Abstract
وmatrigel تحت الجلد المكونات الفحص في الفئران هو الأسلوب المفضل لفي التقييم في الجسم الحي من العوامل المؤيدة والمضادة للعائية. في هذه الطريقة، يتم إدخال العوامل المطلوبة في السائل البارد ECM تقليد الجل الذي، بعد الحقن تحت الجلد، يتصلب لتشكيل بيئة محاكاة الوسط السرطان. هذه المصفوفة تسمح تغلغل الخلايا المضيفة، مثل الخلايا البطانية، وبالتالي، وتشكيل الأوعية الدموية.
وهنا نقترح تعديل مقايسة matrigel المكونات الجديدة التي يمكن استغلالها لتوضيح إمكانات عائية من مجموعة من العوامل التي يفرزها الخلايا السرطانية، بدلا من عامل معين (على سبيل المثال، bFGF وVEGF) أو وكيل. ويستخدم المكونات التي تحتوي على ECM تقليد هلام لتقديم المضيف (أي الماوس) مع مجموعة من العوامل يفرز إلى CM خلايا ورم أرومي دبقي مدرة للورم سريعة النمو. وصفناها سابقا المقارنة واسعة من إمكانيات عائية منU-87 MG ورم أرومي دبقي البشري واستنساخ لها نائمة المشتقة، في هذا النموذج نظام، والتي تبين الأوعية الدموية التي يسببها في U-87 خلايا MG الأبوية. تم إعداد CM من خلال تصفية وسائل الإعلام التي تم جمعها من لوحات زراعة الأنسجة متكدسة إما خط الخلية التالية 48 ساعة الحضانة. وبالتالي، فإنه يحتوي على العوامل الوحيدة التي يفرزها الخلايا، دون الخلايا نفسها. الموصوفة هنا هو مزيج من اثنين من طرائق التصوير، microbubbles محسنة النقيض التصوير بالموجات فوق الصوتية وحيوي داخلي-فيبيريد متحد البؤر endomicroscopy، لدقيقة، في الوقت الحقيقي توصيف ما، مورفولوجيا وظائف الأوعية الدموية التي شكلت حديثا داخل المقابس.
Introduction
ووصف الأوعية الدموية matrigel المكونات فحص أول مرة من قبل Kibbey وآخرون في عام 1992، حيث كان يستخدم لتقييم تحفيز الأوعية الدموية التي SIKVAV الببتيد (سر إيل-ليز-فال-علاء-فال) 1. وعلى النقيض من غيرها من فحوصات الأوعية الدموية في الجسم الحي، مثل الأوعية الدموية القرنية الماوس أو فرخ المقايسات غشاء سقائية مشيمائية، هذا الاختبار هو سهل نسبيا لأداء 2. قد تحتوي على حقن ECM تقليد هلام الخلايا، الموالية للعائية أو المركبات المضادة للعائية و / أو عوامل. عند تقييم نشاط مركب المضادة للعائية، والمكونات يحتوي عادة على مزيج من العوامل الوعائية البطانية النمو (VEGF)، وعامل نمو الخلايا الليفية (جمعية جيل المستقبل)، ويمكن أن تدار على مادة مضادة للعائية مباشرة في المكونات أو جهازيا 3، 4.
يتم حقن هلام ECM تقليد تحت الجلد حيث يتصلب في غضون دقائق. تقييم التوظيف الأوعية الدموية في قابس الناتج هو typicallذ يؤديها قياس مستويات الهيموغلوبين ضمن المكونات، من خلال قياس إشارة مضان بعد الحقن من ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) -labeled ديكستران، من خلال المناعية من أقسام علم الأنسجة لعلامات البطانية محددة أو عن طريق خلية مضان تنشيط الفرز (FACS) 2،5، 6. ومع ذلك، هذا التقييم يسمح فقط تحليل نقطة النهاية ويفتقر إلى المعلومات حول الوظائف ومورفولوجية الأوعية الدموية. وبالإضافة إلى ذلك، قياسات حجم البلازما، إما عن طريق مستويات الهيموجلوبين أو باستخدام ديكستران-FITC كمؤشر، قد تكون مضللة إذ يتأثر المحتوى الدم عن طريق حجم الأوعية الدموية ومدى البرك الراكدة من الدم. هذا أمر بالغ الأهمية خصوصا عندما يتميز الأوعية الدموية تجنيده من قبل نفاذية تعزيز والاستبقاء (EPR) تأثير 7.
