Abstract
マウスの皮下マトリゲルプラグアッセイは、プロ及び抗血管新生因子のインビボ評価のために選択される方法である。この方法では、所望の因子を皮下注射した後、癌の環境を模倣する環境を形成するために固化し、冷液体ECM模倣ゲルに導入される。このマトリックスは、内皮細胞、および血管系の、したがって、形成などの宿主細胞の浸透を可能にする。
本明細書において、我々は、特定の因子（ 例えば、bFGFおよびVEGF）または薬剤とは対照的に、癌細胞によって分泌される因子のプールの血管新生可能性を例示するために利用することができる新たな変更されたマトリゲルプラグアッセイを、提案する。 ECM-模倣ゲルを含むプラグは急速に成長する腫瘍を発生する神経膠芽腫細胞のCMに分泌因子のプールでホスト（ すなわち、マウス）を導入するために利用されている。我々は以前の血管新生能の大規模な比較を記載しているU-87 MG親細胞で誘導される血管新生を示すこのシステムモデルでU-87 MGヒト神経膠芽とその休眠由来のクローン、、。 CMは、48時間のインキュベーション後の細胞株のいずれかのコンフルエントな組織培養プレートから収集媒体を濾過することによって調製される。それゆえ、細胞自体ない細胞によって分泌因子のみを含有する。ここで説明する二つのイメージングモダリティの組み合わせである、プラグ内の新たに形成された血管の大きさ、形態及び機能の正確なリアルタイムの特性解析のために、造影超音波イメージングと生体繊維質共焦点内視をマイクロバブル。
Introduction
マトリゲルプラグ血管形成アッセイは、最初Kibbey らにより記載された。それは、ペプチドSIKVAV（のSer-イルリジンヴァルのAla-ヴァル、1）血管新生刺激を評価するために使用された1992年。他のin vivo血管新生アッセイとは対照的に、マウス角膜血管新生またはニワトリ絨毛尿膜アッセイのように、このアッセイは、2を実行することは比較的容易である。注入されたECM模倣ゲルは細胞が、血管新生促進または抗血管新生化合物および/または因子を含んでいてもよい。抗血管新生化合物の活性を評価する場合、プラグは、通常、血管内皮増殖因子（VEGF）および線維芽細胞増殖因子（FGF）の混合物を含み、抗血管新生物質が、プラグに直接投与または全身3ことができる4。
それは数分以内に固化する場合ECM模倣ゲルを皮下注射する。その結果、プラグの血管のリクルートの評価はtypicallですyは、フルオレセインイソチオシアネートの注射（FITC）以下蛍光シグナル測定により、プラグ内のヘモグロビンレベルを測定することによって行わは、内皮特異的マーカーの組織学的切片の免疫染色により、または蛍光活性化細胞選別（FACS）2,5により、デキストランを標識6。しかし、この評価は、エンドポイント分析を可能にし、血管の機能および形態学に関する情報を欠いている。血液量は、血管の大きさ、血液の停滞プールの程度によって影響されるので、また、血漿量の測定は、ヘモグロビンレベル、または指標としてデキストランFITCのいずれかを使用して、誤解を招くかもしれない。動員、血管系の透過性が向上し、保持（EPR）効果7によって特徴付けられる場合に特に重要である。
我々は、ここで二つの相補的なイメージングモダリティを組み合わせることによって動員、血管の可視化のための新たな、より正確な、方法を提案する。 HIG血管密度は約だけでなく、その形態および機能だけでなく情報を提供することができる生体fibred共焦点内視と組み合わさ時間分解能のマイクロバブルコントラスト増強超音波（US）。さらに、この分析は、それによって血管新生動態のモニタリングを可能にするいくつかの時点で行うことができる。米国は、血管区画8-11に独占的に残っているマイクロバブルの静脈内（IV）注射後の血管の画像化のための高空間分解能を持って広く利用されている画像診断法である。マイクロバブルは、米国のパルスで励起し、良好な造影剤として作用するとき、強いエコー源信号を生成するガス充填マイクロバブルである。プラグの3D画像は、マイクロバブルの破壊以下の米国イメージングシステムソフトウェアを使用して取得される。得られた画像は、マイクロバブルの前後の破壊の画像フレームから構成され、色の映像強度の差を反映している。これらのオーバーレイ画像は自動的にソフトウェアによって表示されます。したがって、プラグ内の機能血管の割合を定量することができる。共焦点内視繊維質の高解像度は、血管の形態の報告による補完的なイメージングモダリティとして機能します。この低侵襲性の方法では、画像は、FITC結合デキストラン12の静脈内投与後に取得される。蛍光ポリマーは、血流を染色し、従って、血管の形態及び血流のための「造影剤」として機能する。注入されたポリマーは、70キロダルトンの大きさであるので、腫瘍脈管構造に見られるようにまた、それだけで漏れやすい血管を通過することができる。これは、血管外のFITC標識デキストランの高いバックグラウンドをもたらす。その結果、繊維質の共焦点内視はneovasculature-腫瘍に平滑末端を有する拡大された、漏出、高もつれ血管を、EPR効果の典型的な特徴を視覚化するために使用することができる。
