Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

פונקציונליות ניטור ומורפולוגיה של כלי דם גויס על ידי גורמים מופרשים על ידי תאים מניבי גידול בצמיחה מהיר

Published: November 23, 2014 doi: 10.3791/51525
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Physiology and Pharmacology, Sackler School of Medicine, Tel Aviv University
* These authors contributed equally

Abstract

Assay תקע matrigel תת-עורי בעכברים הוא שיטת הבחירה להערכת in vivo של גורמים פרו ואנטי-angiogenic. בשיטה זו, גורמים רצויים מוכנסים ג'ל ECM-לחקות קר-הנוזלי ש, לאחר הזרקה תת עורית, מתמצק ליצירת סביבה מחקה את הסביבה בסרטן. מטריצה ​​זו מאפשרת החדירה של תאי מארח, כגון תאי אנדותל, ולכן, ההיווצרות של כלי דם.

במסמך זה אנו מציעים בדיקה חדשה ששונתה תקע matrigel, אשר יכול להיות מנוצלת כדי להמחיש את פוטנציאל angiogenic של בריכה של גורמים המופרשים על ידי תאי סרטן, בניגוד לגורם ספציפי (למשל, bFGF וVEGF) או סוכן. התקע המכיל ג'ל ECM-לחקות מנוצל כדי להציג את המארח (כלומר, עכבר) עם בריכה של גורמים המופרשים לCM של תאי גליובלסטומה מניב גידול בצמיחה מהירה. שתארנו השוואה מקיפה של פוטנציאל angiogenic של עברגליובלסטומה U-87 MG אדם והשיבוט הנגזר הרדום שלה, במודל מערכת זו, המציגה אנגיוגנזה המושרית בU-87 התאים MG ההורים. CM הוא הוכן על ידי סינון תקשורת שנאספו מצלחות תרבית רקמה ומחוברות של שני שורות תאים הבאים דגירה 48 שעות. מכאן, שהוא מכיל גורמים היחידים המופרשים על ידי התאים, ללא התאים עצמם. שתוארה כאן הוא השילוב של שתי שיטות הדמיה, microbubbles הדמיה אולטרסאונד חומר ניגוד וendomicroscopy fibered-confocal intravital, לאפיון מדויק, בזמן אמת של המידה, המורפולוגיה ופונקציונליות של כלי דם חדש שיוקמו בתוך התקעים.

Introduction

Assay אנגיוגנזה תקע matrigel תואר לראשונה על ידי Kibbey et al. בשנת 1992, שבו הוא משמש להערכת גירוי אנגיוגנזה ידי SIKVAV פפטיד (Ser-איל-ליס-Val-עלא-Val) 1. בניגוד למבחני אנגיוגנזה אחרים in vivo, כמו אנגיוגנזה קרנית העכבר או מבחני קרום chorioallantoic חומוס, assay זה הוא קל יחסית לביצוע 2. ג'ל ECM-לחקות המוזרק עלול להכיל תאים, פרו-angiogenic או תרכובות ו / או גורמים אנטי-angiogenic. כאשר אנו מעריכים את הפעילות של תרכובת אנטי angiogenic, התקע בדרך כלל מכיל תערובת של גורם כלי דם האנדותל צמיחה (VEGF) וגורם גדילה פיברובלסטים (FGF), והחומר אנטי-angiogenic יכול להינתן ישירות לתקע או מערכתי 3, 4.