نحن هنا اقتراح جديد أكثر دقة، طريقة لرؤية الأوعية الدموية تجنيدهم من خلال الجمع بين اثنين من طرائق التصوير التكميلية. HIGmicrobubbles ح-قرار تعزيز التباين الموجات فوق الصوتية (US) جنبا إلى جنب مع حيوي داخلي fibred-متحد البؤر endomicroscopy يمكن أن توفر المعلومات ليس فقط عن كثافة الأوعية الدموية، ولكن أيضا على التشكل والوظيفة. وعلاوة على ذلك، لا يمكن أن يؤديها هذا التحليل في عدة نقاط الوقت وبالتالي تمكين رصد حركية تكوين الأوعية الدموية. الولايات المتحدة هي طريقة التصوير المستخدمة على نطاق واسع التي تمتلك قرار مكانية عالية لتصوير الأوعية الدموية التالية في الوريد (IV) حقن microbubbles التي تبقى حصرا في مقصورة الأوعية الدموية 8-11. وmicrobubbles هم microbubbles مملوءة بالغاز التي تنتج إشارة مولد للصدى قوية عندما متحمس مع نبض الولايات المتحدة، وبالتالي تكون بمثابة عامل تباين جيد. يتم الحصول على صور 3D من المكونات باستخدام برنامج نظام التصوير الولايات المتحدة في أعقاب الدمار microbubbles. وتتكون الصور الناتجة عن إطارات صورة قبل وبعد التدمير من microbubbles ويعكس الاختلاف في كثافة الفيديو في اللون. هذه يغطىيتم عرض الصور تلقائيا من قبل البرنامج. ونتيجة لذلك، يمكن كميا في المئة من السفن وظيفية ضمن المكونات. عالية الدقة فيبيريد endomicroscopy متحد البؤر بمثابة طريقة التصوير التكميلية من خلال الإبلاغ عن الأوعية الدموية التشكل. في هذا الأسلوب مينيملي، يتم الحصول على الصور التالية الادارة الرابع من ديكستران FITC مترافق 12. البوليمر الفلورسنت الأصباغ مجرى الدم، وبالتالي بمثابة "عامل تباين" لالأوعية الدموية التشكل وتدفق الدم. وعلاوة على ذلك، منذ البوليمر حقن هو في حجم 70 كيلو دالتون، يمكن أن عبور السفن فقط راشح كما وجدت في ورم الأوعية الدموية. وهذا يؤدي إلى خلفية عالية من ديكستران FITC المسمى خارج الأوعية الدموية. ونتيجة لذلك، فيبيريد endomicroscopy متحد البؤر يمكن استخدامها لتصور الخصائص النموذجية للتأثير EPR في الورم neovasculature- الموسع، تتسرب منها المياه، والأوعية متشابكة للغاية، مع نهايات حادة.