このシステムモデルはdescriたU-87 MGヒト神経膠芽とその休眠クローン13の血管新生能の比較でベッド。プラグ内の血管新生は、3週間ECM-模倣ゲル接種後に評価した。これは、休止中の腫瘍生成細胞からのCMを含むプラグ内の血管新生と比較した場合、U-87 MG急成長している腫瘍生成細胞からのCMを含むプラグ内の血管新生が著しく、数、密度および機能性の面で増加したことが示された。したがって、著者らは、CMがU-87 MG急成長している腫瘍を発生する細胞から単離されたが、休眠腫瘍生成細胞からのCMと比較して、血管新生促進因子のより高いレベルが含まれていると結論することができました。これらの要因は、積極的に、血管新生カスケード（ すなわち 、増殖、発芽、遊走および内皮細胞の管状構造の最後に、形成）のすべてのステップに影響を与えることによって、機能的な血管の形成を刺激する。
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Protocol
注：すべての動物の手順は承認され、医学施設内動物管理使用委員会（IACUC）のテルアビブ大学サックラー学校の基準に準拠して実施した。
1.馴化培地調製
- シード2×10 8の体積が10cm培養皿6 U-87 MG細胞に加え、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン/ナイスタチン溶液を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）。
- 37で細胞を培養する C°、 48時間で完全フルエンシーを達成するまで、5％のCO 2。
- 10ミリリットル注射器を用いて、プレートからすべてのメディアを撤回し、15ミリリットルチューブに0.45μmのフィルターでろ過する。
- 細胞プレートを洗浄せずに1mlのトリプシン溶液（0.25％）を添加し、インキュベートする。
- すべての細胞が剥離されると、10％FBSを補充した、少なくとも5ミリリットルDMEMを使用してトリプシンを不活性化し、細胞数をリフォーム。
- ガラス丸底フラスコにCMを移し、高真空ロータリーエバポレーター下で濃縮する。必要に応じてプロセスを促進するために、37℃までの浴温度を上昇させる。 CMはペースト状のテクスチャーを達成するまで続けます。
- 400μlの生理食塩水に各培養プレートからCMを懸濁します。複数のプレートを使用する場合は、同等のボリュームを使用。たとえば、2培養プレートのために、800μlのを使用しています。 4匹のマウスのために、各プレートを使用。
- 異なる細胞株または治療を比較するために、ステップ1.6において、受信したセルの比率に応じて音量を調整する。一方のプレートは、1.5倍以上のセルが含まれている場合は、既存の400μlに生理食塩水を200μlを追加します。これが調整され、CMになります
注：これは、CMの濃度を正規化するために後で使用される。
- マウスにECM-模倣ゲルを接種する前に、以下の材料を準備します。
- 成長因子は、（氷上で4℃で、実験の前日、一晩解凍）フェノールフリーECM-模倣ゲルを減少させた。
- 電気シェーバー。
- マウスを麻酔するために、ケタミンとキシラジン。
- 氷のように冷たい千μlの滅菌チップ。
- 氷のように冷たい1ミリリットルの注射器と27 G針。
- 各マウスについて80μlの調整されたCMを含む1.5mlのエッペンドルフチューブを準備し、氷上に保つ。
- 各チューブに、氷の上で、4℃で一晩解凍したフェノールフリーECM-模倣ゲルを減少させた600μlの氷冷成長因子を追加します。 ECM模倣ゲルを4℃で液体であり、体温で固化する。固化からECM-模倣ゲルを防ぐために、氷冷千μlのヒントを使用しています。慎重に気泡を形成することなく、チューブを混合し、氷上に保つ。
- 6週齢のBを麻酔ケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（12 mg / kgを）を使用して、ALB / cマウス。実験前を開始する制度的動物のケアと使用委員会、 すなわちに応じた適切な麻酔を確認してください。彼らはもはやしっかりとつま先のピンチに反応しないときに動物は麻酔のそれらの適切な面に達している。
- マウスの腹部を剃ると手術スクラブ/アルコールを使用して消毒する。
- エッペンドルフチューブ皮下の内容を注入するためにコールド1mlシリンジおよび27Gのニードルを使用する。気泡の形成を防止するために、非常にゆっくりと注入を行う。すべてのボリュームが投与されると凝固が発生するまで、数分間針を吐出しない。
超音波を用いてECM-模倣ゲルプラグ血管新生の3。評価
注：プロトコルのこの部分は、以前の超音波撮像システムを動作させる知識、または許可された技術者の援助を必要とする。
