי דם האנדותל צמיחה (VEGF) וגורם גדילה פיברובלסטים (FGF), והחומר אנטי-angiogenic יכול להינתן ישירות לתקע או מערכתי 3, 4.
ג'ל ECM-לחקות מוזרק מתחת לעור שבו הוא מתקשה תוך דקות. הערכה של גיוס כלי דם בתקע וכתוצאה מכך היא typically מבוצע על ידי מדידת רמות המוגלובין בתוך התקע, על ידי מדידת אותות הקרינה לאחר ההזרקה של isothiocyanate והעמסת (FITC), שכותרת dextran, על ידי immunostaining סעיפים היסטולוגיה לסמנים האנדותל ספציפי או על ידי תא הקרינה המופעל מיון (FACS) 2,5, 6. עם זאת, הערכה זו מאפשרת רק ניתוח נקודת סיום וחסר מידע על פונקציונלי והמורפולוגיה של כלי דם. בנוסף, מדידות של נפח פלזמה, בין אם על ידי רמות המוגלובין או באמצעות dextran-FITC כאינדיקטור, עלולה להטעות שכן תוכן דם מושפע מגודלם של כלי דם ומידת ברכות עומדות של דם. זה חיוני במיוחד כאשר כלי הדם גויס מאופיין בחדירות המשופרות והשפעת ההחזקה (EPR) 7.
אנו מציעים במסמך זה, שיטה חדשה, מדויקת יותר להדמיה של כלי הדם גויסו על ידי שילוב של שתי שיטות הדמיה משלימות. HIGmicrobubbles הרזולוציה h אולטרסאונד בניגוד משופר (ארה"ב) בשילוב עם fibred-confocal endomicroscopy intravital יכול לספק מידע לא רק על צפיפות כלי דם, אלא גם על המורפולוגיה והפונקציונליות שלהם. יתר על כן, ניתוח זה יכול להתבצע במספר נקודות זמן ובכך מאפשרות ניטור של קינטיקה אנגיוגנזה. ארה"ב היא שיטת הדמיה בשימוש נרחב אשר ברשותה רזולוציה מרחבית גבוהה להדמית כלי הדם הבא (iv) הזרקה תוך ורידית של microbubbles שתישאר באופן בלעדי בתא של כלי דם 8-11. Microbubbles היא microbubbles מלאת גז שמייצרת אות echogenic חזקה כאשר נרגש עם דופק ארה"ב ובכך לשמש כחומר ניגוד טוב. תמונות 3D של התקע נרכשות באמצעות תוכנת מערכת ההדמיה בארה"ב בעקבות הרס microbubbles. תמונות וכתוצאה מכך מורכבות ממסגרות תמונה של הרס-לפני ואחרי של microbubbles ומשקפות את ההבדל בעוצמת וידאו בצבע. יכסה אלהתמונות מוצגות באופן אוטומטי על ידי התוכנה. כתוצאה מכך, אחוז מכולים הפונקציונליים בתוך התוספת ניתן לכמת. רזולוציה גבוהה fibered endomicroscopy confocal משמשת כשיטת הדמיה משלימה על ידי דיווח על מורפולוגיה כלי דם. בשיטה זעיר פולשנית זה, תמונות שנרכשו לאחר נטילת iv של dextran FITC מצומדות- 12. פולימר צבעי ניאון זרם הדם ובכך משמש כ'חומר ניגוד 'למורפולוגיה כלי דם וזרימת דם. יתר על כן, מאז הפולימר המוזרק הוא בגודל של 70 kDa, זה יכול רק לחצות כלי דולפים כפי שנמצא בכלי דם של גידול. זה יגרום רקע גבוה מdextran FITC שכותרתו מחוץ לכלי הדם. כתוצאה מכך, endomicroscopy confocal fibered יכול לשמש כדי לחזות מאפיינים טיפוסיים של השפעת EPR בגידול neovasculature- כלי מוגדלים, דולפים, סבוכים-מאוד, עם קצוות קהים.
