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Biology

बटेर बतख काइमेरा का प्रयोग Craniofacial विकास के लिए प्रजाति विशेष के योगदान का आकलन

Published: May 31, 2014 doi: 10.3791/51534
Automatic Translation
1, 1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California at San Francisco

Summary

यह लेख craniofacial विकास के लिए तंत्रिका शिखा और / या अन्य ऊतकों की प्रजाति विशेष के योगदान का परीक्षण करने के लिए तैयार कर रहे हैं कि chimeric भ्रूण उत्पन्न करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है.

Abstract

chimeric भ्रूण की पीढ़ी सेल भाग्य, ऊतक बातचीत, और ऊतकीय और हड्डीवाला भ्रूण की रूपात्मक विकास के लिए प्रजाति विशेष के योगदान का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक और शक्तिशाली तरीका है. विशेष रूप से, chimeric भ्रूण का उपयोग craniofacial परिसर की प्रजाति विशेष आकृति विज्ञान के निर्देशन में तंत्रिका शिखा के महत्व को स्थापित किया है. इस के साथ साथ वर्णित विधि उल्लेखनीय अलग craniofacial आकारिकी के साथ, दो एवियन प्रजातियों, बतख और बटेर का इस्तेमाल करता. यह विधि बहुत craniofacial परिसर में प्रजातियों विशिष्ट पैटर्न की आणविक और सेलुलर विनियमन की जांच की सुविधा. बटेर और बतख chimeric भ्रूण में प्रयोगों से पहले ही तंत्रिका शिखा की मध्यस्थता ऊतक बातचीत और craniofacial कंकाल, मांसलता, और झिल्ली में प्रजातियों विशिष्ट पैटर्न को विनियमित कि सेल स्वायत्त व्यवहार से पता चला है. तंत्रिका शिखा डेरिवेटिव की महान विविधता महत्वपूर्ण क्षमता का पता चलताहड्डीवाला विकास, रोग, और विकास को समझने के लिए बटेर बतख कैमेरिक प्रणाली के भविष्य के लिए आवेदन पत्र.

Introduction

चेहरे का कंकाल बहिर्जनस्तरीय और endodermal उपकला परतों 1-11 से घिरे तंत्रिका शिखा और mesodermal mesenchyme से बना रहे हैं कि कई चेहरे प्रक्रियाओं के विकास और संलयन से विकसित करता है. प्रत्येक प्रक्रिया के भीतर Morphogenetic घटनाओं mesenchyme और आसपास के epithelia 12-16 के बीच स्पष्ट संकेत दे बातचीत से संचालित होते हैं. इन संकेत बातचीत और / या उनके नीचे की ओर effectors के लिए परिवर्तन रोग phenotypes के लिए योगदान और भी craniofacial कंकाल 17, 18 के विकास के लिए प्रासंगिक हो सकता है. इसलिए, ऊतक बातचीत का समय और प्रकृति elucidating चेहरे का कंकाल की विकासात्मक और विकासवादी जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ को बढ़ाने के लिए काफी संभावना है.

ऊतक बातचीत की जांच के लिए chimeric भ्रूण का उपयोग विकासात्मक जीव विज्ञान में एक लंबा इतिहास रहा है. यह दृष्टिकोण हंस Spemann और अपनी प्रयोगशाला ने बीड़ा उठायाविभिन्न उभयचर प्रजातियों के भ्रूण के बीच ऊतकों रोपाई द्वारा भ्रूण "आयोजकों" की खोज की है जो. Spemann जिसका हाथ कौशल विशेष उपकरणों, विशेष रूप से Spemann पिपेट के अपने विकास से पूरित किया गया माइक्रो सर्जरी तकनीक का एक मास्टर था. विक्टर हैम्बर्गर Spemann के नोबेल पुरस्कार के लिए नेतृत्व कि मूल प्रत्यारोपण प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया जब है, जो 1920 के दशक के दौरान फ्रीबर्ग में हंस Spemann की प्रयोगशाला में एक स्नातक छात्र था. हैम्बर्गर 1935 में सेंट लुइस में वाशिंगटन विश्वविद्यालय के लिए चले गए, वह प्रायोगिक भ्रूणविज्ञान 19 के अपने मैनुअल में एक Spemann micropipette बनाने की प्रक्रिया विस्तृत जानकारी दी. आकर्षित किया Noden मैसाचुसेट्स, एमहर्स्ट विश्वविद्यालय के लिए और फिर कॉर्नेल विश्वविद्यालय में जाने के बाद, Noden fabricating और बटेर चिकी काइमेरा को शामिल उसकी शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपण के लिए Spemann micropipettes का उपयोग जारी रखा. 1972 तक वाशिंगटन विश्वविद्यालय में हैम्बर्गर प्रयोगशाला में एक स्नातक छात्र था. और# 160;. एक स्नातक छात्र, 1995-1998 पर कॉर्नेल आकर्षित Noden साथ प्रशिक्षित लेखकों (रिच श्नाइडर) में से एक एक Spemann micropipette बनाने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल हैम्बर्गर और Noden द्वारा लिखित विवरण के आधार पर, और है बनाया बाद में संशोधन शामिल है जबकि श्नाइडर ने.

