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Biology

后期阶段的胚胎和幼虫的超声,促进免疫荧光染色 doi: 10.3791/51528 Published: August 14, 2014
* These authors contributed equally

Abstract

果蝇进行研究果蝇胚胎和幼虫提供重要的洞察,如细 ​​胞命运规范和器官发育过程。免疫允许开发组织和器官的可视化。然而,保护角质层形成于胚胎发育的最后阻止抗体渗透到后期的胚胎和幼虫。虽然之前的免疫清扫经常用来分析果蝇幼虫组织,它证明效率低下的一些分析,因为小组织可能难以定位和分离。超声提供了果蝇幼虫的免疫方案替代清扫。它允许大量的后期胚胎和幼虫的快捷,同时处理和维护现场形态。固定在甲醛后,将样品进行超声处理。样品然后进行免疫染色与抗原特异性初级蚂蚁ibodies和荧光标记的第二抗体,通过荧光显微镜可视化靶细胞类型和特定的蛋白质。在超声处理的过程中,超声处理探针的样品上面,以及超声处理的持续时间和强度,正确放置是关键的。可能需要高品质的污渍产生额外稍做修改标准的免疫染色的协议。对于抗体具有低的信噪比,更长的孵育时间通常是必要的。至于概念,这种超声促进的协议的证明,我们将展示三种组织类型(睾丸,卵巢,和神经组织)免疫组化染色,在一系列的发展阶段。

Introduction

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果蝇胚胎和幼虫为研究发育过程中的许多器官和组织一个很好的典范。各个单元的成像是在这些研究中常常需要以确定在哪些细胞发育的复杂的环境。细胞在组织中的可视化可以通过免疫染色来完成。以及描述的免疫染色协议果蝇胚胎组织<后17小时产蛋(AEL)1-3存在。然而,保护表皮的形式朝向胚的末端,以防止有效抗体渗透。因此,这些免疫染色方案是低效的中后期胚胎组织的分析和在幼虫发育( 第一龄(L1), 第二龄(L2)和第三龄(L3))的后续阶段。这种低效率施加了障碍,我们在这延长的发展阶段4所发生的动态过程的理解。 TISSUE夹层是一种广泛使用的技术来绕过这一障碍5-7。然而,夹层可以证明效率低下。提取可以通过难以定位或分离胚胎和幼虫组织缠身。此外,物理去除目标组织可以通过破裂它们或通过不提取它们以其整体造成损坏。

超声是采用声波干扰分子间相互作用的方法。它已被用于以免疫染色显影神经细胞类型6打乱果蝇幼虫角质层的完整性。这个协议已经适应免疫染色后期胚胎和幼虫性腺,它可以小到50微米的直径8-10。通过这样的研究中,雄性生殖系干细胞(GSC)利基形成过程的特点在后期果蝇胚胎8-10和机制调节干细胞的发育和DIFferentiation晚期胚胎性腺和幼虫已经阐明9-12。因此,超声处理提供了一种有效的替代组织剥离,可能是由于组织大小困难。此外,它使果蝇组织中的原位免疫染色,而使整个有机体的范围内的细胞和保持在原位的形态。在这里,我们描述了通过早期/中期三级组织原位一步一步的协议中晚期胚胎荧光免疫染色。 果蝇性腺和神经组织的分析显示,在代表性的成果来证明这个协议的效力。此外,这种免疫方案可适于分析其他果蝇组织以及组织中其他生物具有外表皮。