تم descri هذا نموذج النظامالسرير في مقارنة بين إمكانات عائية من U-87 MG ورم أرومي دبقي البشري واستنساخ نائمة لها (13). تم تقييم الأوعية الدموية داخل المقابس ثلاثة أسابيع بعد ECM تقليد هلام التلقيح. وقد تبين أن الأوعية الدموية داخل المقابس التي تحتوي CM من U-87 MG تم زيادة الخلايا المولدة للورم كبير من حيث العدد والكثافة وظيفة، بالمقارنة مع الأوعية الدموية داخل المقابس التي تحتوي CM من الخلايا المولدة للورم نائمة سريعة النمو. وبالتالي، كانت قادرة على استنتاج أن CM معزولة من المؤلفين U-87 MG سريعة النمو الخلايا المولدة للورم يحتوي على مستويات أعلى من العوامل المؤيدة للعائية، مقارنة مع CM من الخلايا المولدة للورم نائمة. هذه العوامل تحفز تشكيل الأوعية الدموية وظيفية عن طريق التأثير إيجابيا جميع الخطوات من تتالي عائية (أي انتشار، تبرعم، والهجرة، وأخيرا، وتشكيل هياكل أنبوبية من الخلايا البطانية).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية ويؤديها في الامتثال للمعايير مدرسة جامعة تل أبيب ساكلر الطب المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC).
1. مكيفة تحضير الوسائط
- البذور 2 × 10 6 U-87 خلايا MG في لوحة الثقافة 10 سم في حجم 8 مل المتوسطة المعدلة النسر Dulbecco لفي (DMEM) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ محلول pencillin / الستربتومايسين / نيستاتين.
- احتضان خلايا في 37 ° C. 5٪ CO 2 حتى تحقيق confluency كامل في 48 ساعة.
- باستخدام حقنة 10 مل، سحب جميع المتوسطة من لوحة وتصفية من خلال 0.45 ميكرون مرشح في أنبوب 15 مل.
- بدون غسل لوحة الخلايا، إضافة 1 مل من محلول التربسين (0.25٪)، واحتضان.
- عندما يتم فصل كل الخلايا، وتعطيل التربسين باستخدام لا يقل عن 5 مل DMEM تستكمل مع 10٪ FBS والتشكيل على عدد خلايا.
- نقل CM إلى كوب دورق كروي والتركيز تحت فراغ عالية المبخر الدوار. من أجل تسريع عملية، وزيادة درجة حرارة الحمام إلى 37 درجة مئوية، إذا رغبت في ذلك. تستمر حتى يحقق CM الملمس تشبه عجينة.
- Resuspend وCM من كل لوحة الثقافة في 400 ميكرولتر المالحة. عند استخدام لوحة أكثر من واحد، استخدم حجم ما يعادلها. على سبيل المثال، لمدة 2 لوحات والثقافة، واستخدام 800 ميكرولتر. استخدام كل لوحة لمدة 4 الفئران.
- من أجل مقارنة خطوط مختلفة من الخلايا أو العلاج، وضبط حجم وفقا لنسبة الخلايا تلقيها في الخطوة 1.6. على سبيل المثال، إذا لوحة واحدة تحتوي 1.5X خلايا أكثر، إضافة 200 ميكرولتر من المياه المالحة إلى 400 ميكرولتر موجودة من قبل. وستكون هذه هي CM تعديل
ملاحظة: سيتم استخدامها في وقت لاحق من أجل تطبيع تركيز CM.
- قبل بتلقيح هلام-ECM تقليد في الفئران، وإعداد المواد التالية:
- -عوامل النمو خفضت خالية من الفينول ECM تقليد هلام (ذوبان الجليد بين عشية وضحاها، وقبل التجربة اليوم، في 4 درجات مئوية على الجليد).
- ماكينة حلاقة كهربائية.
- الكيتامين وزيلازين من أجل تخدير الفئران.
- الجليد الباردة 1،000 نصائح معقمة ميكرولتر.
- الجليد الباردة 1 مل حقنة و 27 الإبر G.
- إعداد لكل الماوس أنبوب 1.5 مل إيبندورف تحتوي على 80 ميكرولتر تعديل CM والحفاظ على الجليد.