craniofacial विकास के अध्ययन के लिए और विशेष रूप से तंत्रिका शिखा कोशिकाओं के योगदान को समझने के लिए बटेर चिकी काइमेरा का उपयोग Le Douarin एट अल 20 में समीक्षा, 1970 के दशक में Noden द्वारा और Le Douarin ने बीड़ा उठाया है. यह दृष्टिकोण मोटे तौर पर कई अध्ययनों में और कई अन्य जांचकर्ताओं 1, 4, 5, 21-38 द्वारा अपनाया गया है. विकास और बटेर और लड़की की आकृति विज्ञान के बराबर दरों सेल भाग्य और वंश अनुरेखण के अध्ययन के लिए उन्हें भीतर प्रत्यारोपण आदर्श बनाते हैं. हालांकि, क्योंकि बटेर और लड़की के बीच समानता की, morphological परिवर्तन इंडस्ट्रीज़दाता कोशिकाओं द्वारा uced समझने के लिए मुश्किल हो जाता है. इसके विपरीत, अन्य एवियन कैमेरिक सिस्टम 39-50 भ्रूण anatomically अलग कर उस तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक रास्ते के रूप में घरेलू बतख को शामिल किया है. अधिक विशेष रूप से, बटेर बतख कैमेरिक प्रणाली मेजबान, और इसके विपरीत पर दाता के प्रभाव समझदार के लिए कई लाभ प्रदान करता है. सबसे पहले, बटेर और बतख भ्रूण जीन अभिव्यक्ति (आंकड़े 1 ए और बी) के अंतर डोमेन के लिए परख करने की क्रिया द्वारा पैटर्न गठन का दाता या मेजबान विशिष्ट तंत्र का पता लगाने के लिए एक सीधा रास्ता प्रदान करता है, जो शरीर के आकार और आकार में अलग कर रहे हैं. दूसरा, बटेर और बतख भ्रूण बटेर 17 दिनों में अंडे सेने और बतख 28 दिनों में अंडे सेने के साथ, परिपक्वता की काफी अलग दरें हैं. प्रतिरोपित तंत्रिका शिखा मेजबान वातावरण के भीतर अपने आंतरिक परिपक्वता की दर को बनाए रखता है, और इस प्रकार, अस्थायी जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन, ऊतक बातचीत, ऊतकजनन, और morphogenesis की पहचान संभव है51-57. अंत में, विरोधी बटेर परमाणु एंटीबॉडी (पी.एन. ¢ क्यू) दाता और मेजबान सेलुलर योगदान सर्वत्र बटेर कोशिकाओं में व्यक्त लेकिन बतख कोशिकाओं से अनुपस्थित है कि एक प्रोटीन पहचानने से एक दूसरे से स्थायी रूप से प्रतिष्ठित हो सकते हैं.