מודל מערכת זו descriמיטה בהשוואה לפוטנציאל angiogenic של גליובלסטומה אדם U-87 MG והשיבוט הרדום שלה 13. כלי דם בתוך התקעים הוערכו שלושה שבועות חיסון הודעת ג'ל ECM-לחקות. זה היה הראה כי כלי הדם בתוך תקעים המכילים CM מU-87 MG מהיר גדל תאים מניבי גידול היה גדלו באופן משמעותי במונחים של מספר, צפיפות ופונקציונליות, בהשוואה לכלי דם בתוך תקעים המכילים CM מהתאים מניב גידול הרדומים. לפיכך, המחברים הצליחו להגיע למסקנה שCM מבודד מU-87 MG מהיר גדל תאים מניבי גידול מכיל רמות גבוהות יותר של גורמים פרו-angiogenic, לעומת CM מהתאים מניב גידול רדומים. גורמים אלה מעוררים את היווצרותם של כלי דם פונקציונליים על ידי באופן חיובי משפיע על כל השלבים של מפל angiogenic (כלומר, התפשטות, הנבטה, ההגירה וסופו של דבר, ההיווצרות של מבנים צינוריים של תאי אנדותל).
Protocol
Representative Results
Discussion
שילוב שיטות הדמיה משלימות מאפשר הקניית המידע על הכלי-הדם הקטן בצפיפות, פונקציונלי והמורפולוגיה של רכיבי אנגיוגנזה שונים. CM Loading על תקעי ג'ל ECM-לחקות יוצר מייקרו-סביבה של גידול, אשר מופרד מאוכלוסיות תאים אחרות, כמו תאי אנדותל, שגויסו וextravasate לתקע.
<p class="jove_content" style=";te…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Satchi-Fainaro research laboratory is partially supported by The Association for International Cancer Research (AICR), German-Israel Foundation (GIF), THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award, and by grants from the Israeli National Nanotechnology Initiative (INNI), Focal Technology Area (FTA) program: Nanomedicine for Personalized Theranostics, and by The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Rotary Vacuum Evaporator | – | – | – |
| Growth-factors reduced phenol-free Matrigel | BD Bioscience | FAL356231 | Thaw overnight, at 40C on ice |
| Depilatory cream | – | – | – |
| Vevo2100 US imaging system | VisualSonics Inc. | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| 55 MHz 708 probe | VisualSonics Inc. | – | – |
| Vevo2100 imaging software | VisualSonics Inc. | – | – |
| VialMix | DEFINITY Imaging | VMIX | – |
| DEFINITY microbubbles | DEFINITY Imaging | DE4 | Activate for 45 seconds using Vialmix before use |
| CellVizio (Fibered confocal endomicroscope) | Mauna Kea Technologies | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| ProFlex MiniO/30 probe | Mauna Kea Technologies | – | – |
| 70 kD FITC-labeled Dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | – |
| ImageCell software | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Calibration Kit | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco Life Tecchnologies | 41965-039 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B |
References
- Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model. J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).
- Passaniti, A., et al. A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor. Lab Invest. 67, 519-528 (1992).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49, 32-40 (2003).
- Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137, 4511-4513 (1996).
- Adini, A., et al. Matrigel cytometry: a novel method for quantifying angiogenesis in vivo. J Immunol Methods. 342, 78-81 (2009).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46, 6387-6392 (1986).
- Lindner, J. R. Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions. Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).
- Kuliszewski, M. A., et al. Molecular imaging of endothelial progenitor cell engraftment using contrast-enhanced ultrasound and targeted microbubbles. Cardiovasc Res. 83, 653-662 (2009).
- Stieger, S. M., et al. Ultrasound assessment of angiogenesis in a matrigel model in rats. Ultrasound Med Biol. 32, 673-681 (2006).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Segal, E., Satchi-Fainaro, R. Design and development of polymer conjugates as anti-angiogenic agents. Adv Drug Deliv Rev. 61, 1159-1176 (2009).
- Satchi-Fainaro, R., et al. Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors. PLoS One. 7, 44395 (2012).