ג'ל ECM-לחקות מוזרק מתחת לעור שבו הוא מתקשה תוך דקות. הערכה של גיוס כלי דם בתקע וכתוצאה מכך היא typically מבוצע על ידי מדידת רמות המוגלובין בתוך התקע, על ידי מדידת אותות הקרינה לאחר ההזרקה של isothiocyanate והעמסת (FITC), שכותרת dextran, על ידי immunostaining סעיפים היסטולוגיה לסמנים האנדותל ספציפי או על ידי תא הקרינה המופעל מיון (FACS) 2,5, 6. עם זאת, הערכה זו מאפשרת רק ניתוח נקודת סיום וחסר מידע על פונקציונלי והמורפולוגיה של כלי דם. בנוסף, מדידות של נפח פלזמה, בין אם על ידי רמות המוגלובין או באמצעות dextran-FITC כאינדיקטור, עלולה להטעות שכן תוכן דם מושפע מגודלם של כלי דם ומידת ברכות עומדות של דם. זה חיוני במיוחד כאשר כלי הדם גויס מאופיין בחדירות המשופרות והשפעת ההחזקה (EPR) 7.

אנו מציעים במסמך זה, שיטה חדשה, מדויקת יותר להדמיה של כלי הדם גויסו על ידי שילוב של שתי שיטות הדמיה משלימות. HIGmicrobubbles הרזולוציה h אולטרסאונד בניגוד משופר (ארה"ב) בשילוב עם fibred-confocal endomicroscopy intravital יכול לספק מידע לא רק על צפיפות כלי דם, אלא גם על המורפולוגיה והפונקציונליות שלהם. יתר על כן, ניתוח זה יכול להתבצע במספר נקודות זמן ובכך מאפשרות ניטור של קינטיקה אנגיוגנזה. ארה"ב היא שיטת הדמיה בשימוש נרחב אשר ברשותה רזולוציה מרחבית גבוהה להדמית כלי הדם הבא (iv) הזרקה תוך ורידית של microbubbles שתישאר באופן בלעדי בתא של כלי דם 8-11. Microbubbles היא microbubbles מלאת גז שמייצרת אות echogenic חזקה כאשר נרגש עם דופק ארה"ב ובכך לשמש כחומר ניגוד טוב. תמונות 3D של התקע נרכשות באמצעות תוכנת מערכת ההדמיה בארה"ב בעקבות הרס microbubbles. תמונות וכתוצאה מכך מורכבות ממסגרות תמונה של הרס-לפני ואחרי של microbubbles ומשקפות את ההבדל בעוצמת וידאו בצבע. יכסה אלהתמונות מוצגות באופן אוטומטי על ידי התוכנה. כתוצאה מכך, אחוז מכולים הפונקציונליים בתוך התוספת ניתן לכמת. רזולוציה גבוהה fibered endomicroscopy confocal משמשת כשיטת הדמיה משלימה על ידי דיווח על מורפולוגיה כלי דם. בשיטה זעיר פולשנית זה, תמונות שנרכשו לאחר נטילת iv של dextran FITC מצומדות- 12. פולימר צבעי ניאון זרם הדם ובכך משמש כ'חומר ניגוד 'למורפולוגיה כלי דם וזרימת דם. יתר על כן, מאז הפולימר המוזרק הוא בגודל של 70 kDa, זה יכול רק לחצות כלי דולפים כפי שנמצא בכלי דם של גידול. זה יגרום רקע גבוה מdextran FITC שכותרתו מחוץ לכלי הדם. כתוצאה מכך, endomicroscopy confocal fibered יכול לשמש כדי לחזות מאפיינים טיפוסיים של השפעת EPR בגידול neovasculature- כלי מוגדלים, דולפים, סבוכים-מאוד, עם קצוות קהים.

