Summary
שיטה מתוארת לניקוי יעיל של חלבוני תאום סטרפטוקוקוס מתויג היתוך והמתחמים הספציפיים שלהם על streptavidin הותאם שרף (סטרפטוקוקוס-Tactin) קוולנטית צולבים עם Bis suberate (sulfosuccinimidyl) (BS3). יש שיטת היתרונות של מהירות מהירה, התאוששות חלבון מטרה טובה וטוהר גבוהים, והוא תואם את ניתוח שלאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה.
Abstract
טיהור זיקה של חלבוני היתוך סטרפטוקוקוס מתויגים על שרפים נושאים streptavidin מהונדס (סטרפטוקוקוס-Tactin) הפכה לשיטה נפוצה לבידוד של קומפלקסי חלבונים בתנאים פיסיולוגיים. יש חלבוני היתוך המכילים שני עותקים של סטרפטוקוקוס התג השני, מיועדים תאום סטרפטוקוקוס תג או SIII תג, היתרון של זיקה גבוהה יותר לסטרפטוקוקוס-Tactin בהשוואה לאלו המכילים סטרפטוקוקוס תג אחד בלבד, ובכך מאפשרים טיהור חלבון יעילה יותר. עם זאת, יתרון זה קוזז על ידי העובדה שelution של חלבונים מתויגים תאום סטרפטוקוקוס עם ביוטין עשוי להיות חלקי, מה שמוביל להחלמה חלבון נמוכה. ההתאוששות ניתן לשפר באופן דרמטי באמצעות elution denaturing עם נתרן גופרתי dodecyl (SDS), אבל זה מוביל ללדגום זיהום עם סטרפטוקוקוס-Tactin שוחרר מהשרף, מה שהופך את assay עולה בקנה אחד עם ניתוח proteomic במורד הזרם. כדי להתגבר על מגבלה זו, פיתחנו שיטה לפיה tetramer מצמידים שרף של סטרפטוקוקוס-Tactinהוא התייצב לראשונה על ידי קוולנטיים cross-linking עם Bis suberate (sulfosuccinimidyl) (BS3) והשרף צולבים וכתוצאה מכך לאחר מכן נעשה שימוש כדי לטהר מתחמי חלבון מטרה בשלב טיהור אצווה אחת. elution יעיל עם SDS מבטיח התאוששות חלבון טובה, ואילו היעדר זיהום סטרפטוקוקוס-Tactin מאפשר ניתוח חלבון במורד הזרם על ידי ספקטרומטריית מסה. כהוכחה של מושג, שאנו מתארים כאן פרוטוקול לטיהור של חלבון נגיפי SIII מתויג VPG-Pro מגרעינים של נ 'נגוע בנגיף צמחי benthamiana באמצעות שרף polymethacrylate סטרפטוקוקוס-Tactin צולבים עם BS3. אותו הפרוטוקול יכול לשמש כדי לטהר את כל חלבון מתויג התאום סטרפטוקוקוס של עניין ולאפיין השותפים המחייבים הפיסיולוגיים שלו.