Protocol

1. टंगस्टन सुई की तैयारी

  1. रॉड मोड़ नहीं करता है तो तार कटर का उपयोग छमाही में एक टंगस्टन रॉड काटें.
  2. एक 5 borosilicate ग्लास में 3/4 पाश्चर पिपेट का पतला अंत के माध्यम से रॉड धागा.
  3. कांच से बाहर रॉड चिपके का लगभग 3/4 छोड़कर, एक गोंद बंदूक के लिए इस्तेमाल किया गोंद छड़ी है जो "गर्म चिपकने" (HMA), का एक छोटा सा मनका के साथ विंदुक टिप करने के लिए छड़ी पालन करें. HMA जल्दी से गोंद जला और काला धुआं उत्पन्न करने के लिए नहीं ख्याल रख रही है, एक शराब लौ में पिघल जाना चाहिए.
  4. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, एक 45 डिग्री कोण तक पहुँच जाता है (लगभग 1/4 शीर्ष अंत से में) टंगस्टन रॉड की नोक मोड़.
  5. पाश्चर पिपेट होल्डिंग, एक प्रोपेन मशाल की लौ में टंगस्टन रॉड की नोक के बारे में 1/8 जगह है. टिप स्थिर और लौ को बिल्कुल सीधा पकड़ो.
  6. लौ से बाहर सुई खींचो पल tungs के एक छोटे नारंगी दागसुई से दूर दस मक्खियों.

2. Spemann Pipettes तैयार करें

  1. शीघ्र ही घटना परे ग्लास पिघला करने के लिए शुरू होता है जब तक एक लेम्प बर्नर का उपयोग करना, एक पाश्चर पिपेट की संकीर्ण अंत गर्मी. लौ से निकालें और पिपेट सील हो जाता है जब तक टिप खींच. लगभग 0.7-1.0 मिमी के एक आयुध डिपो है कि पतला भाग के एक हिस्से बनी हुई है कि सुनिश्चित करें. घटना से लगभग 4 सेमी सील बंद अंत तोड़ो.
  2. पिपेट की विस्तृत (खुला) समाप्त करने के लिए रबर टयूबिंग की लगभग 2 फुट (60 सेमी) संलग्न करें. कोई हवा पाश्चर पिपेट का पतला भाग के माध्यम से पारित कर सकते हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए रबर टयूबिंग के दूसरे छोर पर उड़ा.
  3. एक संलग्न पेंसिल लौ मशाल के साथ एक प्रोपेन ईंधन सिलेंडर का प्रयोग, सिर्फ घटना के शुरू नीचे पिपेट के एक तरफ एक अंडाकार क्षेत्र गर्मी. दबाव की एक मामूली राशि (lette की शुरुआत कहने की जरूरत दबाव के लगभग राशि के साथ रबर टयूबिंग के माध्यम से बहुत धीरे और लगातार हवा में उड़ाबातचीत के स्तर पर आर "पी"). गिलास एक तरफ नरम हो जाता है और बाहर बकसुआ शुरू होता है, जल्दी से लौ से पिपेट हटाने और रबर टयूबिंग के माध्यम से कठिन और स्थिर झटका. इस कांच के गर्म भाग जो ठीक है, पॉप हो सकता है कि एक सॉसेज के आकार का बुलबुला फार्म करने के लिए कारण होगा. बुलबुला बहुत छोटा है, पिघलने और फिर कांच उड़ाने का प्रयास करें. गिलास में अंतिम खुली खिड़की वाइड लांग (12.7 मिमी) में 0.5 से (6.35 मिमी) में 0.25 के आसपास होना चाहिए.
  4. पतला अंत ओर इशारा करते हुए ऊपर की तरफ, धीरे पिपेट में प्रवेश करने से कांच के टुकड़े को रोकने के लिए ट्यूबिंग के माध्यम से उड़ाने जबकि एक गिलास अपशिष्ट कंटेनर में बुलबुला परिमार्जन.
  5. प्रोपेन लौ का उपयोग करना, बुलबुला और आग पोलिश खुली खिड़की के पक्षों के शेष किनारों से दूर जला. पिपेट की शाफ्ट पिघल नहीं ख्याल रखना.
  6. एक हीरा बिंदु पेंसिल का उपयोग करना, खिड़की से (30 मिमी) में लगभग 1.25 पिपेट का पतला अंत में स्कोर और टिप बंद तोड़नेसंदंश के साथ पिपेट उद्घाटन सफाई से (टूटी या असमान सुझावों के साथ त्यागें pipettes) काटा जाता है कि इतनी.
  7. संदंश का प्रयोग और तुला भाग एक ऊर्ध्वाधर विमान में इतना है कि एक शराब बर्नर से एक लौ के किनारे लगभग 60 डिग्री के कोण को सिरे से (9.5 मिमी) में पिपेट 0.375 के संकीर्ण भाग मोड़ जब खिड़की खोलने बाएं हाथ के उपयोग के लिए दाएं हाथ के उपयोग और 11:00 के लिए 1:00 स्थिति में है. इस कदम का सबसे अच्छा एक मसौदा मुक्त बाड़े में आयोजित किया जाता है.
  8. आग पॉलिश एक विदारक खुर्दबीन के नीचे शराब लौ का उपयोग टिप. टिप बंद बल्कि दौर उद्घाटन रखने के लिए और किसी भी कसना बिना सुचारू करने के लिए नहीं भूलें.
  9. , रबर टयूबिंग की एक में 1 (25 मिमी) टुकड़ा काट 70% इथेनॉल के साथ ट्यूबिंग का टुकड़ा स्प्रे, और खिड़की खोलने पूरी तरह से कवर किया जाता है जब तक पिपेट की शाफ्ट पर टयूबिंग स्लाइड. इस Spemann पिपेट की "डायाफ्राम" के रूप में कार्य करता है.
  10. एक लेटेक्स रबर 2 मिलीलीटर बल्ब रखेंपिपेट का खुला तल पर. बल्ब Spemann पिपेट में नकारात्मक दबाव बनाए रखता है.
  11. एक Spemann पिपेट का उपयोग अभ्यास एक खुर्दबीन के नीचे एक और में एक उल्लेखनीय स्थान को एक पेट्री डिश में एक उल्लेखनीय स्थान से व्यास में लगभग 100-200 मीटर की क्रोमैटोग्राफी मोती स्थानांतरित करने के लिए.
  12. Spemann पिपेट साफ करने के लिए, तल पर कपास या धुंध के साथ खड़े हैं और आसुत जल और कांच के बने पदार्थ डिटर्जेंट से भरा एक लंबा बीकर में, नीचे टिप, रबर बल्ब और जगह पिपेट हटा दें.