מודל מערכת זו descriמיטה בהשוואה לפוטנציאל angiogenic של גליובלסטומה אדם U-87 MG והשיבוט הרדום שלה 13. כלי דם בתוך התקעים הוערכו שלושה שבועות חיסון הודעת ג'ל ECM-לחקות. זה היה הראה כי כלי הדם בתוך תקעים המכילים CM מU-87 MG מהיר גדל תאים מניבי גידול היה גדלו באופן משמעותי במונחים של מספר, צפיפות ופונקציונליות, בהשוואה לכלי דם בתוך תקעים המכילים CM מהתאים מניב גידול הרדומים. לפיכך, המחברים הצליחו להגיע למסקנה שCM מבודד מU-87 MG מהיר גדל תאים מניבי גידול מכיל רמות גבוהות יותר של גורמים פרו-angiogenic, לעומת CM מהתאים מניב גידול רדומים. גורמים אלה מעוררים את היווצרותם של כלי דם פונקציונליים על ידי באופן חיובי משפיע על כל השלבים של מפל angiogenic (כלומר, התפשטות, הנבטה, ההגירה וסופו של דבר, ההיווצרות של מבנים צינוריים של תאי אנדותל).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל נהלי בעלי החיים אושרו ובוצעו בעמידה בתקנים של אוניברסיטת תל אביב לרפואה ע"ש סאקלר מוסדי טיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC).

1. הכנת Media אוויר

  1. זרע 2 x 10 6 U-87 תאי MG בצלחת תרבות 10 סנטימטרים בנפח של 8 מיליליטר הבינוני של הנשר שונה Dulbecco (DMEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) ו 1% פתרון הפניצילין / סטרפטומיצין / nystatin.
  2. דגירה תאים ב 37 ° C; 5% CO 2 עד להשגת confluency המלא ב 48 שעות.
  3. באמצעות מזרק 10 מיליליטר, למשוך את כל המדיום מהצלחת ולסנן דרך פילטר 0.45 מיקרומטר לתוך צינור 15 מיליליטר.
  4. ללא שטיפת צלחת התאים, להוסיף פתרון 1 מיליליטר טריפסין (0.25%) ודגירה.
  5. כאשר כל התאים מנותקים, להשבית טריפסין באמצעות לפחות 5 מיליליטר DMEM בתוספת 10% FBS וpreform ספירת תאים.
    6. > ספירת תאים באמצעות hemocytometer או מכשיר סלולארי, ספירה אחרת ולחשב את מספר התאים על פי שיטת הספירה בשימוש.
    הערה: זה ישמש מאוחר יותר על מנת לנרמל את ריכוז CM.
  6. העבר את CM לבקבוק מסביב לתחתית כוס ולהתרכז במאייד סיבובי ואקום גבוה. על מנת להאיץ את התהליך, להגדיל את טמפרטורת אמבט 37 ° C, אם תרצה בכך. המשך עד CM משיג מרקם כמו דבק.
  7. Resuspend ס"מ אחד מצלחת התרבות ב400 מלוח μl. בעת שימוש בצלחת יותר מפעם אחת, להשתמש היקף שווה ערך. לדוגמא, עבור 2 צלחות תרבות, השתמש 800 μl. השתמש בכל צלחת במשך 4 עכברים.
  8. על מנת להשוות שורות תאים שונות או טיפולים, להתאים את עוצמת הקול בהתאם ליחס התא שהתקבל בשלב 1.6. לדוגמא, אם צלחת אחת מכילה 1.5x תאים יותר, להוסיף 200 μl של תמיסת מלח כדי 400 μl קיים מראש. זה יהיה CM המותאם
כותרת "> 2. ECM-לחקות ג'ל Plug הרכבת החיסון לעכברים