Introduction
בשנים האחרונות, טכנולוגית סטרפטוקוקוס התג הפכה בשימוש נרחב בתחומים רבים של מחקר ביו, כוללים פרוטאומיקה וביולוגיה מבנית. טכנולוגיה זו חלבון הטיהור, אשר מסתמכת על השילוב של חלבונים רקומביננטי לפפטיד סטרפטוקוקוס תג קצר, התבגרה עם כניסתו של מטריצות זיקה נשאו סטרפטוקוקוס-Tactin, גרסה מהונדסת גנטי של streptavidin עם קיבולת מחייב-peptide משופרת. 1, 2 חלבוני היתוך המכילים שני עותקים של סטרפטוקוקוס התג השני, מיועד תאום סטרפטוקוקוס תג או SIII תג, תערוכת זיקה גבוהה יותר עבור מטריצות סטרפטוקוקוס-Tactin מאלה המכילים סטרפטוקוקוס תג אחד בלבד, מה שמבטיח טיהור יעילה יותר של החלבונים רקומביננטיים ו שותפיהם הקשורים המחייבים. עם זאת, הזיקה גבוהה יותר של חלבונים מתויגים תאום סטרפטוקוקוס לסטרפטוקוקוס-Tactin יש גם החסרון שלה. elution התחרותי של כגון חלבונים עם ביוטין העודף עשוי להיות חלקי, מה שמוביל לירידה בתשואה של חלבון מטרה. מ 'חלופת עפרות יעילה היא elution עם SDS, אבל זה מוביל לזיהום מדגם לא רצוי עם סטרפטוקוקוס-Tactin שוחרר מהשרף, מה שהופך את assay עולה בקנה אחד עם ניתוח proteomic. מאמר זה מציג טכניקה כדי להתגבר על מגבלה זו על ידי הייצוב הראשון tetramer מצמידים השרף של סטרפטוקוקוס-Tactin ידי cross-linking הכימי ולאחר מכן באמצעות SDS לelute חלבונים מתויגים תאום סטרפטוקוקוס ומתחמים הקשורים בם מהשרף צולבים וכתוצאה מכך. לפיכך, תשואת חלבון מספקת יכולה להיות מושגת ללא זיהום מדגם עם סטרפטוקוקוס-Tactin, ובכך לאפשר ניתוח נוסף על ידי ספקטרומטריית מסה.
השיטה מתאימה לטיהור של כל חלבון היתוך רקומביננטי עם משטח חשוף SIII תג 3 או תאום סטרפטוקוקוס תג (WSHPQFEK רצף חומצות אמינו (GGGS) 3 WSHPQFEK וSAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, בהתאמה). החלבון יכול להיות מ, חיה או צמח מקור חיידקים ויכול להיות מבודד משני תאים בסך הכלlysate או שבריר אברון מועשר. כדוגמא, אנו מתארים כאן הטיהור של חלבון SIII מתויג VPG-Pro של וירוס תפוחי אדמה (PVA) 4 מהחלק הגרעיני של צמחי benthamiana Nicotiana נגועים ב-PVA. שבריר הגרעיני היה מבודד כפי שתואר בעבר 5, בשינויים הבאים: תאים לא טופלו בפורמלין, בוטיראט נתרן הוחלף בכל המאגרים עם פלואוריד הנתרן 5 מ"מ, מעכבי פרוטאז שלמים הוחלף עם PMSF, בחילוץ טריטון X-100 ריכוז חיץ # 2 הונמך ל0.3% (v / v) והגלולה הגרעינית שהושגה על ידי צנטריפוגה באמצעות כרית סוכרוז (# חיץ חילוץ 3) הייתה מושעה ב1.45 מיליליטר של חיץ מחייב טרום צונן ומסובב ל1.5 שעות ב 4 ° C. התמצית הגרעינית וכתוצאה מכך המכילה חלבון הפיתיון מתויג-SIII ומתחמים קשורים (מדגם חלבון פיתיון) הייתה מעובד על פי הפרוטוקול המפורט להלן (ראה סעיף 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cross-linking של סטרפטוקוקוס-Tactin Polymethacrylate שרף עם Bis (sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)
- לאזן microtube אטום אחד המכיל 2 מ"ג BS3 צולב מקשר לטמפרטורת חדר. זהירות: BS3 הוא חומר מסוכן. יש להשתמש בכפפות ומשקפי מגן.
- שרף polymethacrylate resuspend סטרפטוקוקוס-Tactin (השעיה 50% ב100 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA; 150 mM NaCl) על ידי קצר נמרץ רועד ולהעביר 600 μl של ההשעיה באופן מיידי לעמודת ספין באמצעות פיפטה קצה עם הסוף נותק.
- צנטריפוגה ב 1,500 XG במשך 30 שניות בטמפרטורת חדר. מחק את הזרימה דרך ולהוסיף 450 μl של בופר פוספט (PBS) לעמודה.
- חזור על השלב הקודם 2 יותר פעמים כדי להחליף לחלוטין את חיץ טריס עם PBS ולהשאיר את השרף ב430 μl של PBS מותאם pH 8.0 לאחר צנטריפוגה שעברה.