3. अंडे जीवाणुरहित और सेते

  1. 70% इथेनॉल के साथ अंडे को साफ कर लें और प्लास्टिक अंडे की ट्रे पर अंडे जगह है.
  2. 37.5 डिग्री सेल्सियस और 85-87% पर एक गर्म इनक्यूबेटर में अंडे सेट करें.
  3. वे HH9.5, बटेर और बतख के लिए 48 घंटे के लिए लगभग 26 घंटे तक पहुंचने तक अंडों को सेते हैं.

4. खिड़की अंडे

  1. भीतरी खोल एम पंचर नहीं ख्याल रख रही है, संदंश के साथ अंडे के ऊपर से बाहरी कवच ​​का एक छोटा सा टुकड़ा निकालेंembrane.
  2. 1 इंच सुई द्वारा एक 18 जी के साथ एक सिरिंज का प्रयोग, अंडे की सबसेसंकरेमें नोक पर एक छेद प्रहार और अंडे की सफ़ेदी के लगभग 1-2 एमएल वापस ले लें.
  3. खोल में छेद और पंचर निशान पर पारदर्शी टेप रखें.
  4. घुमावदार कैंची का उपयोग (पारदर्शी टेप के माध्यम से) अंडे के ऊपर सतह के साथ एक "खिड़की" कट.

5. भ्रूण कल्पना और सर्जरी के लिए तैयार

  1. एक गिलास छड़ी का प्रयोग, धीरे भ्रूण से अधिक तटस्थ लाल की एक छोटी राशि (हांक बीएसएस में 0.02 मिलीग्राम / छ) ब्रश.
  2. पीतक झिल्ली कट और एक लौ तेज टंगस्टन सुई का उपयोग भ्रूण पर खींच.
  3. खिड़की पर पारदर्शी टेप रखकर अंडा फिर से सील.

