고속 성장하는 종양 생성 세포에 의해 분비 요인에 의해 보충 모니터링 기능 및 혈관의 형태학
Summary
We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).
Abstract
마우스의 피하 마트 리겔 플러그 어 세이는 프로 및 항 – 혈관 신생 인자의 생체 내 평가를위한 선택 방법이다. 이 방법에서는, 원하는 인자, 피하 주사 후 암 환경을 흉내 낸 환경을 형성하도록 응고 초기 액체 ECM-모방 겔에 도입된다. 이 행렬은 내피 세포 및 혈관의 따라서 형성과 같은 숙주 세포의 침투를 허용한다.
여기서 우리는 특정 인자 (예를 들면, VEGF 및 bFGF에) 또는 에이전트는 대조적으로, 암 세포에 의해 분비 인자 풀의 혈관 신생 가능성을 설명하기 위해 이용 될 수있는 새로운 변형 마트 리겔 플러그 어 세이를 제안한다. ECM-모방 젤을 포함하는 플러그 – 빠르게 성장하는 종양 발생 아교 모세포종 세포의 CM에 분비 요인의 풀과 호스트 (즉, 마우스)를 소개하기 위해 사용된다. 우리는 이전의 혈관 전위의 광범위한 비교를 설명했다U-87 MG 부모의 세포에서 유도 된 혈관 신생을 보여주는 U-87 MG 인간 아교 모세포종이 시스템 모델에서의 휴면 유래 복제,,. CM은 48 시간 배양 한 다음 세포주 어느 합쳐진 조직 배양 플레이트로부터 수집 된 매체를 필터링함으로써 제조된다. 그러므로, 세포 자체가없는 세포에 의해 분비되는 유일한 요소가 포함되어 있습니다. 두 영상 방식의 조합이 여기에 설명 된, 플러그 내에서 새로 형성된 혈관의 정확한 실시간 범위, 형태의 특성과 기능을, 조영 증강 초음파 영상 및 생체 내에 다발 – 공 초점 endomicroscopy을 미세 기포.
Introduction
마트 리겔 플러그 어 세이는 혈관 신생 제 Kibbey 등에 의해 설명되었다.이 펩타이드 SIKVAV (SER-일드리스 Val으로부터의 Ala-val) 인 (1)에 의해 혈관 신생 자극을 평가하는 데 사용 된 1992 년. 다른 생체 내 혈관 신생 어 세이는 대조적으로, 마우스 각막 신생 병아리 또는 융모 막 세이 원한다면, 상기 분석을 수행이 비교적 용이하다. 주입 ECM-모방 겔 세포 친 혈관 또는 항 혈관 신생 화합물 및 / 또는 요소를 포함 할 수있다. 항 – 혈관 신생 화합물의 활성을 평가할 때, 플러그가 정상적으로 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 섬유 아세포 성장 인자 (FGF)의 혼합물을 포함하고, 항 – 혈관 신생 물질 직접 플러그 또는 전신적으로 (3)에 투여 될 수있다, 4.
이 분 이내에 굳은 곳 ECM-모방 젤 피하 주입된다. 그 결과 플러그의 혈관 모집의 평가 typicall입니다Y 형광 염료의 주입 (FITC) 다음 형광 신호의 측정에 의해, 플러그 내에서 헤모글로빈 농도를 측정함으로써 수행이 내피 특이 마커 조직학 섹션의 면역 염색에 의해 또는 정렬 형광 – 활성화 된 세포 (FACS) 2,5-하여, 덱스 트란 – 표지 6. 그러나,이 평가는 단지 종점 분석이 가능하고 혈관의 기능 및 형태에 대한 정보가 부족하다. 혈액 콘텐츠 혈관의 크기와 혈액의 정체 풀의 정도에 의해 영향을 받기 때문에 또한 혈장 부피의 측정 중 헤모글로빈 수치 또는 지표로서 덱스 트란-FITC를 사용함으로써, 잘못 될 수있다. 모집 혈관 투과성을 향상 및 보존 (EPR) 효과 (7)을 특징으로하는 경우에 특히 중요하다.