- לנקב את נייר הכסף של microtube עם BS3 עם קצה פיפטה מכיל 1001; ליטר של מים ultrapure. ממיסים את אבקת BS3 במים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה ולהוסיף מייד 20 μl של הפתרון לעמודת הספין. הריכוז הסופי של BS3 בתגובת cross-linking הוא ~ 1.2 מ"מ.
- סובב את העמודה ל30 דקות בטמפרטורת חדר. בדוק שהשרף הוא מעורב כראוי עם פתרון BS3.
- כדי להרוות את התגובה, להוסיף 6 μl של 3M טריס-HCl, pH 7.5 ולסובב את העמודה במשך דקות 15 אחר בטמפרטורת חדר.
- צנטריפוגה ב 1,500 XG במשך 30 שניות בטמפרטורת חדר. מחק את הזרימה דרך וresuspend השרף צולבים ב450 μl של טריס שנאגרו מלוח עם Tween 20 (TBST). חזור צנטריפוגה ולשטוף מדרגות שתי פעמים נוספות. בשלב האחרון, resuspend השרף ב450 μl של TBS.
- מעביר את ההשעיה השרף לצינור טרי באמצעות קצה פיפטה עם הסוף נותק. Resuspend השרף עזב בעמודה עם עוד 450 μl של TBS ולהעביר לאותו צינור. ה חזורדואר השלב אחרון פעם נוספת כדי להבטיח העברה מקסימלי של השרף מהעמודה לצינור.
- בואו הצינור לעמוד 10 דקות בטמפרטורת חדר ולהתאים את עוצמת הקול ל600 μl ידי הסרת TBS העודף. השרף מוכן לשימוש מיידי (המומלץ) או יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס, ללא הקפאה.
2. עקידת חלבון הפיתיון מתויג-Twin-סטרפטוקוקוס וAssociated מכלולים לסטרפטוקוקוס-Tactin Polymethacrylate שרף הצולב
- צנטריפוגה 1 מיליליטר של מדגם חלבון פיתיון בחיץ מחייב ב17,000 XG 10 דקות ב 4 ° C ולהעביר את supernatant לצינור טרי.
- כדי למזער מחייב של חלבוני biotinylated אנדוגני לשרף סטרפטוקוקוס-Tactin, להוסיף avidin לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל ולסובב ל15 דקות ב 4 ° C.
- אם השרף צולבים משלב 1.10 היה מאוחסן במשך תקופה ארוכה של זמן ב 4 ° C, לאסוף את השרף על ידי צנטריפוגה ב XG 400 עבורדקות r 1 ב 4 ° C, להשליך supernatant ולשטוף את השרף עם 1 מיליליטר של TBST. חזור צנטריפוגה ולשטוף על שלבים עוד פעמיים, תחילה עם TBST ולאחר מכן עם TBS. צנטריפוגות הצינור ב XG 400 דקות 1 על 4 מעלות צלזיוס ולהתאים את הנפח המקורי על ידי הסרת TBS העודף.
- Resuspend שרף סטרפטוקוקוס-Tactin צולבים על ידי vortexing. מייד להוסיף 50 μl של ההשעיה השרף לצינור המכיל מדגם חלבון פיתיון באמצעות פיפטה קצה לחתוך ולסובב ל30 דקות אחרת ב 4 ° C.
- בזמן ההמתנה, להגדיר thermomixer ל55 ° C ומחמם 500 μl של חיץ elution לשימוש בשלב 3.1.
- צנטריפוגה ב XG 400 דקות 1 ב 4 ° C. בטל supernatant ולשטוף את השרף על הכתף במשך 5 דקות ב 4 ° C עם 1 מיליליטר של חיץ לשטוף טרום צונן # 1. חזור צנטריפוגה ולשטוף מדרגות שלוש פעמים. בשלב האחרון, resuspend השרף ב250 μl של חיץ לשטוף # 2.
- Tr ansfer ההשעיה השרף לעמודת ספין טרי. Resuspend השרף שנותר בצינור בעוד 250 μl של חיץ לשטוף # 2 ותעביר לאותה העמודה.