6. दाता भ्रूण से दाता ऊतक अलग करें

  1. दाता भ्रूण का अंडा पर खिड़की से टेप निकालें.
  2. दाता भ्रूण की आसन्न बाहरी झिल्ली से तंत्रिका गुना में कटौती करने के लिए, सिड दोनों पर slits बनाने(उपरोक्त वर्णित के रूप में निर्मित) एक लौ तेज टंगस्टन सुई का उपयोग न्यूरल ट्यूब की तों,.
  3. फिर, भ्रष्टाचार के वांछित पूर्वकाल और कूल्हों के स्तर पर न्यूरल ट्यूब में कटौती और न्यूरल ट्यूब के बाकी हिस्सों से भ्रष्टाचार अलग.
  4. एक Spemann पिपेट या micropipette के अन्य प्रकार का उपयोग कर दाता भ्रूण से तंत्रिका गुना निकालें.
  5. फिर, मेजबान अंडे पर खिड़की से टेप हटाने और प्रत्यारोपण प्राप्त होगा कि न्यूरल ट्यूब के क्षेत्र से सटे मेजबान भ्रूण के साथ दाता तंत्रिका गुना करने के लिए जगह Spemann पिपेट का उपयोग करें.

7. मेजबान ऊतक अलग करें और दाता ऊतक प्रत्यारोपण

  1. दाता के साथ किया, के रूप में मेजबान भ्रूण की न्यूरल ट्यूब से तंत्रिका गुना से अलग करें. दाता ऊतक के रूप में समान आकार की एक भ्रष्टाचार दूर करने के लिए ध्यान रखना.
  2. धीरे दूर दूर भ्रूण से इस मेजबान ऊतक धक्का.
  3. फिर, एक कुंद टंगस्टन सुई या एक मील के गोल टिप के साथcropipette, धीरे उचित Antero पीछे और dorso-उदर झुकाव को बनाए रखने, दाता तंत्रिका मेजबान न्यूरल ट्यूब में गुना चाल है. भ्रष्टाचार पक्षों के साथ में tucked है सुनिश्चित करें लेकिन प्रहार या अंतर्निहित ऊतकों को नुकसान नहीं करना सुनिश्चित करें. मूल उन्मुखीकरण नोट के तटस्थ लाल से दाता ऊतक या अंतर धुंधला में कोई विषमता ट्रैक रखने में मदद करें. हम भी फोटो दस्तावेज़ के साथ excised ऊतक, साथ ही कल्पना के साथ दाता भ्रूण तुरंत सर्जरी के बाद.
  4. मेजबान भ्रूण सुखाना के लक्षण दिखाता है, तो बाँझ खारा अंडे में जोड़ा जाना चाहिए.
  5. अब, ध्यान से फिर से सील और अंडे लेबल, और धीरे chimeric भ्रूण विश्लेषण के लिए वांछित चरण के लिए विकसित कर सकते हैं, जहां एक उच्च नमी इनक्यूबेटर (70-80%) के लिए यह वापसी.

काइमेरा के 8. संग्रह

  1. ताजा बना ठंड सेरा लगानेवाला में chimeric भ्रूण लीजिए और तुरंत एक प्रबंधक की भूमिका पर उन्हें जगह सुनिश्चित करेंएक हे / एन निर्धारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर cker. यह विरोधी बटेर एंटीबॉडी के साथ बटेर कोशिकाओं के अधिक संवेदनशील पता लगाने के लिए अनुमति देगा.
  2. जीन अभिव्यक्ति RT-qPCR के माध्यम से विश्लेषण के लिए, पूर्व शाही सेना निकासी के लिए तरल नाइट्रोजन में सीधे भ्रूण फ्रीज.