- لكل أنبوب، إضافة 600 النمو العوامل الجليد الباردة ميكرولتر خفض-ECM تقليد هلام خالية من الفينول التي تم إذابة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، على الجليد. هلام-ECM تقليد هو السائل في 4 ° C ويتصلب في درجة حرارة الجسم. من أجل منع هلام ECM تقليد من ترسيخ، واستخدام الثلج الباردة 1،000 نصائح ميكرولتر. مزيج أنابيب بعناية دون تشكيل فقاعات والحفاظ على الجليد.
- تخدير 6 أسابيع من العمر BALB / ج الفئران باستخدام الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (12 ملغ / كلغ). تأكيد التخدير المناسبة وفقا للرعاية المؤسسية الحيوان واللجنة الاستخدام، أي قبل بداية التجربة. وقد وصلت الطائرة الحيوانات السليمة من التخدير عندما لم تعد تستجيب لقرصة اصبع القدم حازمة.
- حلق منطقة البطن من الفئران وتعقيم باستخدام فرك الجراحية / الكحول.
- استخدام الباردة 1 مل حقنة وإبرة 27 G لحقن محتويات الأنبوب تحت الجلد إيبندورف. إجراء الحقن ببطء شديد لمنع تشكيل فقاعة. مرة واحدة تدار كل حجم، لا إخراج الإبرة لعدة دقائق، حتى يحدث التصلب.
جل 3. تقييم ECM-تقليد التوصيل الأوعية الدموية باستخدام الموجات فوق الصوتية
ملاحظة: هذا جزء من بروتوكول تتطلب معرفة سابقة من تشغيل نظام التصوير بالموجات فوق الصوتية، أو المساعدة من فني المعتمدين لديها.
- قبل البدء، لديها والمواد والأدوات جاهزة ollowing:
- ماكينة حلاقة كهربائية.
- كريم مزيل الشعر.
- الكيتامين وزيلازين من أجل تخدير الفئران.
- microbubbles غير المستهدفة.
- جهاز التنشيط.
- نظام التصوير الولايات المتحدة بما في ذلك 55 ميغاهيرتز 708 التحقيق واكتساب مياداة مجهرية 3D.
- قياس الأوعية الدموية داخل المقابس ثلاثة أسابيع بعد التلقيح:
ملاحظة: في نموذج حيواني U-87 على أساس MG، تم العثور على 3 أسابيع لتمثيل نقطة زمنية مثالية للتصوير. ضمن إعدادات مختلفة، معايرة حركية الأوعية الدموية بدءا من بضعة أيام التالية التلقيح من المقابس.- تخدير الفئران باستخدام الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (12 ملغ / كلغ). تأكيد التخدير المناسبة وفقا للرعاية المؤسسية الحيوان واللجنة الاستخدام، أي قبل بداية التجربة. وقد وصلت الطائرة الحيوانات السليمة من التخدير عندما لم تعد تستجيب لقرصة اصبع القدم حازمة.
- حلقمنطقة البطن من الفئران وعلاج مع كريم مزيل الشعر.
- إصلاح الفئران supinely على مرحلة من مراحل مناور الصغيرة.
- باستخدام تحتوي على محلول ملحي 1 مل حقنة و 30 G الإبرة، ووضع إبرة داخل الوريد الذيل، وإصلاح الإبرة بحزم وتخفيف الحقنة.
- إعداد للدورة التباين 3D وضع الحصول على الصور:
- اضغط على "3D" لتهيئة مرحلة محرك 3D ووضع محول في منتصف منطقة المسح المطلوب.
- اضغط على "3D" وإدخال المسافة وخطوة تفحص حجم، ثم اضغط على "مسح".
- تأكد من أن المكونات بأكمله تم مسحها ضوئيا في بيانات الصورة 3D عرض. إن لم يكن، وضبط محول بحيث المكونات بأكمله مرئيا في مسح وكرر الخطوة 3.5.2.
- اضغط على "التباين"، ودفع تعويضات ربح الوقت (TGC) تسيطر على يسار لتلقي بظلالها على الصورة.