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Protocol

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1,准备集合笼

  1. 麻醉年轻,肥沃的苍蝇与CO 2。转让麻醉苍蝇笼子里。为了获得最佳的收益率,用100-120成蝇从2-7日龄以4:1的比例女性为男性。让苍蝇适当的适应期,〜24小时之前获得的样品进行固定。如果笼成立了处女的女性交配雄性,一个用36 - 48小时的适应期。
  2. 在笼的开放端,将事先准备好的苹果汁琼脂平板上用酵母膏中的中心在保持器的开口部的硬币大小的滴。然后,用固定带。密封的苹果汁琼脂平板上,并用封口膜笼之间的交界处。
  3. 放置笼中以苹果汁琼脂板作为基材的次级容器,并允许如由实验确定的苍蝇重现在确定的温度下在适当的时间周期。
    注:样品采集时间无线会有所不同。例如,收集后期胚胎/初的L1幼虫时(17 - 24小时),使苍蝇,在25℃,在25℃放置在苹果汁琼脂平板鸡蛋7小时前样品的老化17小时。类似地,对于中后期第一龄期幼虫的集合(36 - 48小时),使苍蝇,在25℃,在25℃产卵12小时之前的样品老化36小时。
  4. 一旦时间周期完成后,点击桌子上的笼子里,让苍蝇落离苹果汁琼脂平板无需麻醉。用新鲜含一滴酵母膏迅速更换使用的板材。保证新鲜板用胶带和封口膜和存储与苹果汁琼脂平板为基础的笼子。
  5. 小心地从旧板酵母滴用金属铲。所使用的苹果汁板盖的地方,并允许放置胚胎的年龄,如果实验需要。
    注意:在老化样品中,板可以被存储在25℃下,除非较高的温度是experimentaLLY要求。如何变老的胚胎收集上面描述的例子(见注步1.3)。除去样品老化前酵母膏的被执行以防止幼虫从爬行到酵母和分手琼脂下方。剩下的苹果汁琼脂和酵母膏残渣提供养分的幼虫的生长。而胚胎直接在酵母膏敷设是通过酵母膏除去丢失,这种损失是优选的酵母和琼脂残余的样品,可以减少染色效率。应选择其中一种不以除去酵母膏,酵母可与磷酸盐缓冲液的Triton X-100(PBTx)液化,用漆刷混合,然后从用细胞过滤网之前,固定样品中除去。

2,固定

  1. 一旦胚放置到苹果汁琼脂平板上有年龄到所需的时间点,用小画笔润湿的磷酸盐缓冲液的Triton X-100(PBTx)溶液小心地从第除去样品e盘。
    注:以前的幼虫是移动的,并且抓取到盖内。此示例同样可以通过去除用画笔来收集。
  2. 擦拭针对细胞过滤器的内部面对脊样本载货画笔。然后,用水冲洗过滤器的壁,并与含有PBTx溶液喷射瓶的画笔。将培养皿盖上的滤网下方捕捉PBTx解决方案。
  3. 之后所有的样品已经被转移到过滤器,倾足够PBTx进入过滤器,以提高样品脱网。然后,抬起过滤,倒入培养皿中的内容变成液体废物容器。
  4. 重复步骤2.3三次以除去酵母和飞可能已随着样品转移废物。
  5. 浇足50%的漂白剂(次氯酸钠)/水(DDH 2 O) 溶液入过滤,以提高幼虫脱网。让幼虫坐在溶液5分钟。然后,抬起过滤,倾吨他在液体废物容器中的陪替氏培养皿的内容。
    注意:漂白剂仅需要在0岁胚胎样 - 为了除去绒毛膜22小时。漂白剂的较旧的样本应用程序可以省略,但其夹杂物是无害。如果省略的需要,更换漂白剂在此步骤PBTx。稀释的漂白水应在溶液的配制24小时使用。
  6. 浇足PBTx入过滤器,以提高样本断网与PBTx过滤洗涤样品。允许样品坐在溶液3分钟。然后,抬起过滤,倒入培养皿中的内容变成液体废物容器。
  7. 重复执行步骤2.6的五倍。
  8. 民建联的细胞过滤干燥的底部,然后转移到样品含有1.75毫升用画笔PEMS系统解决方案,闪烁瓶中。
  9. 工作在一个通风良好的通风橱中,加入250μl的37%的甲醛和8ml试剂级庚烷到闪烁瓶中。
  10. 允许小瓶以摇动以200rpm或类似的中等速度持续20分钟。
  11. 加入10毫升甲醇,以闪烁小瓶的不除去先前的水相,并且允许小瓶以剧烈摇晃以500rpm持续1分钟。
    注:甲醇是危险的。继续在通风橱工作,并配戴合适的手套。
  12. 从摇瓶中取出,并立即倒入内容放到一个细胞过滤过的引擎盖液体废物容器。加入额外的甲醇的小瓶中,通过在必要时的细胞过滤器运行,以确保所有的样品已经被移除。
    注:细胞滤网可能会耗尽缓慢。为了解决这个问题,触摸实验室组织的细胞过滤器的底部,以便更快速地绘制通过过滤的溶液。甲醇,甲醛和庚烷应存储在适当的废弃物容器,直至妥善处置按照机构的指导方针。
  13. 细胞过滤器的使用实验室的组织干的底部,然后用画笔样品中的过滤器捕获转移到含0.5毫升甲醇1.5 ml离心管中。
    注:如果有多个闪烁瓶正在使用,完成步骤2.12和2.13一个小瓶在同一时间,以防止样品在干细胞过滤器。
  14. 一旦样品已经被添加到微量离心管中,除去甲醇用移液管。确保样品已经沉降到管底。
  15. 通过将大约为0.5毫升甲醇中,以管冲洗在微量离心管中的样品。等待样品来解决,然后用吸管除去甲醇。
  16. 重复步骤15三次。
  17. 加入0.5毫升甲醇中的管,并且然后存储在-20℃下冷冻以备后用。