Representative Results

पहले आगे के विश्लेषण के लिए, प्रत्यारोपण की दक्षता assayed किया जाना चाहिए. ऊतकीय के लिए, रूपात्मक, या जीन अभिव्यक्ति के ऊतकों के नमूनों पर विश्लेषण करती है, बटेर कोशिकाओं 36 के रूप में वर्णित क्यू ¢ पी.एन. एंटीबॉडी का उपयोग कर immunohistochemistry द्वारा पता लगाया जाना चाहिए. शाही सेना के विश्लेषण के लिए, ब्याज के ऊतकों को प्रजाति विशेष योगदान पीसीआर आधारित रणनीति 58 उपयोग कर की गणना की जा सकती है. प्रत्यारोपण की प्रभावकारिता मान्य किया गया है, के बाद आगे रूपात्मक या आणविक परिणाम उपायों काइमेरा में मूल्यांकन किया जा सकता है. दाता तंत्रिका शिखा कोशिकाओं और उचित ऊतकजनन और craniofacial परिसर के morphogenesis कायम करना है कि आसपास के मेजबान व्युत्पन्न ऊतकों के बीच बातचीत पहले से बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है. विशेष रूप से, तंत्रिका शिखा mesenchyme चेहरे की प्रजाति विशेष आकारिकी 7, 13, 51, 59, पंख पैटर्न 52, मांसपेशियों पैटर्न 56 निर्देशन ऊपर>, और उपास्थि 53, मेजबान जीन अभिव्यक्ति के नियमन के माध्यम से 57. उदाहरण के लिए, तंत्रिका शिखा mesenchyme अस्थायी BMP4 अभिव्यक्ति 55 को विनियमित करने से जबड़ा में जब हड्डी रूपों पैदा करती है.

हाल ही में, जांच बहुत जल्दी craniofacial विकास में होने वाली ऊतक बातचीत पर केंद्रित है. इस संबंध में, बटेर बतख काइमेरा उपयोग प्रयोगों मेजबान भ्रूण रूपात्मक सीमाओं के निर्धारण से तंत्रिका शिखा प्रवास को प्रभावित दिखाया है. यही कैमेरिक quck भ्रूण में, दाता बटेर तंत्रिका शिखा कोशिकाओं एक बतख की तरह पैटर्न (चित्रा -1) में मेजबान बतख अधोहनुचाप में विस्थापित है. तंत्रिका शिखा आबादी के आकार के इस होस्ट योगदान के बावजूद, दाता तंत्रिका शिखा बटेर की तरह आकार और आकृति (चित्रा 1E) में है कि एक जबड़े कंकाल उत्पन्न करने के लिए जारी है.

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चित्रा 1. बटेर बतख chimeric प्रणाली. पैदा करने के लिए (ए) बटेर और (बी) बतख खोपड़ी के आकार और आकार में काफी मतभेद प्रदर्शन, और इस प्रकार, आदर्श (Tokia एट अल. 56 से संशोधित) craniofacial विकास का अध्ययन करने के लिए एक chimeric प्रणाली का उपयोग के लिए उपयुक्त हैं. (सी) प्रायोगिक डिजाइन मंच से मिलान HH9.5 बटेर और बतख भ्रूण से एकतरफा कैमेरिक quck भ्रूण. तंत्रिका गुना बटेर भ्रूण के एक तरफ से निकाल दिया जाता है और बतख भ्रूण में प्रत्यारोपित तंत्रिका गुना के एक बराबर टुकड़ा के बाद हटा दिया गया है. (डी) बटेर दाता कोशिकाओं (हरा) एक विरोधी बटेर एंटीबॉडी (क्यू का उपयोग काइमेरा में पीछा किया जा सकता HH12 chimeric भ्रूण के उदर दृश्य में दिखाया गया है) पी.एन. ¢. (एफ) HH38 पर quck mandibles में, बटेर मेकेल दाता व्युत्पन्न7, एस उपास्थि बड़ा और घुमावदार है जो contralateral बतख मेजबान व्युत्पन्न मेकेल उपास्थि, के लिए मनाया कि तुलना में कम और straighter है. पुनर्प्रकाशित Tokita एट अल., देव. बायो. 306, 377 (2007) Elsevier से अनुमति के साथ.

Discussion

तंत्रिका शिखा भ्रूण भर में बड़े पैमाने पर प्रवास करती है और craniofacial कंकाल है कि योगदान करने chondrocytes और अस्थिकोरक सहित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं,, में अंतर किया कि एक क्षणिक भ्रूण सेल की आबादी है. बटेर बतख कैमेरिक प्रणाली में तंत्रिका शिखा रोपाई craniofacial कंकाल के विकास को विनियमित कि ऊतक बातचीत और संकेत दे रास्ते के बारे में हमारी समझ के लिए बहुत योगदान दिया. हालांकि, यह भी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, adipocytes, melanocytes, श्वान कोशिकाओं, और न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए तंत्रिका शिखा की विशाल क्षमता को देखते हुए, बटेर बतख कल्पना प्रणाली विशेष रूप से स्टेम कोशिका जीव विज्ञान के तेजी से प्रगति के साथ संयोजन के रूप में भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए जबरदस्त क्षमता है और पुनर्योजी दवा. बटेर और बतख दोनों वाणिज्यिक नस्ल प्रजातियां हैं, अपेक्षाकृत सस्ती निषेचित अंडे की एक तैयार की आपूर्ति खेतों की एक किस्म से उपलब्ध है. इस प्रकार, इस तकनीक researc के लिए सुलभ होना चाहिएउसका बजट और सुविधा अंतरिक्ष की एक विस्तृत श्रृंखला के भीतर ऑपरेटिंग.