우리는 본원에서 두 개의 상보적인 이미징을 조합하여 채용 혈관의 시각화를위한 새롭고보다 정확한 방법을 제안한다. HIG혈관 밀도에 대한뿐만 아니라, 자신의 형태와 기능에뿐만 아니라 정보를 제공 할 수있는 생체 내에 섬유질의-공 초점 endomicroscopy과 함께 시간 해상도 미세 기포 조영 증강 초음파 (US). 또한,이 분석함으로써 혈관 형성의 동력학 모니터링을 가능하게 여러 시간 지점에서 수행 될 수있다. US는 혈관 구획 8-11에서만 남아 미세 기포 정맥 내 (IV) 주입 다음 혈관 조영 높은 공간 분해능을 가지고 폭넓게 사용되는 영상 기법이다. 마이크로 버블은 미국 펄스 흥분 때문에 좋은 조영제 역할을 할 때 강한 에코 신호를 생성 가스 충전 마이크로 버블 수 있습니다. 플러그의 3D 영상은 마이크로 버블 파괴 다음 US 이미징 시스템 소프트웨어를 사용하여 획득된다. 결과 이미지는 마이크로 버블의 사전 및 사후 파괴의 이미지 프레임에서 구성 및 색상의 비디오 강도의 차이를 반영합니다. 이러한 오버레이이미지는 소프트웨어에 의해 자동으로 표시됩니다. 따라서, 플러그 내에서 혈관의 기능적 %가 정량화 될 수있다. 공 초점 endomicroscopy 다발, 고해상도 혈관의 형태에보고함으로써 상호 보완적인 영상 기법의 역할을한다. 이 최소 침습적 방법, 이미지는 FITC 접합 된 덱스 트란 (12)의 정맥 투여 후 취득. 중합체 형광 염료 및 혈류에 따라서 혈관의 형태 및 혈류 '조영제'로서 기능한다. 주입 된 중합체의 70 KDa의 크기이기 때문에, 종양 혈관 검색된 더욱이, 그것은 단지 새는 혈관을 통과 할 수있다. 이것은 혈관 외부 FITC 표지 된 덱스 트란의 높은 배경 초래할 것이다. 따라서, 다발, 촛점 endomicroscopy은 평활 말단으로, 종양 내 neovasculature- 확대 누설 고도로 얽힌 혈관 EPR 효과의 전형적인 특성을 시각화 할 수있다.
이 시스템 모델은 descri했다U-87 MG 인간 아교 모세포종과 휴면 클론 (13)의 혈관 전위의 비교 침대. 플러그 내에서 혈관 신생은 3 주 ECM-모방 젤 접종을 게시 평가 하였다. 그것은 보였다 그에서 CM을 포함하는 플러그 내의 혈관 U-87 MG 휴면 종양 생성 세포에서 CM을 포함하는 플러그 내에서 혈관과 비교했을 때 종양 생성 세포가 크게 수, 밀도 및 기능면에서 증가 하였다 빠르게 성장. 따라서 저자는 CM이 분리한다는 결론을 내릴 수 있었다 U-87 MG 빠르게 성장하는 종양 세포 생성하는 휴면 종양 생성 세포에서 CM에 비해 프로 혈관 신생 인자의 높은 수준을 포함하고 있습니다. 이러한 요소 (최종적 내피 세포의 관 구조의 형성, 즉, 증식, 발아, 영동) 양 혈관 신생 캐스케이드의 모든 단계에 영향을 미치는 작용하여 혈관 형성을 자극한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
상보 촬상 방법을 결합하여 다른 혈관 형성 구성 요소의 미세 혈관의 밀도 및 형태의 기능에 관한 정보의 취득을 허용한다. ECM-모방 겔 플러그에로드 CM은 플러그로 모집 extravasate되어 내피 세포, 같은 다른 세포 집단에서 분리 된 종양 미세 환경을 생성합니다.
병렬로 수행함으로써, 조영 증강 US 이미징 및 다발 촛점 endomicroscopy 이미징 마이크로 버블, 우리는 암세포 자체없이…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Satchi-Fainaro research laboratory is partially supported by The Association for International Cancer Research (AICR), German-Israel Foundation (GIF), THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award, and by grants from the Israeli National Nanotechnology Initiative (INNI), Focal Technology Area (FTA) program: Nanomedicine for Personalized Theranostics, and by The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Rotary Vacuum Evaporator | – | – | – |
| Growth-factors reduced phenol-free Matrigel | BD Bioscience | FAL356231 | Thaw overnight, at 40C on ice |
| Depilatory cream | – | – | – |
| Vevo2100 US imaging system | VisualSonics Inc. | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| 55 MHz 708 probe | VisualSonics Inc. | – | – |
| Vevo2100 imaging software | VisualSonics Inc. | – | – |
| VialMix | DEFINITY Imaging | VMIX | – |
| DEFINITY microbubbles | DEFINITY Imaging | DE4 | Activate for 45 seconds using Vialmix before use |
| CellVizio (Fibered confocal endomicroscope) | Mauna Kea Technologies | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| ProFlex MiniO/30 probe | Mauna Kea Technologies | – | – |
| 70 kD FITC-labeled Dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | – |
| ImageCell software | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Calibration Kit | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco Life Tecchnologies | 41965-039 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B |
References
- Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model. J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).
- Passaniti, A., et al. A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor. Lab Invest. 67, 519-528 (1992).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49, 32-40 (2003).
- Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137, 4511-4513 (1996).
- Adini, A., et al. Matrigel cytometry: a novel method for quantifying angiogenesis in vivo. J Immunol Methods. 342, 78-81 (2009).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46, 6387-6392 (1986).
- Lindner, J. R. Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions. Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).
- Kuliszewski, M. A., et al. Molecular imaging of endothelial progenitor cell engraftment using contrast-enhanced ultrasound and targeted microbubbles. Cardiovasc Res. 83, 653-662 (2009).
- Stieger, S. M., et al. Ultrasound assessment of angiogenesis in a matrigel model in rats. Ultrasound Med Biol. 32, 673-681 (2006).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Segal, E., Satchi-Fainaro, R. Design and development of polymer conjugates as anti-angiogenic agents. Adv Drug Deliv Rev. 61, 1159-1176 (2009).
- Satchi-Fainaro, R., et al. Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors. PLoS One. 7, 44395 (2012).