  1. לפני inoculating ג'ל ECM-לחקות לעכברים, להכין את החומרים הבאים:
    1. צמיחה גורמים מופחתים ג'ל ECM-לחקות ללא פנול (להפשיר לילה, יום לפני הניסוי, ב 4 ° C על קרח).
    2. מכונת גילוח חשמלי.
    3. קטמין וxylazine כדי להרדים את העכברים.
    4. קר כקרח 1,000 טיפים μl סטרילי.
    5. קר כקרח מזרק 1 מיליליטר ו -27 מחטי G.
  2. להתכונן לכל עכבר צינור 1.5 מיליליטר Eppendorf המכיל 80 μl המותאם CM ולשמור על קרח.
  3. על צינור אחד, להוסיף 600 צמיחה גורמים קר כקרח μl ג'ל ECM-לחקות מופחת ללא פנול שהפשיר לילה ב 4 ° C, על קרח. ג'ל ECM-לחקות הוא נוזלי ב4 ° C ומתמצק בטמפרטורת גוף; על מנת למנוע את הג'ל ECM-לחקות לחיזוק, השתמש 1,000 טיפים μl קר כקרח. מערבבים צינורות בזהירות מבלי להרכיב בועות ולשמור על קרח.
  4. הרדימי B 6 בן שבועעכברים / ג ALB באמצעות קטמין (100 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (מ"ג 12 / קילוגרם). אשר הרדמה תקינה על פי טיפול בבעלי החיים המוסדי ועדת שימוש, כלומר לפני תחילת הניסוי. בעלי חיים הגיעו למטוס שלהם הראוי של הרדמה כאשר הם כבר לא מגיבים לקמצוץ הבוהן חברה.
  5. לגלח את אזור הבטן של העכברים ולחטא באמצעות לשפשף / אלכוהול כירורגית.
  6. השתמש במזרק 1 מיליליטר קר ומחט 27 G להזריק את התוכן של תת עורי צינור Eppendorf. לבצע ההזרקה באיטיות כדי למנוע היווצרות בועה. ברגע שכל הנפח מנוהל, לא להוציא את המחט לכמה דקות, עד התמצקות מתרחשת.

3. הערכה של ECM-לחקות ג'ל Plug כלי דם באמצעות אולטרסאונד

הערה: חלק זה של הפרוטוקול דורש ידע קודם של הפעלת מערכת אולטרסאונד הדמיה, או הסיוע של טכנאי מוסמך.