3,补液和样本的免疫染色的制备

  1. 从离心管中用吸管除去甲醇,留下在管中的样品。商店甲醇废弃物的适当的废物容器中,直到妥善处理时间。
    注意:为了提高超声处理的效率,可以使用不超过3毫米的实例的在1.5 ml离心管的底部结算。过量样品可以开始上述补液步骤之前被转移到单独的试管用移液管。切割枪头用干净的刀片可用于防止移液管尖的堵塞。
  2. 加入1.0毫升的50%的甲醇/磷酸缓冲液吐温(PBTw)溶液于管和岩石3分钟。
  3. 除去甲醇溶液,以适当的废弃物容器中,用1.0微升PBTw的冲洗两次。每次冲洗后,让样品图纸掉PBTw用吸管之前结清。
  4. 加入1.0毫升牛血清白蛋白/磷酸盐缓冲吐温(BBTw)的混小瓶和岩石。后摇臂3分钟,让SAMP乐定居并删除BBTw用吸管。
  5. 重复步骤3.4两次照顾以除去尽可能多的BBTw尽可能没有在最后洗涤后丢失样本。
  6. 加入0.5毫升BBTw到管,并放置在管上的冰。

4,超声样品

  1. 将超声波仪,以最大振幅10%,并指定2秒不变超声波运行时间。
    注意:这些设置是特定于在材料和设备表所示的超声仪,并可能需要优化不同sonicators。
  2. 前样品的超声处理,通过将探针针尖到50ml锥形管中填充有离子交换水和运行超声波仪,以清洁探头清洗超声波仪探针。干式超声仪探头运行后的实验室组织。
  3. 浸入探头到含有样品的离心管中,以便它被定位大约3至4mm的样品上面,开始超声处理。
  4. 卸下米icrocentrifuge管,并放置在冰上至少30秒,从超声处理散热,并允许样品定居在微量离心管的底部。
  5. 重复步骤4.3和4.4在需要的基础上样品的年龄正在处理中。
    注:为获得最佳超声样品体积,胚胎年龄小于17小时不需要超声,但那些17至24小时(台17 /早期L1)需要两个超声处理。幼虫在24 - 36(早/中L1),36 - 48(中/后期-L1),48 - 60(早/中二级),60 - 72(中/晚L2),72 - 84(早L3),84 - 96(早期/中期L3),96 - 108(中/晚L3)小时需要5,9,11,13,15,18,和22超声处理。见进一步阐述超声时间的讨论。
  6. 用1.0mL冲洗BBTw两次。每次漂洗后使样品拉伸断BBTw用移液管之前解决。
  7. 加入1.0毫升BBTw到小瓶和岩石。后在摇臂3分钟,使样品沉淀,除去BBTw用吸管。</ LI>
  8. 重复步骤4.7的两倍。