- تفعيل microbubbles باستخدام خلاط قارورة هذا هو ديسيgnated لتفعيل microbubbles لمدة 45 ثانية.
- خلط في حقنة 1 مل 50 ميكرولتر من microbubbles مع 50 ميكرولتر المالحة.
- استبدال حقنة تحتوي على محلول ملحي خففت مع حقنة تحتوي على microbubbles تفعيلها. حقن microbubbles المخفف في الوريد الذيل من الفئران، والانتظار بضع ثوان للفقاعات للوصول إلى حالة مستقرة، ومن ثم اكتساب 3D محسنة النقيض سينمائية حلقة من المكونات، وذلك باستخدام اقتناء السيارات 3D:
- اضغط على "3D" وحدد "مسح" للحصول على الصور محسنة النقيض 3D ثم اضغط على "مخزن سينمائية" لحفظ بيانات الصورة.
- اضغط على "3D" وانقر على "تدمير 3D" لتدمير لmicrobubbles.
- اضغط على "3D" مرة أخرى واختر "مسح" للحصول على مرحلة ما بعد التدمير سينمائية حلقة، ثم اضغط على "مخزن سينمائية".
- توليد تراكب إطارات الصور قبل وبعد التدمير من microbubbles:
- في &# 8220؛ إعدادات المرجعي "على الجانب الأيسر من الشاشة انقر فوق" إنشاء المرجع ".
- اضغط على "إدارة دراسة" لفتح سينمائية حلقة ما قبل تدمير المكتسبة.
- انقر على "سينما عملية" لتوليد تراكب النقيض الأخضر، ثم انقر فوق "تحميل إلى 3D".
- استخدام برامج التصوير الولايات المتحدة من أجل ل quantitate الناتج صورة 3D لحجم الدم داخل المقابس:
- اضغط على "المسح الضوئي / تجميد" ثم اضغط على "إعدادات الوضع".
- انقر على "حجم" وحدد "بالتوازي".
- إنشاء وحدة تخزين 3D من النسيج المستهدف وذلك بتجزئة سلسلة من المخططات.
- انقر على "إنهاء" لإكمال تجزئة.
ملاحظة: سيتم عرض حجم وكيل المقابل على الجانب الأيسر السفلي من الشاشة.
- في نهاية هذا الإجراء، وضع الفئران في الحارة ونظيفة جافة والبيئة وهادئة بعيدا عنغيرها من الحيوانات. توفير الدفء باستخدام المتاحة تجاريا سادة التدفئة الجراحية أو مصباح وهاج (50-75 واط)، وضعت 12-14 بوصة بعيدا عن القوارض. مراقبة الفئران مستمر حتى الحفاظ على تستقيم الموقف والمشي بشكل طبيعي.
4. تقييم ECM-تقليد جل التوصيل الأوعية الدموية الصرف عن طريق فيبيريد متحد البؤر Endomicroscopy
ملاحظة: هذا الجزء من البروتوكول يتم تنفيذ التصوير الولايات المتحدة في أعقاب فورا وأنها تتطلب معرفة سابقة من تشغيل نظام التصوير endomicroscopy متحد البؤر فيبيريد، أو المساعدة من فني المعتمدين لديها.
- قبل البدء، لديها المواد والأدوات جاهزة التالية:
- أدوات الجراحة مثل ملقط، مقص والمواضيع الخياطة للامتصاص.
- ديكستران مترافق FITC (70 كيلو دالتون).
- حلول المعايرة (ثلاثة أنابيب تحتوي كل منها على بيروكسيد الهيدروجين أو الماء أو محلول الفلورسنت).
- نظام التصوير وبحث مناسبة للتصوير الأوعية الدموية فقا للشركة المصنعة.
- تخدير الفئران باستخدام الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (12 ملغ / كلغ).
- إدارة الرابع، عن طريق الوريد الذيل، 200 ميكرولتر من 10 ملغ / مل ديكستران FITC المسمى.