  1. לפני שמתחיל, יש לי following חומרים ומכשירים מוכנים:
    1. מכונת גילוח חשמלי.
    2. . קרם מקריח
    3. קטמין וxylazine כדי להרדים את העכברים.
    4. -ממוקד ללא microbubbles.
    5. מכשיר הפעלה.
    6. מערכת הדמיה בארה"ב כולל בדיקה 708 55 MHz וmicromanipulator רכישת 3D.
  2. למדוד כלי דם בתוך התקעים שלושה שבועות לאחר חיסון:
    הערה: במודל החיה מבוסס MG U-87, 3 שבועות נמצאו לייצג את נקודת הזמן האידיאלית להדמיה. תחת הגדרות שונות, לכייל קינטיקה כלי דם החל מכמה ימים לאחר חיסון של תקעים.
    1. הרדימי עכברים באמצעות קטמין (100 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (12 מ"ג / קילוגרם). אשר הרדמה תקינה על פי טיפול בבעלי החיים המוסדי ועדת שימוש, כלומר לפני תחילת הניסוי. בעלי חיים הגיעו למטוס שלהם הראוי של הרדמה כאשר הם כבר לא מגיבים לקמצוץ הבוהן חברה.
    2. לגלחאזור בטן של העכברים ולטפל עם קרם מקריח.
    3. תקן את עכברי supinely על הבמה של מיקרו-מניפולטור.
    4. באמצעות מי מלח המכיל מזרק 1 מיליליטר ומחט G 30, למקם את המחט בתוך וריד הזנב, לתקן את המחט בחוזקה ולשחרר את המזרק.
    5. להגדיר עבור הפעלת רכישת תמונת 3D במצב ניגודיות:
      1. לחץ על "3D" כדי לאתחל את שלב מנוע 3D ומניח את המתמר באמצע אזור הסריקה הרצויה.
      2. לחץ על "3D" וקלט גודל מרחק וצעד הסריקה, ולאחר מכן לחץ "סריקה".
      3. ודא שכל התוספת נסרקה בנתוני תמונת 3D מוצג. אם לא, להתאים את המתמר, כך שכל התוספת גלויה בצעד הסריקה וחזור על 3.5.2.
      4. לחץ על "ניגודיות" ולדחוף את פיצוי רווח הזמן (TGC) שולט בצד השמאל כדי להכהות את התמונה.
    6. הפעל את microbubbles בעזרת מערבל בקבוקון שהוא designated להפעלת microbubbles במשך 45 שניות.
    7. מערבבים במזרק 1 מיליליטר 50 μl של microbubbles עם 50 מלוח μl.
    8. החלף את המזרק רופף המכיל תמיסת מלח עם מזרק המכיל microbubbles הופעלה. להזריק את microbubbles המדולל לוריד הזנב של העכברים, לחכות כמה שניות לבועות להגיע למצב יציב, ולאחר מכן לרכוש cine לולאת חומר ניגוד 3D של התקע, באמצעות מנוע רכישת 3D:
      1. "3D" לחץ ובחר באפשרות "סריקה" לרכוש תמונות contrast-enhanced 3D ולאחר מכן לחץ על "Cine חנות" כדי לשמור את נתוני תמונה.
      2. לחץ על "3D" ולחץ על "להשמיד 3D" אבדון microbubbles.
      3. "3D" לחץ שוב ובחר "סריקה" לרכוש cine לולאת הודעה הרס, לאחר מכן לחץ על "Cine חנות".
    9. צור את שכבת מסגרות תמונה של לפני ואחרי חורבן microbubbles:
      1. וב# 8220; הגדרות הפניה "בצד השמאל של המסך לחץ על" צור התייחסות ".
      2. "ניהול המחקר" לחץ כדי לפתוח את cine הלולאה מראש הרס שנרכשה.
      3. לחץ על "Cine תהליך" כדי ליצור את שכבת הניגוד הירוקה, לאחר מכן לחץ על "Load Into 3D".
    10. השתמש בתוכנת ההדמיה בארה"ב על מנת לכמת את תמונת 3D וכתוצאה מכך לדם בתוך התקעים נפח:
      1. לחץ על "הסריקה / Freeze" ולאחר מכן לחץ על "הגדרות מצב".
      2. לחץ על "נפח" ובחר "מקביל".
      3. צור 3D נפח של רקמת המטרה על ידי פילוח סדרה של קווי המתאר.
      4. לחץ על "סיום" כדי להשלים את הפילוח.
        הערה: נפח חומר הניגוד של יוצג בצד השמאלי התחתון של המסך.
    11. בסופו של ההליך, מקום עכברים בסביבה חמה, נקייה, יבשה, שקטה הרחק מבעלי חיים אחרים. לספק חום באמצעות כרית זמינה מסחרי כירורגית חימום או מנורת ליבון (50-75 ואט), להציב 12-14 סנטימטרים ממכרסמים. צג עכברים ברציפות עד שמירה על יציבה זקופה וההליכה בדרך כלל.

4. הערכה של ECM-לחקות ג'ל Plug כלי דם מורפולוגיה שימוש fibered Confocal Endomicroscopy

הערה: חלק זה של הפרוטוקול מבוצעת הדמיה בארה"ב מייד לאחר וזה דורש ידע קודם של הפעלת מערכת fibered confocal ההדמיה endomicroscopy, או הסיוע של טכנאי מוסמך.