5,免疫染色

  1. 通过添加5%正常血清稀释于BBTw到微量离心管中阻止样品。摇1小时后,取出块。
    注意:使用正常血清从其中产生的次级抗体的物种。
  2. 稀释的初级抗体,以适当的在5%正常血清/ BBTw溶液工作浓度。
  3. 初级抗体溶液的O /岩石样本n在4℃或至少3小时,在室温(约22℃。
    注:抗体孵育时间和温度可以变化。 O 2 / N孵育在4℃下,或3小时,在室温通常是足够的。然而,两天潜伏期可以提高染色质量,特别是年龄较大的样本,或当低亲和力的第一抗体被使用。较长的孵育,通常进行的,在4℃。类似的考虑,必须使用二次抗体(见5.10)时进行。
  4. 使样品稳定到离心管的底部。抽出一抗用吸管。如果需要保存的抗体以重复利用。
  5. 用1.0mL BBTw的冲洗两次。每次冲洗后,使样品被抽走BBTw用吸管之前结清。
  6. 加入1.0毫升BBTw到小瓶和岩石。后在摇臂3分钟,使样品沉淀,除去BBTw用吸管。
  7. 重复执行步骤5.6的五倍。
  8. 通过添加5%正常血清/ BBTw溶液的微量离心管块样品。摇动30分钟至1小时后除去块。
    注意:不需要这个额外的封闭步骤,但可以提高染色质量的特异性抗体。
  9. 稀释二级抗体,以适当的在5%正常血清/ BBTw溶液工作浓度。
  10. 包裹的微离心管中的铝箔,以减少衰落是由于光照射。中,在4℃下进行12至48小时的二级抗体溶液或至少3小时,在室温(约22℃的岩石样品。
  11. 使样品沉淀到离心管的底部。抽出的第二抗体与吸管。
  12. 用1.0mL PBTw的冲洗两次。每次冲洗后,使样品被画掉PBTw用吸管之前结清。
  13. 加入1.0毫升PBTw到小瓶和岩石。 5分钟后,在摇臂,使样品沉淀,除去PBTw用吸管。
  14. 重复步骤5.13三次。
  15. 可选:添加DAPI稀释1:1,000 PBTw。岩石样品包在铝箔3分钟;然后取出用吸管DAPI的解决方案。冲洗五次1.0毫升PBTw,让样品用吸管取出PBTw前结清。
  16. 加80 - 100微升1,4 - 二氮杂二环[2.2.2]辛烷(DABCO)溶液至离心管中并储存在-20℃。
    注:另甘油类抗褪色剂可以被取代的。

6,分析

  1. 安装样品在载玻片上之前,添加一个额外的5 - 10微升DABCO / P-啉的ylenediamine(PPD)抗褪色溶液至离心管中。
    注:样品可以被添加到载玻片没有清扫。添加到幻灯片的样本量随盖玻片大小。当移取样品上滑动时,移液管尖端可以用剃刀刀片,以防止样品的剪切被切断。它往往是有益的在线样品在便于分析行。可以不需要添加的PPD作为附加抗淬灭剂,但可以防止光致漂白,如果样本被存储长期。
  2. 轻轻将盖玻片上的样品。然后,在安全的地方盖玻片使用指甲油。
  3. 视图上的样品用荧光显微镜。

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Representative Results

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为了证明在晚期胚胎和原位幼虫组织分析超声系免疫的功效,野生型胚胎和幼虫处理用于免疫睾丸,卵巢,和神经组织。样品通过共聚焦显微镜成像和代表性结果示( 图1图2)。结果表明,所描述的协议是有效的用于可视化的形态特征以及各个细胞在原位果蝇发育的晚期胚胎通过早期/中期L3阶段。

结果从睾丸免疫组织化学染色:
睾丸发育是说明协议的效力,因为睾丸成熟是整个幼虫发育动态的一个特别好的系统。成年果蝇精巢形成盘管与一个盲端,那里的生殖干细胞(GSC)的利基位于(见13,14条)。在这个利基,表现,促使排列各地的非有丝分裂的体细胞紧密集群称为枢纽。表现,促使进行不对称分裂,产生了保持锚定于轮毂和一个女儿gonialblast被移离干细胞小生境1 GSC。作为gonialblast不完全分裂,胞质延伸称为fusomes形式中,精原细胞内连接的细胞。经过连续4师,精原细胞开始减数分裂形成精子。

睾丸的形成始于原始生殖细胞(PGC的)和体性腺细胞前体细胞(青稞)的胚胎发育过程中的关联(见15,16的评论)。此关联导致形成的官能GSC小生由胚胎8-10的末端。中期L1时,GSC利基GSC不对称分裂产生精原细胞分化与支fusomes 9。 GSC不对称分裂继续在整个幼虫发展,导致生产更多的精原细胞和性腺规模逐步增加。晚期胚胎和早期/中期L1,L2和L3睾丸代表性图像,免疫染色的生殖细胞,轮毂单元,与fusomes,示出( 图1A-D)。这些图像示出在睾丸中观察到随着时间的推移在性腺大小和生殖细胞分化的动态变化。

