Overvåking Funksjonalitet og morfologi av blodkar Rekruttert av faktorer utskilles av sterkt voksende svulst generer Cells

Summary

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.). 

Abstract

Den subkutane matrigel plugg-analyse i mus som er en metode for valg for in vivo-evaluering av pro- og anti-angiogene faktorer. I denne metoden, blir ønskede faktorer innføres i kald væske ECM-etterligner gel som etter subkutan injeksjon, størkner for å danne et miljø som etterligner kreft miljø. Denne matrisen muliggjør inntrengning av vertsceller, slik som endotelceller, og derfor dannelsen av blodkar.

Heri foreslår vi en ny modifisert matrigel plugg assay, som kan utnyttes for å illustrere den angiogene potensialet av en pool av faktorer utskilt av cancerceller, i motsetning til en bestemt faktor (f.eks bFGF og VEGF) eller middel. Pluggen som inneholder ECM-ligne gel brukes til å introdusere verten (dvs. mus) med en pool av faktorer som utskilles til CM av raskt voksende tumor generer glioblastom celler. Vi har tidligere beskrevet en omfattende sammenligning av den angiogene potensialetU-87 MG human glioblastoma og dets hvil-avledet klon, i dette system modell, som viser indusert angiogenese i U-87 MG parentale celler. CM fremstilles ved å filtrere innsamlede medier fra sammenflytende vevskulturplater av enten cellelinje følgende 48 timers inkubering. Derfor inneholder det eneste faktorene som utskilles av cellene, uten at cellene selv. Beskrevet her er kombinasjonen av to bildediagnostikk, mikrobobler kontrastforsterket ultralyd billeddiagnostikk og intra fibered-konfokalmikroskoper endomicroscopy, for en nøyaktig, real-time karakterisering av omfanget, morfologi og funksjonalitet av nydannede blodårene i pluggene.

Introduction

Den matrigel plugg angiogenese analysen ble først beskrevet av Kibbey et al. I 1992, der det ble brukt til å evaluere angiogenese stimulering av peptidet SIKVAV (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) ^1. I motsetning til andre in vivo angiogenese-assays, slik som mus korneal angiogenese eller chick chorioallantoic membran-analyser, er relativt lett å utføre ^to denne analysen. Den injiserte ECM-etterligner gel kan inneholde celler, pro-angiogene eller et anti-angiogene forbindelser og / eller faktorer. Når man skal vurdere aktiviteten av en anti-angiogen forbindelse, inneholder pluggen normalt en blanding av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), og fibroblast vekstfaktor (FGF), og den anti-angiogene stoffer kan administreres direkte inn i pluggen eller systemisk ^{3, 4.}

ECM-ligne gel injiseres subkutant der det stivner i løpet av minutter. Vurderings rekruttering blodåre av i den resulterende pluggen er typically utført ved å måle hemoglobinnivå innenfor pluggen, ved fluorescens signal måling etter injeksjon av fluoresceinisotiocyanat (FITC) -merket dekstran, ved farging av histologiske seksjoner for endotelceller spesifikke markører eller ved fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) ^{2,5, 6.} Men denne vurderingen tillater bare ende-punkt-analyse og mangler informasjon om funksjonaliteten og morfologi av blodkar. I tillegg er måling av plasmavolumet, enten ved hemoglobinnivåer eller ved å bruke dekstran-FITC som en indikator, kan være misvisende fordi blodinnholdet påvirkes av størrelsen av blodkar og omfanget av stillestående dammer av blod. Dette er spesielt viktig når det rekruttert blodkar er preget av den forbedrede permeabilitet og oppbevaring (EPJ) effekt ^7.

Vi heri foreslår en ny og mer nøyaktig metode for visualisering av de krutt blodkar ved å kombinere to komplementære bildediagnostikk. High-oppløsning mikrobobler kontrast-forsterket ultralyd (US) kombinert med intra nålefilt-konfokalmikroskoper endomicroscopy kan gi informasjon ikke bare om blod fartøy tetthet, men også på deres morfologi og funksjonalitet. Videre kan denne analysen utføres ved flere tidspunkter dermed muliggjør overvåking av angiogenese-kinetikk. USA er en mye brukt avbildningsfunksjonalitet som besitter høy romlig oppløsning for blodkar bildebehandling etter intravenøs (iv) injeksjon av mikrobobler som forblir utelukkende i den vaskulære rommet ^8-11. Mikroboblene er gassfylte mikrobobler som produserer et sterkt ekkogene signal når eksitert med et US puls og således tjene som et godt kontrastmiddel. 3D bilder av pluggen er kjøpt ved hjelp av amerikanske imaging system software følgende mikrobobler ødeleggelse. Den resulterende bildene er sammensatt fra bilderammer før og etter ødeleggelsen av mikrobobler og reflekterer forskjellen i video intensitet i fargen. Disse overlappetBildene blir automatisk vises av programvaren. Følgelig kan den prosent av funksjonelle skip innen pluggen kvantifiseres. Høy oppløsning fibered konfokalmikroskoper endomicroscopy fungerer som en komplementær avbildningsfunksjonalitet ved å rapportere på blodkar morfologi. I dette minimalt invasive metoden, er bilder ervervet etter iv administrasjon av FITC-konjugert dekstran ^12. Det fluorescerende polymer fargestoffer i blodet og tjener således som en "kontrastmiddel" for blodkar morfologi og blodstrøm. Dessuten, siden den injiserte polymer er i en størrelse på 70 kDa, det kan bare krysse utett fartøyer som befinner seg i tumorvaskulatur. Dette vil føre til høy bakgrunn fra FITC-merket dekstran utenfor blodårene. Følgelig kan fibered konfokalmikroskoper endomicroscopy brukes til å visualisere typiske karakteristikker av EPJ effekt på tumor neovasculature- forstørret, utett, høyt sammenfiltrede fartøy, med butte ender.