  1. לפני שמתחיל, יש לי החומרים ומכשירים מוכנים הבאים:
    1. כלים כמו מלקחיים, מספריים וחוטי תפירה נספגים ניתוח.
    2. dextran מצומדות-FITC (70 KDA).
    3. פתרונות כיול (שלושה צינורות כל מי חמצן המכיל, מים או פתרון ניאון).
    4. מערכת ההדמיה ובדיקה מתאימה להדמיה של כלי דם על פי יצרן.
  2. הרדימי עכברים באמצעות קטמין (100 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (12 מ"ג / קילוגרם).
  3. לנהל iv, דרך וריד הזנב, 200 μl של 10 מ"ג / dextran שכותרתו FITC מיליליטר.
  4. לחטא את אזור הבטן באמצעות לשפשף / אלכוהול כירורגית ולהחיל חתך קטן של כ 1 סנטימטר מהתקע.
  5. מניחים את חללית endomicroscopy על גבי התקע בעדינות, תוך שמירה על התוספת בשלמותה.
  6. רכישה:
    1. ברגע שהבדיקה מוגדרת בתוספת, לחץ על "התחל לייזר" באמצעות דוושת הרגל. הקרינה צריכה להיות מוצגת על המסך.
    2. לרכוש סרטים קצרים (עד 30 שניות) על ידי לחיצה על 'רשומה' על המסך או על 'בחרו' באמצעות דוושת הרגל.
    3. בין סרטים, לשטוף את הבדיקה על ידי הצבת הקצה במים צינור המכיל.
    4. בסיום, להסיר את הבדיקה ולנקות את הקצה עם קצה כותנה.
  7. כדי לנתח ממוצע veקוטר SSEL:
    1. לחץ על הסמל "זיהוי microvessels" בפנל העליון כדי לפתוח את חלון מודול איתור הכלי.
    2. לחץ על "העדפות" וסמן "Mean קוטר כלי" ב" סטטיסטיקה של עניין "ו-" ברים תצוגת היסטוגרמה "במצב" התצוגה ".
    3. לחץ על "זיהוי" כדי להציג את המדידות שנבחרו.
  8. כדי לנתח את עוצמת אות ניאון באזורים סמוכים לכלי דם:
    1. לחץ על "צור ROI המעגל" בלוח השמאלי וליצור מעגל באזור של עניין.
    2. לחץ על "היסטוגרמה לחשב את ההחזר על ההשקעה בתוך" כדי לחשב את הערכים הקשורים לאזור זה.

טיפול 5. הודעה-פרוצדוראלי של עכברים

  1. בסופו של כל הליך הדמיה, מקום עכברים בסביבה חמה, נקייה, יבשה, שקטה הרחק מבעלי חיים אחרים. לספק חום באמצעות מסחרי-כרית vailable כירורגית חימום או מנורת ליבון (50-75 W), ממוקמת במרחק של 12-14 מכרסמים. צג עכברים ברציפות עד שמירה על יציבה זקופה וההליכה בדרך כלל.
  2. לניתוח נוסף של כלי הדם "תקעים בנקודות זמן נוספים, תחול תנאי ההתאוששות הבאות:
    1. תפר את החתך הקטן באמצעות תפרים נספגים.
    2. תן שיכוך כאבים עכברים כגון עצירות (1 מ"ג / קילוגרם) תת עורי, ולחזור לכלובים נפרדים.
    3. שים לב לכל בעלי החיים על מנת לקבוע אם טיפול במשככי כאבים נוסף הוא הכרחי ולהעריך מחדש מדי יום כדי לעקוב ולהעריך למצוקה.
  3. בנקודת הסיום של הניסוי, להרדים עכברים על ידי isoflurane היישום הראשון, ואחריו נקע בצוואר הרחם.
  4. אם הדמיה נוספת תבוצע בשבועות הבאים את צעדי הדמיה הראשוניים, יש לשמור את כל הנהלים סטרילי ככל האפשר. לשפשף את עור כירורגית יש לבצע, wa סטרילייש להשתמש בטיפי ter וצמר גפן סטרילי כדי לנקות את הבדיקה endomicroscopy, והבדיקה יש לחטא בין כל בעלי חיים באמצעות מים סטריליים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השתלת תקעי ג'ל ECM-לחקות עם CM משורת תאים מניב גידול angiogenic בצמיחה מהירה U-87 MG, תוצאות באנגיוגנזה הנרחבת. כלי דם זה יכול להיות חוקרים בהרחבה על ידי שימוש בשתי שיטות הדמיה משלימות.