结果从卵巢免疫组织化学染色:
成年果蝇卵巢由16-20个体产蛋单元,称为卵巢管(见17,18的评论)。在每一个卵巢管的一端,称为结构germarium含有干细胞小生境。在卵巢管的利基是由未分化的表现,促使细胞和体细胞的两个群体:帽细胞和终端长丝细胞(TFS)。类似睾丸,表现,促使发生不对称分裂产生1 GSC剩下相邻的帽细胞和差分子细胞称为cystoblast,这是推离利基。该cystoblast随后经过4轮细胞分裂,形成种系囊肿,由支fusome互连。每个种系囊肿然后通过毛囊细胞所包围,以产生一个蛋室,其不断成熟,它向下移动的卵巢管的长度。

像睾丸癌,胚胎16,18中首先形成卵巢。多发性卵巢管出现从单一胚胎生殖腺由PGC和青稞的。中期L3,青稞引起的TF前体在卵巢前,而生殖细胞定位到卵巢后和准与SGP来源的混合细胞(集成电路),19-22。由末-L3,TF的细胞分化和组织成在成体干细胞小生境中发现的堆栈,表现,促使和帽细胞被建立,和种系囊肿分化,观察19,20,23。中晚期胚胎和早期/中期L3的卵巢,immunosta代表图像INED对生殖细胞,青稞,集成电路,TF的前体,和fusomes,示出( 图1E,F)。这些图像显示正常的形态和发展进程为他们的年龄。

结果从神经免疫染色:
果蝇中枢神经系统(CNS)的神经干细胞来源的,所谓的神经母细胞(NBS),即产生于胚胎神经上皮(见24,25的评论)。的NB在胚胎和幼虫不对称分裂,产生神经节母细胞(GMC),反过来,产生神经元和神经胶质细胞在成年脑和腹神经索找到。因为幼虫的NB引起大多数成人的神经元,并且可以根据大脑中的位置来区分,幼虫大脑已经成为研究NB的行为和神经分化的重要模式。

在L3的大脑是由两个瓣和一个位于中心的腹神经索24。免疫染色国家统计局,肾小球系膜,未分化的神经元,不成熟的初级神经元和神经胶质细胞中的L3大脑的代表性图像显示( 2A-C)26-30。这些图像显示在脑叶和腹神经索内独特的表达模式强染色。根据安装方向,成像可以用于从背侧表面( 图2A)的脑组织可视化,腹面( 图2B),或在弧矢截面( 图2C)。

染色效率:
我们的代表结果表明,超声处理为基础的免疫程序是通用的。它不仅可以被用来识别特定的细胞类型,但也可以被用于指示特定的蛋白质和细胞器的存在。然而,模糊的结果可能是源于预期的染色效率变化。例如,抗中vasa染至少一种性腺在所有的幼虫73.2%研究(N = 781),而反ELAV的幼虫(N = 115)的86%,染色的大脑。此外,我们观察到染色效率大致成反比的发育阶段。在后期阶段的胚胎,抗中vasa染色性腺89.8%(N = 206),而染色仅在59.8%和幼虫在L2和中期L3,46.9%,分别是本组(n = 132和49)。此外,超声处理的结果在样品损失。当胚胎和存在的最佳超声处理的样品体积的幼虫的数目之前和超声处理后计算,平均样本的41.0%,测定不适于分析(N = 1165)。为了最大限度地提高染色效率,协议应为特定的抗体通过改变出版的抗体浓度或抗体孵育时间进行了优化。

图1
图1。我。mmunostain果蝇生殖腺原位 (AD)的睾丸中晚期胚胎原位图像(台17 /早期L1)通过早期/中期L3幼虫免疫染色用抗瓦萨( 公元 ,红,A',D'单独使用)来检测生殖细胞,抗Fasicilin III(FAS III)和抗1B1(AD,绿色,A'' - D''独自)分别检测轮毂单元及fusomes,和DAPI(AD,蓝色,A' 'D''单),以检测核。(一)第一阶段17 / L1早期睾丸显示在未分化的生殖细胞,新合并枢纽和球形fusomes(B)早​​/中L1睾丸表示球面fusomes的表现,促使局部靠近轮毂和在一些后生殖细胞伸长的指示早期精原细胞分化fusomes(C)早期/中期L2和(EF)的图像中原位晚期胚胎和中期L3幼虫免疫染色用抗瓦萨(EF,红色; E'-F'单独使用)来检测细菌细胞,抗-1B1(EF,绿色,E'' - F''独自)来检测fusomes和体细胞的膜在L3和防交通拥堵(TJ)(EF,蓝色,E' '-F'''独自)来检测体卵巢细胞(E)阶段17 /较早L1卵巢表明体细胞分布于整个性腺和生殖细胞有球形fusomes(F)的早期/中期L3卵巢将稍微放大和膜相关指示TF祖发展的1B-1表达的前体细胞中被检测到。生殖细胞中的L3位于睾丸后,显示球fusomes,和准用TJ / 1B1 朦胧体芯片。所有图片都是Z-突起的4个连续的共聚焦切片与性腺前壁面向左侧。性腺概述和轮毂表示,在睾丸黄色箭头。比例尺为10微米。 请点击这里查看该图的放大版本。