- 開始する前に、Fを持って準備材料や楽器をollowing：
- 電気シェーバー。
- 脱毛クリーム。
- マウスを麻酔するために、ケタミンとキシラジン。
- 非標的マイクロバブル。
- 活性化装置。
- 55 MHzの708プローブと3D取得マイクロマニピュレーターを含む米国のイメージングシステム。
- プラグは接種後3週間以内に血管新生を測定します。
NOTE：U-87 MGベース動物モデルにおいて、3週間、撮像のための理想的な時間点を表すことが分かった。異なる設定の下では、プラグの接種後数日から始まる血管新生動態を校正。- ケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（12 mg / kgを）を使用してマウスを麻酔。実験前を開始する制度的動物のケアと使用委員会、 すなわちに応じた適切な麻酔を確認してください。彼らはもはやしっかりとつま先のピンチに反応しないときに動物は麻酔のそれらの適切な面に達している。
- 剃るマウスの腹部領域とは、脱毛クリームで処理。
- マイクロマニピュレータのステージ上で仰向けマウスを修正。
- 生理食塩水と30 Gの針を含む1mlの注射器を使用して、尾静脈の中に針を置き、しっかりと針を固定し、注射器を緩めます。
- コントラスト3Dモード画像取得セッションのために設定する：
- 3Dモータステージを初期化し、所望の走査領域の中央にトランスデューサを配置するプレス「3D」。
- を押し「3D」と入力スキャン距離とステップサイズは、その後「スキャン」を押してください。
- 全体プラグが表示された3D画像データに走査されたことを確認してください。しない場合は全体プラグはスキャン繰り返しステップ3.5.2で表示されるように、トランスデューサを調整します。
- を押し、「コントラスト」と時間をプッシュ利得補償（TGC）は、画像を暗くするために左に制御します。
- 指名打者であるバイアルミキサーを使用して、マイクロバブルをアクティブに45秒間のマイクロバブルの活性化のためにgnated。
- 1ミリリットルを50μlの生理食塩水でマイクロバブルを50μl注射器に混ぜる。
- 活性化したマイクロバブルを含むシリンジに生理食塩含有緩めた注射器を交換してください。 3D取得モータを用い、定常状態に達し、その後、プラグの3次元造影シネループを取得するために、気泡のために数秒待ってから、マウスの尾静脈に希釈されたマイクロバブルを注入する。
- を押し「3D」とは、3次元造影画像を取得した後、画像データを保存するために「シネストア」を押して「スキャン」を選択します。
- を押し「3D」とマイクロバブルを破壊するために "破壊3D」をクリックします。
- を押し「3D」再びと「シネストア」を押し、ポスト破壊のシネ·ループを取得するために「スキャン」を選択します。
- 前とマイクロバブルの後の破壊オーバーレイ画像フレームを生成します。
- ＆で＃8220;参照設定」参照を作成」画面の左側には、クリックして "。
- プレス「検査管理は、「取得し、事前破壊シネループを開きます。
- 緑のコントラストオーバーレイを生成するために、「プロセスシネ」をクリックし、「3Dにロードする」をクリックします。
- プラグ内の血液量の結果の3D画像を定量するために、米国のイメージングソフトウェアを使用します。
- プレス「スキャン/フリーズ "とし、「モードの設定」を押してください。
- 「ボリューム」をクリックして、「パラレル」を選択します。
- 輪郭の一連のセグメント化することによって、標的組織の3Dボリュームを作成する。
- セグメンテーションを完了するには「完了」をクリックします。
NOTE：造影剤の体積は、画面の左下に表示される。
- 手順の最後に、離れてから暖かい、きれいな、乾燥した、静かな環境でマウスを置く他の動物。齧歯類から12〜14インチ離れて配置された市販の外科加熱パッドや白熱灯（50〜75ワット）を使用して暖かさを提供します。直立姿勢を維持し、正常に歩行するまで継続的にマウスを監視します。
繊維質共焦点内視顕微鏡を使用して、4の評価ECM-模倣ゲルプラグ血管系モルフォロジー
注：プロトコルのこの部分は、直ちに次のUS画像化を行い、それが繊維質の共焦点内視撮像システム、または認定技術者の援助を操作する前の知識を必要とする。
- 開始する前に、以下の材料および機器の準備があります。
- 鉗子、はさみや吸収性縫合糸のような手術ツール。
- FITC結合デキストラン（70 kDa）の。
- 校正溶液（過酸化水素、水又は蛍光溶液を含む3本のチューブそれぞれ）。
- 撮像システムであり、aメーカーによると、血管のイメージングに適したプローブ。
- ケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（12 mg / kgを）を使用してマウスを麻酔。
- 、尾静脈を介して、10mg / mlのFITC標識デキストラン200μlの静脈内投与。