ההדמיה בארה"ב חומר ניגוד microbubbles מגלה גיוס נרחב של כלי דם פונקציונליים לתקע על ידי הממחיש את זרימת דם נרחבת בתוך U-87 MG CM תקעים טעונים, בניגוד לזרימת דם לגילוי בתוך תקעים המכילים CM מהתאים מניב גידול רדומים (איור 1) .

המורפולוגיה של כלי דם חדש שיוקמו אלה מודגשת על ידי endomicroscopy fibered confocal (איור 2). כלי דם בתוך התקעים עמוסים U-87 MG CM הציגו מורפולוגיה טיפוסית לחדירות המשופרות והשפעת ההחזקה (EPR) למקרו-מולקולות כגון dextran-FITC ב 70 גודל kDa משמשות כאן. כלי דם הורחבו ומאוד ta ngled, עם זרימה לא רציפה ואיטית (איור 2 א, ג). כמו כן, דליפה של דם נצפתה לסביבה, כפי שמוצג על ידי אות ניאון גבוהה מחוץ לכלי הדם (איור 2).

איור 1
איור 1:. Microbubbles ניגוד משופר הדמיה ארה"ב בעקבות עירוי לוריד של microbubbles וההרס שלהם, U-87 CM MG המכיל תערוכת תקעים מוגבר כלי דם (בירוק). תקעים המכילים CM מU-87 תאים מניבי גידול רדומים הנגזר MG שמשו כבקרה. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"Src =" / קבצים / ftp_upload / 51,525 / "width =" 500 51525fig2highres.jpg "/>
איור 2: הדמיה מיקרוסקופית confocal סיבים. עירוי לוריד של 70 kDa dextran-FITC (), מאפשר הדמיה של מורפולוגיה זרימת דם וכלי דם. U-87 MG CM המכיל כלי דם תקעים מורכב מכולים דולפים, מוגדלים עם בלנט מסתיים. דליפת כלי דם מוצגת על ידי אות ניאון מחוץ לכלי הדם. כלי דם נורמלים בבטן עכבר שימשו כבקרה. עוצמת (B) פלורסנט אות באזורים סמוכים לכלי דם. אות הניאון מודגמת על ידי קשת מאדום ללבן. אדום כהה מייצג עוצמת אות נמוכה, ואילו לבן מייצג אות ניאון גבוהה. U-87 CM MG מכיל תקעים להראות אות ניאון ברורה מחוץ לכלים, בעוד שאין אות מוצגת מחוץ כלי נורמלים. (C) Mean קוטר כלי (MVD) של כלי דם בתוך תקעים המכילים U-87 CM MG (22.4 מיקרומטר) הוא significantly גבוה יותר בהשוואה לMVD של כלי רגילים (6.7 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שילוב שיטות הדמיה משלימות מאפשר הקניית המידע על הכלי-הדם הקטן בצפיפות, פונקציונלי והמורפולוגיה של רכיבי אנגיוגנזה שונים. CM Loading על תקעי ג'ל ECM-לחקות יוצר מייקרו-סביבה של גידול, אשר מופרד מאוכלוסיות תאים אחרות, כמו תאי אנדותל, שגויסו וextravasate לתקע.

על ידי ביצוע, במקביל, microbubbles הדמיה ארה"ב חומר ניגוד והדמיה endomicroscopy confocal fibered, אנו יכולים להסיק כי בריכה של גורמים המופרשים על ידי גידולים angiogenic בצמיחה מהירים יוצרים תאים, ללא תאי הסרטן עצמם, לא יכול לגייס רק כלי דם, אבל גם טופס כלי דם פונקציונלי עם מאפיינים טיפוסיים EPR. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת את ההפרדה בין השפעתם של הגורמים המופרשים והאינטראקציה תא אל התא במייקרו-הסביבה של גידול.

השיג מידע מארה"ב ומfibered confocalendomicroscopy עם זאת כפופה להגבלה של טכניקת ההדמיה. לדוגמא, בעת שימוש בהדמית endomicroscopy confocal fibered, זה בלתי אפשרי לתמונת כלי יחיד ספציפי דם לאורך זמן, או אפילו באותו האזור בתקע.