- צנטריפוגה ב XG 400 במשך 3 דקות ב 4 ° C, להשליך זרימת הדרך ולהעביר את העמודה לצינור מיליליטר טרי דולפין האף 2. פנה מייד לצעד elution להלן.
3. Elution של קומפלקסי חלבונים ספציפיים
- הוסף 150 μl של חיץ elution שחומם מראש מצעד 2.4 לעמודת הספין.
- דגירה בthermomixer 5 דקות ב55 ° C, רועד ב1,400 סל"ד.
- צנטריפוגה ב 1,500 XG 1 דקות בטמפרטורת חדר.
- מחק את העמודה ולאחסן את חלבוני היעד המטוהרים ב≤ -20 ° C.
| שנאגרו מלוח פוספט (PBS) | Na 2 HPO 4 | 10 מ"מ |
| KH 2 PO 4 | 2 מ"מ |
| NaCl | 137 מ"מ |
| KCl | 2.7 מ"מ |
| pH מותאם 7.4 אלא אם צוין אחרת (pH 8.0 בסעיף 1.4) | |
| טריס שנאגרו מלוח (TBS) | |
| טריס-HCl, pH 7.4 | 50 מ"מ |
| ght = בסגנון "20" "גובה: 20px; רוחב: 299px;" => NaCl | 150 מ"מ |
| טריס שנאגרו מלוח עם Tween 20 (TBST) | |
| טריס-HCl, pH 7.4 | 50 מ"מ |
| NaCl | 150 מ"מ |
| Tween 20 | 0.1% (v / v) |
| חיץ מחייב | |
| טריס-HCl, pH 8.0 | 25 מ"מ |
| NaCl | x; "> 550 מ"מ|
| NAF | 5 מ"מ |
| EDTA | 0.5 מ"מ |
| גליצרול | 10% (v / v) |
| PMSF | 0.1 מ"מ |
| לשטוף חיץ # 1 | |
| טריס-HCl, pH 8.0 | 25 מ"מ |
| NaCl | 500 מ"מ |
| NAF td> | 5 מ"מ |
| EDTA | 0.4 מ"מ |
| Igepal CA-630 | 0.2% (v / v) |
| גליצרול | 5% (v / v) |
| PMSF | 0.1 מ"מ |
| לשטוף חיץ # 2 | |
| טריס-HCl, pH 8.0 | 25 מ"מ |
| NaCl | 150 מ"מ |
| טריס-HCl, pH 8.0 | 25 מ"מ |
| SDS | 1% (w / v) |
טבלת 1. Buffers השתמש במחקר הנוכחי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הליך הטיהור מודגם באופן סכמטי באיור 1, יחד עם ייצוג של בעיות הקשורות לשיטות טיהור קיימות אחרות.
איור 1. ייצוג סכמטי של הליך הטיהור. זרימת העבודה כוללת ייצוב של tetramer סטרפטוקוקוס-Tactin מצמידים השרף באמצעות קוולנטיים cross-linking עם BS3, קשירה של חלבון הפיתיון מתויג התאום סטרפטוקוקוס והמתחמים הקשורים לשרף צולבים , שטיפה של חלבונים מאוגדים, denaturing elution של קומפלקסי חלבונים קשורים במיוחד עם SDS 1% וניתוחם על ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה נוזלית טנדם המוני (LC-MS/MS). שני תחומים אדומים בחלבון הפיתיון לציין את התאום סטרפטוקוקוס התג. מגבלות של שיטות טיהור אחרות מוצגות בהבלעהתיבות בצד הימין. הם כוללים elution שלם של חלבוני יעד עם ביוטין וזיהום מדגם עם סטרפטוקוקוס-Tactin הבא elution denaturing עם 1% SDS.