इस तकनीक बहुत शक्तिशाली है हालांकि, कई सीमाएं रहते हैं. अन्य शल्य चिकित्सा तकनीक की तरह, बटेर बतख काइमेरा की गुणवत्ता और व्यवहार्यता शोधकर्ता की शल्य चिकित्सा कौशल पर भरोसा करते हैं, और इसलिए, इस तरह उन का उपयोग माउस के रूप में अन्य मॉडलों की तुलना में प्रयोगों के बीच अधिक अंतर और इंट्रा व्यक्तिगत परिवर्तन नहीं होगा आनुवंशिकी. इसके अलावा, reproducibility और प्रत्येक प्रत्यारोपण की सफलता के लिए योगदान देता है कि विकास और व्यक्तिगत भ्रूण के चरणों की दरों में भिन्नता भी है. एवियन भ्रूण भी निर्जलीकरण के लिए बहुत जल्दी हो जाता है और शल्य चिकित्सा के दौरान इसलिए महत्वपूर्ण कदम एक न्यूनतम करने के लिए खुर्दबीन के नीचे, कम समय प्रकाश के स्तर रखने में शामिल हैं, जितना संभव हो उतना टेप के साथ बंद अंडे, और पोस्ट ऑपरेटिव इनक्यूबेटर में उच्च आर्द्रता शुष्क्ीकरण से बचें.

काइमेरा की व्यवहार्यता, यू के संदर्भ मेंइन प्रतिशत पुराने संग्रह चरण में कमी कर सकते हैं, हालांकि sually के बीच 50-75%, जीवित रहते हैं. सर्जरी के एक ठेठ 4-6 घंटा सत्र में, एक अनुभवी सर्जन 10-15 काइमेरा उत्पन्न कर सकते हैं. प्रत्यारोपण की सफलता भी उपकरण की गुणवत्ता पर बहुत निर्भर करता है. अच्छे उपकरण अधिक संगत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों को जन्म दे. टंगस्टन सुई बनाने के लिए एक प्रोपेन मशाल का उपयोग करना अत्यंत तेज सुइयों किए जाने के लिए अनुमति देता है. यह लौ के आकार को नियंत्रित करता है क्योंकि इस्तेमाल किया मशाल का प्रकार एक बड़ा फर्क पड़ता है. Electrolytic sharpening भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस दृष्टिकोण के रूप में भी तेज सुइयों के उत्पादन को बंद नहीं आती. सुई सीधे बनाया जा सकता है तो बजाय spooled तार की टंगस्टन छड़ का प्रयोग करें.

Spemann micropipette, समय लेने वाली और बनाने के लिए मुश्किल है, ऊतक स्थानांतरण के लिए एक आदर्श उपकरण है. पिपेट अलग आकार के खुलने के साथ अनुकूलित किया जा सकता है, और बार बार इस्तेमाल किया जा सकता है. Usin लिए एक महत्वपूर्ण कारकगा Spemann micropipette भ्रूण की सतह को टिप को छूने से पहले पिपेट में कुछ तरल पदार्थ है. संपर्क भ्रूण से अधिक meniscus के साथ किया जाता है जब तरल पदार्थ के कुछ हमेशा बाहर प्रवाह होगा. थोड़ा डायाफ्राम पर दे धीरे पिपेट में दाता भ्रष्टाचार ऊतक बेकार है जबकि डायाफ्राम पर दबाव, द्रव और भ्रष्टाचार ऊतक बहुत ठीक अलग हो सकता है की अनुमति देता है. डायाफ्राम पर सकारात्मक दबाव का एक सा बनाए रखने के स्थानांतरण के दौरान पिपेट की नोक पर दाता भ्रष्टाचार ऊतक रहता है, और डायाफ्राम पर एक छोटे से अतिरिक्त दबाव दाता भ्रष्टाचार ऊतक जानबूझ मेजबान में रखा जा सकता है.