图2
图2: 果蝇神经组织免疫染色原位。早/中期L3幼虫免疫染色用抗ELAV( ,A'独)来检测和未成熟的初级神经元的细胞核,并且无论是抗普洛斯彼罗(优点)(A,绿,A'独)检测细胞核中的GMC和未分化的神经元或反极性反接(回购)( 公元前绿色; B',C'独立)来检测神经胶质细胞。细胞核和DAPI(AC,蓝色,A'''单独)被用于检测所有细胞的细胞核。面向所有图像与前了。矢状切面导向与腹部向左侧(A)背的部分显示了较强的染色优点和ELAV在脑叶(BL)的周边地区和沿腹神经索(VNC)的中线及周边。插图在图A显示的优点和ELAV染色不同的原子核沿中线的VNC(B)腹横截面显示了广泛的回购阳性神经胶质细胞的Wi表达个沿VNC中线和周边强染色(C)矢状切面示回购染色上的VNC的腹侧表面富集。所有图像都是单焦的部分。比例尺为20微米。 请点击这里查看该图的放大版本。

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Discussion

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这个协议提供了一种方法来成功地免疫组织化学染色的目标果蝇胚胎和幼虫组织原位 ,从而省去了清扫。按照现有协议进行染色早期胚胎1,2,3,绒毛膜膜是用50%的漂白剂(次氯酸钠)除去。样品被固定在甲醛和甲醇。因为幼虫角质层导致老年人样品浮起,将整个样品然后通过细胞过滤器传递到保证幼虫保留。样本被存储,如果需要的话,在化学级甲醇。补液后,正确实施超声处理破坏幼虫角质层的完整性。这是角质层形成后,关键的,以便需要的免疫抗体具有足够的渗透。在应用抗体,摇摆样品中有5%的正常血清/ BBTw解决方案可以防止过多的非特异性抗体结合。一级抗体,然后加入,以检测特定的蛋白质EXPRESsed的在靶组织中。洗涤以除去未结合的初级抗体后,结合到荧光第二抗体用于标记结合的第一抗体的位置。分析然后可以用落射荧光或共聚焦显微镜进行。

可能需要进行一些修改,以优化结果在个别情况。特别地,超声功率和进行超声处理的数量可能需要调整,这取决于所用的超声波仪。还可能需要对不同sonicators或者如果不能获得足够的样品适应于上面的示例,以及对溶液体积的超声发生器探针的高度。增加溶液的浊度可作为组织裂解的指标,因此,提供了一种轨距为当超声处理太严重。如果溶液混浊度变高,则实验者应考虑减少进行超声处理的数量,从而增加溶液的体积,提高sonicato的高度ř探针的样品上面,和/或降低超声发生器的功率。

改变,可能还需要在免疫染色协议,以提高图像质量。与大多数免疫程序的信噪比可以通过修改抗体稀释液,时间和样本温度抗体温育,和/或阻断的试剂来改变。而每个抗体必须独立地考虑,特别是相对于抗体稀释,我们发现,孵育在4℃下进行较长时间周期可以提高在超声处理后的染色质量,尤其是对于抗体具有低的信噪比和当较旧的幼虫被检查。在这种情况下,染色质量也可能会受益于轻微减少二次抗体稀释。在这个协议中,我们包括牛血清白蛋白和血清作为封闭试剂,并将样品加入之前的第二抗体,以提高染色质量再阻塞。根据不同的抗体使用D,再阻塞既阻断试剂和包含可以或可以不被要求,以加强染色。如果省略了重新封闭步骤,较长的洗涤和漂洗更可能产生清晰的图像。最后,预吸收的多克隆抗体可以提高信噪比。预吸收孵育所需抗体与再水化的胚胎或在免疫组织化学染色1在使用前幼虫进行。