- تطهير منطقة البطن باستخدام فرك الجراحية / الكحول وتطبيق شق صغير حوالي 1 سم من المكونات.
- ضع التحقيق endomicroscopy على رأس المكونات بلطف مع الحفاظ على المكونات سليمة.
- الاستحواذ:
- مرة واحدة يتم تعيين التحقيق على المكونات، اضغط على "بدء تشغيل الليزر" باستخدام دواسة القدم. يجب أن تظهر مضان على الشاشة.
- الحصول على أفلام قصيرة (تصل إلى 30 ثانية) عن طريق الضغط على 'سجل' على الشاشة أو 'اختر' باستخدام دواسة القدم.
- بين الأفلام، وغسل التحقيق عن طريق وضع طرف في أنبوب يحتوي على الماء.
- عند الانتهاء، إزالة التحقيق وتنظيف طرف مع طرف القطن.
- لتحليل متوسط هاءقطر SSEL:
- انقر على "كشف microvessels" أيقونة في لوحة العليا لفتح نافذة سفينة وحدة الكشف.
- انقر على "تفضيلات" وعلامة "يعني قطر السفينة" في "إحصاء المصالح" و "العرض الحانات الرسم البياني" في "عرض الوضع".
- انقر على "الكشف" لعرض قياسات محددة.
- لتحليل كثافة إشارة الفلورسنت في المناطق المتاخمة للالأوعية الدموية:
- انقر على "إنشاء دائرة ROI" في لوحة اليسرى وإنشاء دائرة في مجال الاهتمام.
- انقر على "المدرج ضمن حساب العائد على الاستثمار" لحساب القيم ذات الصلة لهذه المنطقة.
5. العلاج في مرحلة ما بعد الإجرائية للالفئران
- في نهاية كل إجراء التصوير، ووضع الفئران في الحارة ونظيفة جافة والبيئة وهادئة بعيدا عن الحيوانات الأخرى. توفير الدفء باستخدام تجاريا لتوفرة الجراحية سادة التدفئة أو مصباح وهاج (50-75 W)، وضعت في 12-14 بعيدا عن القوارض. مراقبة الفئران مستمر حتى الحفاظ على تستقيم الموقف والمشي بشكل طبيعي.
- لمزيد من التحليل من الأوعية الدموية المقابس "في نقاط زمنية إضافية، وتطبيق شروط الانتعاش التالية:
- خياطة شق صغير باستخدام الخيوط الجراحية للامتصاص.
- إعطاء تسكين الفئران مثل البوبرينورفين (1 ملغ / كلغ) تحت الجلد، والعودة إلى أقفاص الفردية.
- مراقبة جميع الحيوانات لتحديد ما إذا مزيد من العلاج المسكنة ضرورية وإعادة تقييم يوميا لرصد وتقييم للمحنة.
- في نهاية نقطة من التجربة، الموت ببطء الفئران عن طريق تطبيق أول الأيزوفلورين، تليها خلع عنق الرحم.
- إذا سوف يتم تنفيذها التصوير إضافية في الأسابيع التالية الخطوات التصوير الأولية، يجب أن تبقى كافة الإجراءات العقيمة بقدر الإمكان. ويجب أن يتم تنفيذ فرك الجلد الجراحي، وا معقموينبغي أن تستخدم ثالثا والقطن المعقم نصائح لتنظيف التحقيق endomicroscopy، ويجب تطهيرها التحقيق بين كل حيوان باستخدام الماء المعقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
زرع سدادات هلام ECM مع تقليد CM من النمو السريع عائية خط الخلية المولدة للورم U-87 MG، والنتائج في الأوعية الدموية واسعة النطاق. هذه الأوعية الدموية يمكن استكشافها على نطاق واسع باستخدام طريقتين التصوير التكميلية.