Assay תקע ג'ל ECM-לחקות קל יחסית לביצוע, וזה נגרם בעת טעינת CM עם ג'ל ECM-לחקות. עם זאת, נושא קריטי שיש לנקוט בחשבון הוא CM לחלק ג 'ECM-לחקות. כמויות גדולות של CM עשויות למנוע את הג'ל ECM-לחקות לחיזוק. לכן, סכום CM לא יעלה על כ -13% מג'ל ECM-לחקות.

שיטה זו יכולה להיות מותאמת למערכות ניסיוניות שונות ויישומים. לדוגמא, ניתן להשתמש בו כדי להעריך תרופות אנטי angiogenic על ידי CM טעינה מהתאים לפני וטופל בפוסט. כמו כן, ניתן להשתמש בשורות תאים אחרות תחת הגדרות הניסוי הבאות. עם זאת, כיול נדרש על מנתpply ריכוז CM האופטימלי. יתר על כן, נקודת הזמן האידיאלית להדמיה צריכה להיות מותאמת על פי כל מערכת מודל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rotary Vacuum Evaporator - - -
Growth-factors reduced phenol-free Matrigel BD Bioscience FAL356231 Thaw overnight, at 4 °C on ice
Depilatory cream - - -
Vevo2100 US imaging system VisualSonics Inc. - Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician
55 MHz 708 probe VisualSonics Inc. - -
Vevo2100 imaging software VisualSonics Inc. - -
VialMix DEFINITY Imaging VMIX -
DEFINITY microbubbles DEFINITY Imaging DE4 Activate for 45 sec using VialMix before use
CellVizio (Fibered confocal endomicroscope) Mauna Kea Technologies - Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician
ProFlex MiniO/30 probe Mauna Kea Technologies - -
70 kD FITC-labeled dextran Sigma-Aldrich 46945 -
ImageCell software Mauna Kea Technologies - -
Calibration Kit Mauna Kea Technologies - -
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Gibco Life Tecchnologies 41965-039
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries 04-007-1A
Penicillin/streptomycin/nystatin solution Biological Industries 03-032-1B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model. J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).
  2. Passaniti, A., et al. A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor. Lab Invest. 67, 519-528 (1992).
  3. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).
  4. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49, 32-40 (2003).
  5. Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137, 4511-4513 (1996).
  6. Adini, A., et al. Matrigel cytometry: a novel method for quantifying angiogenesis in vivo. J Immunol Methods. 342, 78-81 (2009).
  7. Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46, 6387-6392 (1986).
  8. Lindner, J. R. Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions. Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).
  9. Kuliszewski, M. A., et al. Molecular imaging of endothelial progenitor cell engraftment using contrast-enhanced ultrasound and targeted microbubbles. Cardiovasc Res. 83, 653-662 (2009).
  10. Stieger, S. M., et al. Ultrasound assessment of angiogenesis in a matrigel model in rats. Ultrasound Med Biol. 32, 673-681 (2006).
  11. Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
  12. Segal, E., Satchi-Fainaro, R. Design and development of polymer conjugates as anti-angiogenic agents. Adv Drug Deliv Rev. 61, 1159-1176 (2009).
  13. Satchi-Fainaro, R., et al. Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors. PLoS One. 7, 44395 (2012).

Tags

ביולוגיה סרטן גיליון 93 תקע Matrigel אנגיוגנזה microbubbles אולטרסאונד endomicroscopy תקשורת fibered-confocal מותנית.
פונקציונליות ניטור ומורפולוגיה של כלי דם גויס על ידי גורמים מופרשים על ידי תאים מניבי גידול בצמיחה מהיר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ferber, S., Tiram, G.,… More

Ferber, S., Tiram, G., Satchi-Fainaro, R. Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells. J. Vis. Exp. (93), e51525, doi:10.3791/51525 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter