तेजी से बढ़ रही ट्यूमर पैदा कोशिकाओं द्वारा स्रावित कारक द्वारा भर्ती निगरानी कार्यशीलता और vasculature की आकृति विज्ञान
Summary
We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).
Abstract
चूहों में चमड़े के नीचे Matrigel प्लग परख समर्थक और विरोधी वाहिकाजनक कारकों के vivo मूल्यांकन के लिए पसंद का एक तरीका है। इस विधि में, वांछित कारकों, चमड़े के नीचे इंजेक्शन के बाद, कैंसर परिवेश नकल उतार एक वातावरण के लिए फार्म solidifies जो ठंड में तरल ईसीएम-नकल जेल में पेश कर रहे हैं। इस मैट्रिक्स ऐसे endothelial कोशिकाओं, और vasculature की इसलिए, गठन के रूप में मेजबान कोशिकाओं, के प्रवेश परमिट।
इस के साथ साथ हम एक विशिष्ट कारक (जैसे, bFGF और वीईजीएफ़) या एजेंट के लिए विरोध के रूप में, कैंसर कोशिकाओं द्वारा स्रावित कारकों में से एक पूल के वाहिकाजनक संभावित वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो एक नए संशोधित Matrigel प्लग परख, प्रस्ताव। ईसीएम-नकल जेल युक्त प्लग तेजी से बढ़ ट्यूमर पैदा ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के मुख्यमंत्री को स्रावित कारकों में से एक पूल के साथ मेजबान (यानी, माउस) लागू करने के लिए उपयोग किया जाता है। हम पहले की वाहिकाजनक क्षमता का एक व्यापक तुलना वर्णन किया हैयू-87 एमजी पैतृक कोशिकाओं में प्रेरित एंजियोजिनेसिस दिखा यू-87 एमजी मानव ग्लियोब्लास्टोमा और इस प्रणाली के मॉडल में अपने निष्क्रिय व्युत्पन्न क्लोन,। मुख्यमंत्री 48 घंटा ऊष्मायन के बाद सेल लाइन या तो मिला हुआ टिशू कल्चर प्लेटों से एकत्र मीडिया छान कर तैयार किया जाता है। इसलिए, यह कोशिकाओं को खुद के बिना कोशिकाओं द्वारा स्रावित केवल कारकों में शामिल है। दो इमेजिंग तौर तरीकों के संयोजन यहाँ है वर्णित, प्लग के भीतर नवगठित रक्त वाहिकाओं के एक सटीक, वास्तविक समय सीमा तक, आकृति विज्ञान के लक्षण वर्णन और कार्यक्षमता के लिए, इसके विपरीत-बढ़ाया अल्ट्रासाउंड इमेजिंग और intravital fibered-confocal endomicroscopy microbubbles।
Introduction
Matrigel प्लग एंजियोजिनेसिस परख पहले Kibbey एट अल द्वारा वर्णित किया गया था। यह पेप्टाइड SIKVAV (SER-इले-लिस-वैल-अला-वैल) 1 से एंजियोजिनेसिस उत्तेजना का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, जहां 1992 में। अन्य vivo में angiogenesis के assays के लिए इसके विपरीत, माउस कॉर्निया एंजियोजिनेसिस या लड़की chorioallantoic झिल्ली assays के तरह, इस परख 2 प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है। इंजेक्शन के ईसीएम-नकल जेल कोशिकाओं, समर्थक वाहिकाजनक या एक विरोधी वाहिकाजनक यौगिकों और / या कारकों को शामिल कर सकते हैं। एक विरोधी वाहिकाजनक यौगिक की गतिविधि का मूल्यांकन, प्लग सामान्य रूप से संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़) और fibroblast वृद्धि कारक (FGF) का मिश्रण होता है, और विरोधी वाहिकाजनक पदार्थ सीधे प्लग या प्रणालीबद्ध 3 में प्रशासित किया जा सकता है, 4।
यह मिनट के भीतर solidifies जहां ईसीएम-नकल जेल subcutaneously इंजेक्शन है। जिसके परिणामस्वरूप प्लग में रक्त वाहिनियों की भर्ती का आकलन typicall हैY fluorescein आइसोथियोसाइनेट के इंजेक्शन (FITC) निम्नलिखित प्रतिदीप्ति संकेत माप करके, प्लग के भीतर हीमोग्लोबिन का स्तर मापने के द्वारा प्रदर्शन किया, endothelial विशिष्ट मार्करों के लिए ऊतक विज्ञान वर्गों के immunostaining द्वारा या छँटाई प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल (FACS) 2,5 द्वारा, dextran -labeled 6। हालांकि, इस आकलन केवल अंत बिंदु विश्लेषण की अनुमति देता है और रक्त वाहिकाओं की कार्यक्षमता और आकृति विज्ञान के बारे में जानकारी का अभाव है। रक्त सामग्री रक्त वाहिकाओं के आकार और खून की स्थिर पूल की हद से प्रभावित होता है क्योंकि इसके अलावा, प्लाज्मा मात्रा का माप, या तो हीमोग्लोबिन के स्तर से या एक संकेतक के रूप dextran-FITC का उपयोग करके, गुमराह किया जा सकता है। भर्ती वाहिका संरचना बढ़ाया पारगम्यता और प्रतिधारण (EPR) प्रभाव 7 के द्वारा होती है जब यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।
हम इस के साथ साथ दो पूरक इमेजिंग तौर तरीकों के संयोजन द्वारा भर्ती रक्त वाहिकाओं के दृश्य के लिए एक नया, अधिक सटीक, विधि का प्रस्ताव। Higरक्त वाहिका घनत्व के बारे में, लेकिन यह भी उनकी आकृति विज्ञान और कार्यक्षमता पर न केवल जानकारी प्रदान कर सकते हैं intravital रेशे-confocal endomicroscopy के साथ संयुक्त एच संकल्प microbubbles विपरीत बढ़ाया अल्ट्रासाउंड (अमेरिका)। इसके अलावा, इस विश्लेषण जिससे एंजियोजिनेसिस कैनेटीक्स की निगरानी सक्रिय करने के कई समय बिंदुओं पर प्रदर्शन किया जा सकता है। अमेरिका संवहनी डिब्बे 8-11 में विशेष रूप से रहते हैं कि microbubbles का अंतःशिरा (चतुर्थ) इंजेक्शन के बाद रक्त वाहिकाओं इमेजिंग के लिए उच्च स्थानिक संकल्प के पास है, जो एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया इमेजिंग साधन है। microbubbles एक अमेरिकी नाड़ी के साथ उत्साहित है और इस तरह एक अच्छा विपरीत एजेंट के रूप में काम जब एक मजबूत प्रतिध्वनिजनक संकेत है कि उत्पादन गैस से भरे microbubbles हैं। प्लग की 3 डी छवियों microbubbles विनाश निम्नलिखित अमेरिका इमेजिंग सिस्टम सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं। जिसके परिणामस्वरूप छवियों microbubbles के पूर्व और बाद के विनाश की छवि फ्रेम से बना है और रंग में वीडियो तीव्रता में अंतर को प्रतिबिंबित कर रहे हैं। ये overlayedछवियों को स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर के द्वारा प्रदर्शित कर रहे हैं। नतीजतन, प्लग के भीतर कार्यात्मक जहाजों की प्रतिशत मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। Confocal endomicroscopy fibered उच्च संकल्प रक्त वाहिकाओं आकृति विज्ञान पर रिपोर्टिंग से एक पूरक इमेजिंग साधन के रूप में कार्य करता है। इस न्यूनतम इनवेसिव विधि में, छवियों FITC संयुग्मित dextran 12 के चतुर्थ प्रशासन के बाद हासिल किया है। फ्लोरोसेंट बहुलक खून रंगों और इस प्रकार रक्त वाहिकाओं आकृति विज्ञान और रक्त प्रवाह के लिए एक 'विपरीत एजेंट' के रूप में कार्य करता है। इंजेक्ट बहुलक 70 केडीए के आकार में है, क्योंकि ट्यूमर वाहिका संरचना के रूप में पाया इसके अलावा, यह केवल टपकाया वाहिकाओं को पार कर सकते हैं। यह रक्त वाहिकाओं के बाहर FITC लेबल dextran से उच्च पृष्ठभूमि में परिणाम होगा। नतीजतन, fibered confocal endomicroscopy कुंद साथ समाप्त होता है, ट्यूमर में neovasculature- बढ़े, टपका हुआ, अत्यधिक पेचीदा जहाजों EPR प्रभाव के विशिष्ट विशेषताओं कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