Microbubbles التصوير الولايات المتحدة تعزيز النقيض يكشف تجنيد واسعة من الأوعية الدموية وظيفية في المكونات التي توضح تدفق الدم واسعة النطاق داخل U-87 MG CM المقابس المحملة، في مقابل تدفق الدم لا يمكن الكشف عنها داخل المقابس التي تحتوي CM من الخلايا المولدة للورم نائمة (الشكل 1) .
وشدد على التشكل من هذه الأوعية الدموية التي شكلت حديثا من قبل فيبيريد endomicroscopy متحد البؤر (الشكل 2). الأوعية الدموية داخل المقابس محملة U-87 MG CM أظهرت مورفولوجيا نموذجية لنفاذية تعزيز والاستبقاء (EPR) تأثير لالجزيئات مثل ديكستران-FITC في 70 كيلو دالتون حجم المستخدمة هنا. جرى توسيع الأوعية الدموية وللغاية تا ngled، مع تدفق غير المستمر والبطيء (الشكل 2A، C). أيضا، وقد لوحظ تسرب الدم إلى البيئة المحيطة، كما يتضح من إشارة الفلورسنت عالية خارج الأوعية الدموية (الشكل 2B).
الشكل 1: Microbubbles التباين تعزيز التصوير الولايات المتحدة بعد الوريد من microbubbles وتدميرها، U-87 MG CM تحتوي على شمعات المعرض زيادة الأوعية الدموية (باللون الأخضر). واستخدمت المقابس التي تحتوي CM من U-87 الخلايا المولدة للورم نائمة المستمدة MG عن السيطرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
"SRC =" / الملفات / ftp_upload / 51525 / 51525fig2highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الشكل 2: الألياف متحد البؤر التصوير المجهري. (A) إدارة الوريد من 70 كيلو دالتون ديكستران-FITC، يمكن تصور تدفق الدم والأوعية الدموية التشكل. U-87 MG CM تحتوي على شمعات الأوعية الدموية تتكون من راشح والأوعية موسعة مع يتثلم ينتهي. وعرضت الأوعية الدموية تسرب من إشارة الفلورسنت خارج الأوعية الدموية. تم استخدام الأوعية الدموية العادية في الماوس البطن عن السيطرة. (ب) كثافة إشارة فلوري في المناطق المتاخمة للالأوعية الدموية. ويتمثل إشارة الفلورسنت من قبل مجموعة من الأحمر إلى الأبيض. الأحمر الداكن يمثل انخفاض كثافة إشارة، في حين يمثل اللون الأبيض إشارة الفلورسنت عالية. U-87 MG CM تحتوي على شمعات تظهر إشارة واضحة الفلورسنت خارج الأوعية، في حين يظهر أي إشارة خارج الأوعية العادية. (C) يعني سفينة القطر (MVD) من الأوعية الدموية داخل U-87 MG CM تحتوي على المقابس (22.4 ميكرون) هو الهامة فيntly أعلى بالمقارنة مع MVD السفن العادية (6.7 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الجمع بين أساليب التصوير التكميلية يسمح تحصيل معلومات عن microvessel كثافة، وظائف الأوعية الدموية مكونات مختلفة "والتشكل. CM تحميل على المقابس هلام ECM تقليد يولد المكروية الورم، التي لا يفصلها عن السكان الخلية الأخرى، مثل الخلايا البطانية، أن يتم تجنيد ويتسرب إلى المكونات.
عن طريق أداء، في موازاة ذلك، microbubbles محسنة النقيض التصوير الولايات المتحدة وفيبيريد التصوير endomicroscopy متحد البؤر، يمكننا أن نستنتج أن مجموعة من العوامل التي يفرزها الأورام عائية سريعة النمو توليد الخلايا، دون الخلايا السرطانية نفسها، لا يمكن توظيف فقط الأوعية الدموية، ولكن كما تشكل الأوعية الدموية وظيفية مع الخصائص النموذجية الثوري. وعلاوة على ذلك، وهذا الأسلوب يسمح للفصل بين تأثير العوامل يفرز والتفاعل خلية الى خلية في الورم المكروية.