תוצאות אופייניות של טיהור החלבונים SIII מתויגת באמצעות שרף polymethacrylate סטרפטוקוקוס-Tactin BS3-צולבים וdenaturing elution עם 1% SDS מוצגות באיור 2. 10% (15 μl) של eluate טור הספין המכיל מטוהר מתויג SIII חלבוני PVA VPG-Pro והקשורים נותחו על ידי SDS-PAGE ואחרי צביעת כסף. היעדרם של להקת 52 kDa המתאימים PVA VPG-Pro בנתיב הביקורת השלילית אישר את הספציפיות של נפתחת. 40 μl של eluate טור ספין הנותרים יושמו ג'ל SDS נטול קרטין והנתיב המקביל היה לגזור והחלבונים הכילו היו מתעכלים עם טריפסין ונותחו על ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה נוזלית טנדם המוני (LC-MS/MS). ניתוח ספקטרומטריית המסה זוהה RNA-Depe ויראליפולימראז ndent RNA (replicase) ציפורן כשותף באינטראקציה של VPG-Pro. פפטידים tryptic מרובים המתאימים לציפורן אותרו בכל ארבע החזרות הביולוגיות של טיהור הזיקה ואף בארבעת הפקדים להביע VPG-Pro ללא SIII התג, המאשר את הספציפיות של אינטראקציה. בגלל המשקל המולקולרי של ציפורן (59 KDA) הוא קרוב לזה של VPG-Pro מתויג-SIII (52 KDA), שני החלבונים הופיעו כלהקה כפולה במהלך ניתוח עמוד SDS (איור 2, ראש חץ). יחדיו, התוצאות שתוארו לעיל מספקות ראיות ניסיוניות שטיהור הזיקה על שרפי סטרפטוקוקוס-Tactin קוולנטית צולבים עם BS3 יכולה להיות מועסקות בהצלחה לבודד חלבונים מתויגים תאום סטרפטוקוקוס ולזהות השותפים המחייבים הפיסיולוגיים שלהם על ידי ספקטרומטריית מסה.
איור 3. Elution ביוטין של SIII מתויג-PVA VPG-Pro משרף polymethacrylate סטרפטוקוקוס-Tactin הוא לעומת שלם לelution עם 1% SDS. איור מציג immunoblot אנטי VPG של eluates מחרוזי סטרפטוקוקוס-Tactin. חרוזים היו eluted או עם ביוטין 15 מ"מ או 1% SDS. ההבדל בעוצמת אות משקף תשואות חלבון שונות שהושגו עם שתי טכניקות elution. בקרות שליליות מתאימות לpurifications מהתאים נגועים בווירוס להביע VPG-Pro ללא SIII התג.
איור 4. קוולנטי cross-linking עם BS3 מונע את שחרורו של סטרפטוקוקוס-Tactin מהשרף במהלך elution SDS. איור מציג ג'ל מוכתם כסף של eluates SDS מ( נתיב שמאלי) שאינו צולבים וBS3-צולבים (נתיב ימני) שרף polymethacrylate סטרפטוקוקוס-Tactin. שים לב לנוכחותו של סטרפטוקוקוס שוחרר-Tactin בנתיב השמאלי, אבל העדרו בנתיב הימני.
ילדה = "jove_content" עבור: לשמור-together.within-page = "תמיד"> 
איור 5. מבנה הכימי של Bis suberate (sulfosuccinimidyl) (BS3) ותגובת cross-linking שלה עם קבוצות אמין אפסילון של שאריות ליזין בסטרפטוקוקוס-Tactin.