Dette systemet modellen ble descriSengen i sammenligning av den angiogene potensialet U-87 MG human glioblastoma og dets hvil klon ^13. Vaskularisering innenfor pluggene ble evaluert tre uker etter ECM-ligne gel vaksinasjon. Det ble vist at vaskularisering i løpet av plugger som inneholder CM fra U-87 MG hurtig voksende tumor-genererende celler ble signifikant øket når det gjelder antall, tetthet og funksjonalitet, sammenlignet med vaskularisering i løpet av plugger som inneholder CM fra den sovende tumor-genererende celler. Derfor forfatterne var i stand til å konkludere med at CM isolert fra U-87 MG hurtig voksende tumor-genererende celler som inneholder høyere nivåer av pro-angiogene faktorer, sammenlignet med CM fra sovende tumor-genererende celler. Disse faktorene stimulere dannelsen av funksjonelle blodkar ved å positivt påvirke alle trinnene i den angiogene kaskade (dvs. proliferasjon, spirende, migrering og til slutt dannelse av rørformede strukturer av endotelceller).

Protocol

MERK: Alle dyr prosedyrer ble godkjent og utført i samsvar med standarder for Tel Aviv University Sackler School of Medicine Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). 1. Betinget av medier Seed 2 x 10 6 U-87 MG-celler i en 10 cm kulturplate i et volum på 8 ml Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin / nystatin løsning. Inkuber celler ved 37 ° C; 5% CO <sub…

Representative Results

Implantere ECM-ligne gel plugger med CM fra raskt voksende angiogent svulst generercellelinje U-87 MG, resulterer i omfattende angiogenese. Dette blodkar kan i stor utstrekning utforskes ved hjelp av to komplementære avbildningsmetoder. Mikrobobler kontrastforsterket amerikanske bildebehandling avslører omfattende rekruttering av funksjonelle blodårer inn pluggen ved å illustrere omfattende blodstrømmen i U-87 MG CM lastet plugger, i motsetning til undetectable blodstrøm innenfor plugg…

Discussion

Kombinere komplementære avbildningsmetoder gjør at tilegnelsen av informasjon om ulike angiogenese komponenter 'microvessel tetthet, funksjonalitet og morfologi. Lasting CM på ECM-ligne gel plugger genererer en svulst mikromiljøet, som er atskilt fra andre cellepopulasjoner, som endotelceller, som er rekruttert og ekstravasere inn pluggen.

Ved å utføre, parallelt, mikrobobler kontrastforsterket amerikanske bildebehandling og fibered konfokal endomicroscopy bildebehandling, kan vi k…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog number	Comments/Description
Rotary Vacuum Evaporator	–	–	–
Growth-factors reduced phenol-free Matrigel	BD Bioscience	FAL356231	Thaw overnight, at 40C on ice
Depilatory cream	–	–	–
Vevo2100 US imaging system	VisualSonics Inc.	–	Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician
55 MHz 708 probe	VisualSonics Inc.	–	–
Vevo2100 imaging software	VisualSonics Inc.	–	–
VialMix	DEFINITY Imaging	VMIX	–
DEFINITY microbubbles	DEFINITY Imaging	DE4	Activate for 45 seconds using Vialmix before use
CellVizio (Fibered confocal endomicroscope)	Mauna Kea Technologies	–	Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician
ProFlex MiniO/30 probe	Mauna Kea Technologies	–	–
70 kD FITC-labeled Dextran	Sigma-Aldrich	46945	–
ImageCell software	Mauna Kea Technologies	–	–
Calibration Kit	Mauna Kea Technologies	–	–
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco Life Tecchnologies	41965-039
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries	04-007-1A
Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution	Biological Industries	03-032-1B