इस प्रणाली के मॉडल descri किया गया थायू-87 एमजी मानव ग्लियोब्लास्टोमा और इसकी निष्क्रिय क्लोन 13 की वाहिकाजनक क्षमता की तुलना में बिस्तर। प्लग के भीतर vascularization तीन सप्ताह ईसीएम-नकल जेल टीका पोस्ट मूल्यांकन किया गया था। यह दिखाया गया था कि से मुख्यमंत्री युक्त प्लग के भीतर vascularization यू-87 एमजी निष्क्रिय ट्यूमर पैदा कोशिकाओं से मुख्यमंत्री युक्त प्लग के भीतर vascularization के साथ तुलना में जब ट्यूमर पैदा कोशिकाओं में काफी संख्या, घनत्व और कार्यक्षमता, के संदर्भ में वृद्धि की गई थी तेजी से बढ़ रहा है। इसलिए, लेखकों मुख्यमंत्री से अलग निष्कर्ष है कि करने में सक्षम थे यू-87 एमजी तेजी से बढ़ रही ट्यूमर पैदा कोशिकाओं निष्क्रिय ट्यूमर पैदा कोशिकाओं से मुख्यमंत्री के साथ तुलना समर्थक वाहिकाजनक कारकों का उच्च स्तर, शामिल हैं। इन कारकों (अंत में endothelial कोशिकाओं की ट्यूबलर संरचनाओं के गठन यानी, प्रसार, अंकुरण, प्रवास और) सकारात्मक वाहिकाजनक झरना के सभी चरणों को प्रभावित करने से कार्यात्मक रक्त वाहिकाओं के गठन को प्रोत्साहित।
Protocol
Representative Results
Discussion
पूरक इमेजिंग विधियों के संयोजन अलग एंजियोजिनेसिस 'घटकों microvessel घनत्व, कार्यक्षमता और आकृति विज्ञान के बारे में जानकारी की प्राप्ति की अनुमति देता है। ईसीएम-नकल जेल प्लग पर लोड हो रहा है मुख्यमंत्री प्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Satchi-Fainaro research laboratory is partially supported by The Association for International Cancer Research (AICR), German-Israel Foundation (GIF), THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award, and by grants from the Israeli National Nanotechnology Initiative (INNI), Focal Technology Area (FTA) program: Nanomedicine for Personalized Theranostics, and by The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Rotary Vacuum Evaporator | – | – | – |
| Growth-factors reduced phenol-free Matrigel | BD Bioscience | FAL356231 | Thaw overnight, at 40C on ice |
| Depilatory cream | – | – | – |
| Vevo2100 US imaging system | VisualSonics Inc. | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| 55 MHz 708 probe | VisualSonics Inc. | – | – |
| Vevo2100 imaging software | VisualSonics Inc. | – | – |
| VialMix | DEFINITY Imaging | VMIX | – |
| DEFINITY microbubbles | DEFINITY Imaging | DE4 | Activate for 45 seconds using Vialmix before use |
| CellVizio (Fibered confocal endomicroscope) | Mauna Kea Technologies | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| ProFlex MiniO/30 probe | Mauna Kea Technologies | – | – |
| 70 kD FITC-labeled Dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | – |
| ImageCell software | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Calibration Kit | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco Life Tecchnologies | 41965-039 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B |
References
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