后期阶段的胚胎和幼虫的超声，促进免疫荧光染色果蝇组织原位

该程序的总体目标是在超声处理后使用荧光显微镜观察或填充 C 2 中的组织。这是通过首先收集胚胎和幼虫样品，然后使用甲醛、庚烷和甲醇固定它们来实现的。第二步是对固定样品进行超声处理，以去除角质层以允许抗体渗透。

接下来，使用一抗和荧光二抗对样品进行免疫染色。最后一步是将样品封片在基于甘油的 Antifa 溶液中。最终，共聚焦或 epi 荧光显微镜用于可视化发育中的组织以及蛋白质表达和定位。

与组织解剖等其他方法相比，该技术的主要优点是它允许对各种发育中的组织进行可视化。通常，刚接触这种方法的人会遇到困难，因为超声处理步骤取决于许多因素来实现最大效率，包括声波探头的正确定位。演示该程序的是 Ashley Fiddler 和 Lauren Bole，他们是我实验室的两位才华横溢的本科生研究人员。

要开始实验，请使用与磷酸盐缓冲液 Triton X 100 或 PBTX 溶液结合的小油漆刷小心地去除收集在琼脂平板上的胚胎。接下来，将装有样品的画笔擦拭到细胞过滤器的内侧脊上。将培养皿盖放在细胞过滤器下方。

然后用含有 PBTX 的喷瓶冲洗画笔和细胞过滤器的壁。将样品转移到过滤器后，将足够的 PBTX 倒入过滤器中，使样品从筛网上抬起。重复此步骤 3 次以去除酵母和苍蝇废物，去除 PBTX。

然后将 50% 漂白剂溶液倒入过滤器中，让幼虫在溶液中静置 5 分钟。接下来，删除解决方案。然后用 PBTX 洗涤样品，让样品在溶液中静置 3 分钟。

重复该步骤五次，擦干细胞过滤器的底部。然后使用与 PBTX 缠绕的画笔将样品转移到含有 1.75 毫升 PEMS 的闪烁瓶中。在通风橱中，加入 250 微升 37% 甲醛和 8 毫升试剂级。

庚烷加入闪烁样品瓶中，并以 200 RPM 的转速摇动样品瓶 20 分钟。然后向闪烁瓶中加入 10 毫升甲醇，不去除水相，并以 500 RPM 的转速剧烈摇晃。摇晃后立即将内容物倒入液体废液容器上的细胞过滤器中。

向样品瓶中加入额外的甲醇，并将内容物流过细胞过滤器。确保已移除整个样品。尝试用实验室组织填充细胞过滤器的底部。

然后用画笔将样品从过滤器转移到含有 0.5 mL甲醇的 1.5 mL 微量离心管中。等待样品沉淀。然后用移液管除去甲醇，并用新鲜的 0.5 毫升等分试样的甲醇代替。

重复此步骤 3 次，最后向试管中加入 0.5 毫升甲醇，然后在零下 20 摄氏度下储存。稍后，从冰箱中取出储存的样品，然后用移液管去除甲醇。然后向试管中加入 1 毫升 50% 甲醇磷酸盐缓冲补间或 PBTW 溶液，摇动试管 3 分钟。

接下来，用 1 毫升 PBTW 冲洗样品两次，让样品沉淀，然后用移液管吸出 PBTW，向样品瓶中加入 1.0 毫升牛血清白蛋白磷酸盐缓冲吐温，或 BBTW，并摇动 3 分钟。让样品沉淀并用移液管去除 BBTW。重复此步骤两次。

注意在不丢失任何样品的情况下去除尽可能多的 BBTW。然后在试管中加入 0.5 毫升 BBTW 并将其置于冰上。接下来，将超声处理液设置为 10% 最大振幅和持续运行时间为 2 秒，将探头尖端放入装满去离子水的 50 毫升锥形管中清洁探头，然后运行超声处理液。

然后用实验室组织干燥超声探针。将探针浸入样品上方 3 至 4 毫米的试管中，然后开始超声处理。然后取出试管并将其置于冰上 30 秒，以防止超声处理过热，并让样品沉淀在试管底部。

超声处理完成后，根据样品年龄的要求重复此步骤。用 1 毫升 BBTW 冲洗样品两次。每次冲洗后，让样品沉淀，然后擦干 BBTW 用移液管向样品瓶中加入 1 毫升 BBTW 并将其放在摇杆上。

三分钟后，让样品沉淀并用移液管去除 BBTW。然后重复此作。步骤 2 次，用 0.5 mL用 BBTW 稀释的 5% 正常血清封闭样品到试管中，并将样品在室温下放在摇杆上 1 小时。

接下来，加入 0.5 毫升一抗溶液，在 4 摄氏度下摇动样品过夜，让样品沉降到试管底部。然后用移液管吸出一抗，并用 1 毫升 BBTW 冲洗两次。向小瓶中加入 1 毫升 BBTW，然后将其放在摇杆上 3 分钟。

然后用移液管取出 BBTW 并重复此作。步骤 5 次，用 5% 正常血清 BBTW 溶液封闭样品，摇动 30 分钟。然后删除溶液。

加入用 5% 正常血清 BBTW 溶液稀释的二抗，并用铝箔包裹试管。然后将样品在 4 摄氏度下摇动过夜。用移液管吸出二抗，然后用 1 毫升 PBTW 冲洗样品两次。

接下来，向小瓶中加入 1 毫升 PBTW，并将其放在摇杆上 5 分钟。然后让样品沉淀并用移液管去除 PBTW。重复此作。

步骤 3 次。向试管中加入 80 至 100 微升 DAB co 溶液，并将其储存在零下 20 摄氏度。最后，要封片样品，请使用 5 至 10 微升的 dab BCO p lene diamine 或 PPD 抗褪色剂。

然后用荧光显微镜观察它。四个共聚焦切片的这些 Z 投影证明了该方案在果蝇发育的胚胎晚期到早期和中期 L 三个阶段可视化 C 2 中的形态特征和单个细胞的有效性。睾丸发育是说明方案功效的一个特别好的系统，因为睾丸成熟在整个幼虫发育过程中是动态的。

这些图像突出显示了红色的生殖细胞和绿色的枢纽细胞和 FU 区，即 L 中三个大脑的单共聚焦切片。用于神经节母细胞、绿色未分化神经元和未成熟神经元以及原代神经元的免疫染色。红色显示脑叶和腹侧神经索中具有不同表达模式的强烈染色，根据安装方向，成像允许从背表面、腹面或矢状横截面观察脑组织。

这种原位 2 技术使生物学家能够探索生物体组织形态发生的器官发育，其中保护性角质层阻止抗体渗透。观看本视频后，您应该对如何对晚期胚胎和幼虫食管样本进行超声处理和免疫染色，以便可视化 C 2 中发育中的组织。不要忘记，与甲醛、庚烷和甲醇一起工作可能非常危险，并采取预防措施，例如在通风橱中工作。

执行此程序时应始终佩戴适当的手套和实验室外套。