भंडारण और नसबंदी के दौरान Spemann पिपेट की सुरक्षा के लिए, व्यापक अंत से बल्ब हटा ध्यान बल्ब में पतला टिप डालें. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ शीर्ष कवर, और सर्जरी से पहले आटोक्लेव, एक गिलास टेस्ट ट्यूब में Spemann पिपेट रखें. कई pipettes फिर रहे हैं के बादसर्जरी के लिए फिर से निष्फल होने के लिए ady, pipettes पलटना आसुत जल और कांच के बने पदार्थ द्रव्य का एक ही समाधान में एक फोड़ा करने के लिए लगभग उन्हें गर्मी, और फिर आसुत जल के साथ बार बार कुल्ला. उनके व्यक्तिगत ट्यूबों में आटोक्लेव pipettes. वे अन्धेरा और कठोर हो जाते हैं जब डायाफ्राम और रबर बल्ब रूपों कि रबर टयूबिंग कई sterilizations के बाद बदला गया या किया जाना चाहिए.

इस प्रोटोकॉल के घटकों में से कई खतरनाक उपकरण शामिल है. उदाहरण के लिए, एक Spemann Micropipette बनाने के लिए प्रक्रिया तीन लपटों के प्रकार के साथ ही ताप, खींच उड़ाने, झुकने, काटने, और कांच चमकाने शामिल है. इसलिए, उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहन ऐसे चश्मे के रूप में सुरक्षा बढ़ जाती है और एक प्रयोगशाला कोट महत्वपूर्ण है कि. साथ ही, कई लोगों से ग्रस्त हैं, या,, अंडा एलर्जी विकसित अंडे से निपटने जब हमेशा दस्ताने का उपयोग करने की क्षमता है क्योंकि. मन में इन सावधानियों, बटेर बतख कैमेरिक प्रणाली के साथ मैंकई भविष्य आवेदन किया है कि एसए, सुरक्षित, कुशल, और अपेक्षाकृत सुलभ विधि.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम एक डेंटल के राष्ट्रीय संस्थान और craniofacial रिसर्च (NIDCR) F32 अनुदान (DE021929) JLF करने और रास के लिए एक NIDCR R01 अनुदान DE016402 द्वारा वित्त पोषित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS TEK TEKZR114
Hank’s BSS w/o phenol red Invitrogen 14025-092
Neutral Red Sigma Aldrich N4638-5G 0.22 µm filter-sterilized
18 G Needles BD 305195
5 ml syringe BD 309646
No. 5 Dumont forceps Fine Science Tools 11252-20
Straight Scissors Fine Science Tools 14028-10
Curved Scissors Fine Science Tools 14029-10
Spemann Pipette Hand-made in lab
Egg Holder Glass ashtray and modeling clay
Alcohol Burner Fisher 04-245-1
Transparent Tape 3M Scotch 600
Glass Stirring Rod Fisher 11-380C Tip is narrowed and rounded using a flame
Tungston wire (0.004 x 3 inches) A-M Systems 7190 Tip is flame-sharpened in a propane torch
Bunsun Burner Fisher Scientific S49117
Pasteur Pipette Fisherbrand 22-183-632 9-inch (229 mm)
Rubber Tubing Fisher Scientific 14-178C amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 in/1.6 mm; O.D.: 0.375 in/9.5 mm; I.D.: 0.25 in/6.4 mm
Propane Fuel Cylinder BernzOmatic UL2317 TX-9 with torch style "A" with a screw-on brass "pencil flame" torch
Diamond Point Pencil Fisher Scientific 22-268912
Rubber Bulbs Fisherbrand S32325

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References

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बटेर बतख काइमेरा का प्रयोग Craniofacial विकास के लिए प्रजाति विशेष के योगदान का आकलन
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Fish, J. L., Schneider, R. A.… More

Fish, J. L., Schneider, R. A. Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras. J. Vis. Exp. (87), e51534, doi:10.3791/51534 (2014).

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