איור 6. טיהור של חלבון מתויג תאום סטרפטוקוקוס פלואורסצנטי ירוק (GFP) על אי - צולבים וBS3-צולבים שרף polymethacrylate סטרפטוקוקוס-Tactin. שתי כמויות שווה של תאי כליה עובריים אנושיים 293 להביע GFP-tagged תאום סטרפטוקוקוס היו lysed ובאופן דומה מעובד באמצעות הפרוטוקול לעיל, אלא שבמקרה אחד השרף כבר צולבים עם BS3 ובBS3 האחר להיותen להחליף עם מים בתגובת cross-linking. איור מציג ג'ל SDS-polyacrylamide מוכתם כסף וimmunoblot אנטי-GFP של חלבונים מטוהרים. שים לב שחלק מהירידה בתשואת חלבון היא טבועה שיטות טיהור מעורבת cross-linking הכימי, אבל זה הוא מתוגמל על ידי טוהר המדגם גבוה יותר בשל העדר שוחרר סטרפטוקוקוס-Tactin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול לעיל יכול לשמש כדי לטהר את כל חלבון פיתיון מתויג התאום סטרפטוקוקוס של עניין והמכלולים הקשורים אליו בכל חיץ מתאים שאינו מכיל ביוטין או denaturants החזק. בגרסה הנוכחית של הפרוטוקול, כריכה ושטיפה מבוצעת בתנאים מחמירים יחסית בנוכחות מלח גבוה וחומרי ניקוי שאינו יוניים. למרות שזה תוצאות פחות רקע, קומפלקסי חלבונים שבירים יכולים לנתק בתנאים אלה. כדי לשמר מתחמי זיקה נמוכים יותר כגון, ריכוז מלח עשוי להיות הוריד וחומר הניקוי nonionic עשוי להיות מופחת או הושמט ממחייב ולשטוף מאגרים.
היתרון העיקרי של מערכת תאום סטרפטוקוקוס התג הוא הזיקה הגבוהה של (3kDa) תג טנדם הקטן לstreptavidin המהונדס (סטרפטוקוקוס-Tactin) 1, 2, המאפשר טיהור של צעד אחד יעילה של חלבוני יעד והמתחמים שלהם גם בתצוו מצב. בגלל חזק המחייבים של תאום סטרפטוקוקוס תגלסטרפטוקוקוס-Tactin, השרף ניתן לכבס בתנאים מחמירים באופן מתון, כגון גבוה חומר ניקוי ו / או ריכוזי מלח, שתוצאתה בטהרה חלבון המטרה גבוהה יותר. עם זאת, כריכה חזקה כזה יש גם חסרונות. אפילו במקרה של חלבונים עם סטרפטוקוקוס-תג יחיד השני (WSHPQFEK רצף חומצות אמינו), elution התחרותי מהשרף עשוי לעתים להיות קשה. לדוגמא, elution של סטרפטוקוקוס קינאז (II) מתויג חלבון, NtCDPK2, משרף polymethacrylate סטרפטוקוקוס-Tactin עם 10 מ"מ desthiobiotin הוכיח שהוא לא מוצלח, הדורש denaturing elution עם חיץ מדגם SDS 6. הבעיה נפתרה רק לאחר desthiobiotin הוחלפה ביוטין החזק מתחרה (10 מ"מ) וelution בוצע במשך 5 דקות עם נמרץ רועד 7. במקרה של התאומים סטרפטוקוקוס תג, שבו יש זיקה גבוהה יותר לסטרפטוקוקוס-Tactin, elution חלבון המטרה עשוי להיות חלקי גם בריכוזים ביוטין גבוהים ככל 15 מ"מ. כפי שניתן לראות באיור 3,רק חלק קטן של VPG-Pro PVA מתויג-SIII יכול להיות eluted משרף סטרפטוקוקוס-Tactin עם ביוטין 15 מ"מ בהשוואה לכמות eluted עם 1% SDS. חשוב לציין כי היעילות של elution התחרותי סבירה גם תלויה באופי של חלבון eluted או חלבון מורכב. חלבונים גדולים יותר והידרופובי יותר עשויים sterically לעכב את הנגישות של הכיסים מחייבים ביוטין בסטרפטוקוקוס-Tactin, ובכך elution התחרותי פחות יעיל. החסרונות לעיל להימנע על ידי שימוש בelution עם SDS, אבל יש elution כגון בעיות משלה, בעיקר מסתובב סביב העובדה שחשיפה לחומרי ניקוי גורמת לניתוק של tetramers מצמידים שרף סטרפטוקוקוס-Tactin וזיהום מדגם עם שוחרר סטרפטוקוקוס-Tactin 8. זו באה לידי הביטוי באיור 4 (נתיב שמאלי), אשר מציגה כמות ניכרת של סטרפטוקוקוס-Tactin שוחררה לאחר הדגירה של שרף סטרפטוקוקוס-Tactin במאגר elution המכיל 1% SDS. זיהום מסוג זה הוא בלתי מתקבל על הדעת, אםהמדגם צריך להיות מנותח עוד יותר על ידי LC-MS/MS.