المعلومات التي تم الحصول عليها من الولايات المتحدة وفيبيريد متحد البؤرومع ذلك يتعرض endomicroscopy إلى الحد من تقنية التصوير. على سبيل المثال، في حين باستخدام التصوير endomicroscopy متحد البؤر فيبيريد، فإنه من المستحيل أن صورة سفينة واحدة محددة الدم مع مرور الوقت، أو حتى نفس المنطقة في سد العجز.
هلام المكونات فحص-ECM تقليد من السهل نسبيا على القيام بها، وهذا هو مستمر عند تحميل CM مع هلام ECM تقليد. ومع ذلك، فإن المسألة الحاسمة التي ينبغي اتخاذها قيد النظر هي CM إلى ECM تقليد هلام نسبة. كميات كبيرة من CM قد تمنع هلام ECM تقليد من ترسيخ. لذلك، يجب أن لا تتجاوز كمية CM ما يقرب من 13٪ من هلام ECM تقليد.
هذه الطريقة يمكن تعديلها لالنظم التجريبية والتطبيقات المختلفة. على سبيل المثال، يمكن استخدامه لتقييم الأدوية المضادة للعائية من قبل CM تحميل من الخلايا ما قبل وبعد المعالجة. أيضا، يمكن استخدام خطوط الخلايا الأخرى تحت هذه الإعدادات التجربة. ومع ذلك، لا بد من معايرة من أجل لبتقديم طلب تركيز CM الأمثل. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن يكون الأمثل في نقطة زمنية مثالية للتصوير وفقا لكل نظام نموذجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotary Vacuum Evaporator | - | - | - |
| Growth-factors reduced phenol-free Matrigel | BD Bioscience | FAL356231 | Thaw overnight, at 4 °C on ice |
| Depilatory cream | - | - | - |
| Vevo2100 US imaging system | VisualSonics Inc. | - | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| 55 MHz 708 probe | VisualSonics Inc. | - | - |
| Vevo2100 imaging software | VisualSonics Inc. | - | - |
| VialMix | DEFINITY Imaging | VMIX | - |
| DEFINITY microbubbles | DEFINITY Imaging | DE4 | Activate for 45 sec using VialMix before use |
| CellVizio (Fibered confocal endomicroscope) | Mauna Kea Technologies | - | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| ProFlex MiniO/30 probe | Mauna Kea Technologies | - | - |
| 70 kD FITC-labeled dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | - |
| ImageCell software | Mauna Kea Technologies | - | - |
| Calibration Kit | Mauna Kea Technologies | - | - |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco Life Tecchnologies | 41965-039 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Penicillin/streptomycin/nystatin solution | Biological Industries | 03-032-1B |
References
- Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model. J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).
- Passaniti, A., et al. A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor. Lab Invest. 67, 519-528 (1992).
- Norrby, K.
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49, 32-40 (2003).
- Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137, 4511-4513 (1996).
- Adini, A., et al. Matrigel cytometry: a novel method for quantifying angiogenesis in vivo. J Immunol Methods. 342, 78-81 (2009).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46, 6387-6392 (1986).
- Lindner, J. R. Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions. Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).
- Kuliszewski, M. A., et al. Molecular imaging of endothelial progenitor cell engraftment using contrast-enhanced ultrasound and targeted microbubbles. Cardiovasc Res. 83, 653-662 (2009).
- Stieger, S. M., et al. Ultrasound assessment of angiogenesis in a matrigel model in rats. Ultrasound Med Biol. 32, 673-681 (2006).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Segal, E., Satchi-Fainaro, R. Design and development of polymer conjugates as anti-angiogenic agents. Adv Drug Deliv Rev. 61, 1159-1176 (2009).
- Satchi-Fainaro, R., et al. Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors. PLoS One. 7, 44395 (2012).