- 外科スクラブ/アルコールを使用して腹部を消毒し、プラグから約1cmの小切開を適用します。
- そのままプラグを保ちながら優しくプラグの上に内視顕微鏡プローブを配置します。
- 買収：
- プローブは、プラグ上に設定されたら、Enterキーを押してフットペダルを使用した「レーザーを開始します」。蛍光は、画面に表示されるべきである。
- 画面上の「録音」を押すことで（30秒まで）ショートムービーを取得またはフットペダルを使用して「選択」。
- ムービー間、水を含むチューブにチップを置くことによって、プローブを洗う。
- 終了したら、プローブを除去し、綿の先端が先端部を清掃してください。
- 分析するには、平均VEのSSEL径：
- 血管検出モジュール]ウィンドウを開き、上部のパネルに「微小血管の検出」アイコンをクリックします。
- 「環境設定」をクリックして、「目的の統計」と「表示モード」の「ディスプレイヒストグラムバー」の「血管径平均」マーク。
- 選択した測定値を表示するには、「検出」をクリックしてください。
- 血管に隣接する領域での蛍光シグナル強度を分析する。
- 左側のパネルで「円のROIを作成」をクリックして、関心領域の円を作成します。
- この地域に関連する値を計算するために「ROI内の計算ヒストグラム」をクリックしてください。
マウスの5。術後の治療
- 各撮像手順の最後に、離れて他の動物から暖かい、きれいな、乾燥した、静かな環境でマウスを置く。市販-Aを使用して暖かさを提供しますvailable外科加熱パッドや白熱灯（50〜75 W）は、齧歯類から離れに12-14を置いた。直立姿勢を維持し、正常に歩行するまで継続的にマウスを監視します。
- 追加の時点でのプラグ「血管新生のさらなる分析のために、次の回復条件を適用する。
- 吸収性縫合糸を使用した小切開を縫合。
- そのような皮下にブプレノルフィン（1 mg / kgを）として、マウスの鎮痛を与え、個々のケージに戻す。
- さらに鎮痛剤治療が必要であり、毎日の再評価を監視し、苦痛のために評価するかどうかを判断するために、すべての動物を観察します。
- 実験のエンドポイントで、最初の頸椎脱臼が続くイソフルランを適用することにより、マウスを安楽死させる。
- 追加の画像は、初期画像化手順以下の数週間で実行される場合は、すべての手順は、可能な限り無菌に保つ必要があります。外科、皮膚のスクラブ実行する必要があり、無菌のWAターおよび滅菌綿チップは内視プローブを洗浄するために使用されるべきであり、プローブは滅菌水を使用して、各動物の間に消毒されるべきである。
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Representative Results
豊富な血管新生の結果は、急成長中の血管新生腫瘍生成細胞株U-87 MGからCMとECM-模倣ゲルプラグを注入する。この血管系は広く二つの相補的なイメージング法を用いて探索することができる。
マイクロバブル造影USイメージングは、U-87 MG CMロードされたプラグは、休眠腫瘍発生細胞からのCMを含むプラグ内で検出不可能な血流とは対照的に（ 図1）内の豊富な血液の流れを説明することにより、プラグに機能的な血管の広範な採用を明らかにする。
これらの新しく形成された血管の形態は、繊維質の共焦点内視（ 図2）によって強調されている。 U-87 MG CMにロードされたプラグ内の血管は、ここで使用される70 kDaのサイズでのこのようなデキストランFITCなどの巨大分子のための強化された透過性および保持（EPR）効果の典型的な形態を示した。血管が拡大し、高タた非連続と低迷流れngled、（ 図2A、C）。血管（ 図2B）外側高い蛍光シグナルによって示されるように、また、血液の漏出は、周囲の環境に観察された。
図1：マイクロバブル造影米国イメージング静脈内マイクロバブルの管理とその破壊の後、プラグの展示を含むU-87 MG CMが（緑色）血管新生を増加させた。。 U-87 MG由来休眠腫瘍生成細胞からのCMを含むプラグをコントロールとして使用した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図2：光共焦点顕微鏡像。 （A）70 KDaのデキストランFITCの静脈内投与は、血流および血管形態の可視化を可能にする。プラグ血管系を含むU-87 MG CMが鈍く末端を有するリーキー、拡大された船舶で構成されています。血管は漏れは血管系外の蛍光シグナルによって示されている。マウスの腹部における正常血管系を対照として使用した。血管に隣接する領域における（B）蛍光信号強度。蛍光シグナルは、赤から白へのスペクトルによって例示される。白は高い蛍光シグナルを表す暗赤色は、低い信号強度を表す。シグナルが正常血管の外に示されていない状態で、プラグを含むU-87 MGのCMは、血管外に透明な蛍光シグナルを示す。（C）平均血管直径（MVD）血管のプラグを含むU-87 MGのCM（22.4ミクロン）の範囲内であるsignificantly高い正常血管（6.7ミクロン）のMVDに比べて。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