这表现在我们的代表性成果,超声可清晰靶组织中的原位可视化,从而提供了一个合理的替代组织剥离的免疫方案。清扫很麻烦果蝇胚胎和幼虫因定位,隔离和提取完好的靶组织困难。交替超声处理使组织保持在整个生物体的情况下。由于超声避免滑动和盖SLI的提取和固定组织磷,它更准确地保持在原位形态。实际上,大量的样品可以更快速地对将来的分析进行处理,因为许多生物可同时进行超声处理。

虽然超声提供了一个很好的替代夹层,它必须考虑的限制。超声益破坏幼虫角质层的完整性破坏,但在这个过程中一些样本(见代表性的成果)。漂洗以除去生物碎片,需要以下的超声处理过程,从而可以进一步减小样本大小。此外,免疫染色整个胚胎和幼虫离开嵌入在周围组织中感兴趣的组织。这些周围的组织会弄脏带正电或显示非特异性抗体结合,从而降低了最终的图像质量。最后,染色效率可以是可变的。这种可变性可能依赖于样品,超声处理的功效,和抗体的特异性的年龄。因此,超声巴全贴组织的SED免疫可能并不总是优选的。特别是,夹层为基础的免疫染色可以在后期L3幼虫学习大组织时更有效。此外,超声处理可以剪切早期和中期阶段的胚胎。尽管有这些限制,超声为基础的免疫染色是一种高效的技术,它非常适合于通过早期/中期L3幼虫分析中晚期胚胎各种组织的发展。在我们的实验室中,我们经常使用这个协议来研究性腺形态在果蝇胚胎和幼虫9,10。此外,我们预计,实施这一协议将被证明同样丰硕的研究果蝇等组织的发展和其他生物有保护角质层。

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Acknowledgments

我们感谢露丝雷曼Dorthea戈特谁好心提供瓦萨和交通拥堵的抗体。我们要感谢布卢明顿库存中心在美国印第安纳大学维护提供股票和发展研究杂交瘤细胞银行NICHD的赞助下开发和爱荷华大学维护。我们感谢Wawersik实验室全体成员的意见和支持。这个工作是由梦露学者项目资助(以自动对焦和LB)和美国国家科学基金会授予IOS0823151(以兆瓦)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx) For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C.
Triton 10% For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
PEMS 0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT.
Pipes For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT.
Formaldehyde 37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane CAS 142-82-5 n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol CAS 67-56-1 Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate buffer Tween (PBTw) To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C.
Tween 10% For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw) To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C.
Normal goat serum (NGS) ackson ImmunoResearch Laboratories 005-000-121 To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) CAS: 281-57-9 To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution 1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C.
Apple juice plates To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C.
Tegosept 10% To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C.
Yeast paste ~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C.
Table 2: Staining Materials
DAPI Invitrogen D3571 1:1000, stock at 5 mg/ml.
Rabbit anti-Vasa 1:250, a gift from Ruth Lehmann.
Mouse anti-Fasciclin III Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 7G10 1:10
Mouse anti-1B1 Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 1B1 1:4
Guniea pig anti-Traffic Jam 1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003).
Mouse anti-Prospero Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) Prospero MR1A 1:10
Rat anti-Elav Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 7EBA10 1:30
mouse anti-Repo Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 8D12 1:10
Goat anti-rabbit Alexa546 Invitrogen A11010 1:500
Goat anti-mouse Alexa488 Invitrogen A11029 1:500
Goat anti-guniea pig Alexa633 Invitrogen A21105 1:500
Goat anti-rat Alexa488 Invitrogen A11006 1:500
Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages Hand-made; Genesee Scientific Corporation Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101 Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier Branson Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator probe Branson Model #: 102C (CE) EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter Nalgene 190-25-20 0.2 μm cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc. Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit Nalgene 450-0020 0.2 μm cellulose nitrate membrane filter

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References

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Fidler, A., Boulay, L., Wawersik, M. Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ. J. Vis. Exp. (90), e51528, doi:10.3791/51528 (2014).More

Fidler, A., Boulay, L., Wawersik, M. Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ. J. Vis. Exp. (90), e51528, doi:10.3791/51528 (2014).

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