補完的なイメージング法を組み合わせることにより、異なる血管新生コンポーネントの微小血管密度、機能性と形態学上の情報の取得を可能にする。 ECM-模倣ゲルプラグ上のローディングCMは、プラグに募集し、浸出された内皮細胞のように、他の細胞集団から分離され、腫瘍の微小環境を生成します。
行うことにより、並行して、造影USイメージングをマイクロバブル、共焦点内視イメージングを繊維質、我々は癌細胞自体なしで、できるだけでなく、血管を補充するが、急成長している血管新生腫瘍により分泌された因子のプールの細胞を生成すると結論付けることができるまたEPR典型的な特徴を有する機能血管系を形成する。さらに、この方法は、腫瘍の微小環境における分泌因子の影響と細胞間相互作用の分離を可能にする。
情報米国から得られ、共焦点繊維質内視しかしながらイメージング技術の制限を受ける。例えば、繊維質の共焦点内視イメージングを使用しながら、時間にわたって単一の特定の血管像に不可能、またはプラグであっても同じ面積である。
ECM模倣ゲルプラグアッセイを実行するのが比較的容易であり、かつECM模倣ゲルCMをロードするときにこれが維持される。しかし、検討中の注意が必要です重要な問題は、ECM-模倣ゲル割合にCMである。 CMの高いボリュームが固化からECM-模倣ゲルを防ぐことがあります。そのため、CMの量がECM-模倣ゲルの約13％を超えてはならない。
この方法は、異なる実験的なシステムやアプリケーションのために調整することができる。例えば、前後の処理された細胞からのCMをロードすることによって、抗血管形成薬を評価するために用いることができる。また、他の細胞株は、これらの実験設定で使用してもよい。ただし、キャリブレーションのような目的のためには必要とされる最適なCM濃度をpply。また、撮像のための理想的な時点は、各モデルシステムに応じて最適化されるべきである。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotary Vacuum Evaporator | - | - | - |
| Growth-factors reduced phenol-free Matrigel | BD Bioscience | FAL356231 | Thaw overnight, at 4 °C on ice |
| Depilatory cream | - | - | - |
| Vevo2100 US imaging system | VisualSonics Inc. | - | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| 55 MHz 708 probe | VisualSonics Inc. | - | - |
| Vevo2100 imaging software | VisualSonics Inc. | - | - |
| VialMix | DEFINITY Imaging | VMIX | - |
| DEFINITY microbubbles | DEFINITY Imaging | DE4 | Activate for 45 sec using VialMix before use |
| CellVizio (Fibered confocal endomicroscope) | Mauna Kea Technologies | - | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| ProFlex MiniO/30 probe | Mauna Kea Technologies | - | - |
| 70 kD FITC-labeled dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | - |
| ImageCell software | Mauna Kea Technologies | - | - |
| Calibration Kit | Mauna Kea Technologies | - | - |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco Life Tecchnologies | 41965-039 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Penicillin/streptomycin/nystatin solution | Biological Industries | 03-032-1B |
References
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