פתרון יעיל לבעיית הזיהום לעיל הוא התייצבות מצמידים שרף סטרפטוקוקוס-Tactin tetramer 9 ידי קוולנטיים cross-linking. לצורך כך, אנו מועסקים, BS3 מסיס במים שאינם cleavable, homobifunctional אמין-reactive צולב מקשר עם היסטוריה של שימוש מוצלח בייצוב מבנים חלבוניים 10-13. איור 5 מראה את הנוסחה הכימית של BS3 וcross-linking שלה תגובה עם קבוצות אמין אפסילון חופשיות של ליזין בסטרפטוקוקוס-Tactin. כאשר tetramer סטרפטוקוקוס-Tactin מצמידים השרף התייצב על ידי cross-linking עם BS3, הבעיה של זיהום דגימה עם שוחרר סטרפטוקוקוס-Tactin הייתה כמעט בוטלה (איור 4, נתיב ימני). בגלל cross-linking עם BS3 אינו גורם להצטברות חלבון נרחבת 14, זה לא להפחית את הנגישות של ביוטין מחייב כיס בstreptavidin, מה שהופךשרף צולבים מתאים לטיהור של חלבוני היתוך מתויגים סטרפטוקוקוס. יש לציין, עם זאת, כי cross-linking הכימי של חלבונים בעלי פעילות ביולוגית (נוגדנים, וכו ') מייצב את שני תצורות החלבון פעילות ולא פעילים, מה שמוביל לירידה מסוימת בפעילות. לדוגמא, שיטת immunoprecipitation המבוססת היטב באמצעות נוגדנים צולבים צמוד BS3 מייצרת תשואת חלבון מטרה נמוכה יותר בהשוואה לזו שהושגה עם נוגדנים הלא צולבים 15. עם זאת, חלק מהירידה בפעילות ביולוגית נחשבת לתחלופה מקובלת לטוהר המדגם המשופר. יש לנו נצפו תוצאות דומות עם שרף סטרפטוקוקוס-Tactin-צולבים BS3. תשואת החלבון הנמוכה במקצת שהושגה עם שרף הצולבים הייתה יותר מפיצוי על ידי טוהר המדגם השתפר מאוד (איור 6).
יישום אפשרי נוסף של השיטה המוצעת הוא בטיהור של חלבונים בממברנה סטרפטוקוקוס מתויגים solubilized עם חומרי ניקוי. חומרי ניקוי הם חיוניים לשמירה כגון חלבונים הידרופובי והמתחמים הקשורים בם בפתרון, אבל הנוכחות שלהם עלולה להוביל לזיהום דגימה עם סטרפטוקוקוס-Tactin שוחרר משרף הזיקה. דוגמא טובה לכך היא הטיהור של סטרפטוקוקוס חלבון קרום (II)-tagged בNTT1 בחרוזי סטרפטוקוקוס-Tactin לצורך התגבשות חלבון 8. הנוכחות של laurylamidodimethylpropylaminoxide חומר הניקוי (LAPAO) במאגר elution הובילה לשחרורו של סטרפטוקוקוס-Tactin מהחרוזים והצמיחה הבאה של גבישי סטרפטוקוקוס-Tactin לא רצויים 8. ייצוב של סטרפטוקוקוס-Tactin tetramer מצמידים השרף ידי קוולנטיים cross-linking עשוי לספק אמצעי יעיל להתגבר על בעיה זו.
לסיכום, הכימי cross-linking כבר מועסק בהצלחה להתגבר על המגבלות הקשורות denaturing elution משרף סטרפטוקוקוס-Tactin. גישה זו סייעה להשיג טוב חלבון מטרה מחדשcovery ללא החדרת זיהום לדוגמא. השיטה המוצעת לכן יכולה לשמש כדי לזהות שותפים המחייבים ספציפיים של חלבוני פיתיון מתויגים תאום סטרפטוקוקוס ידי ספקטרומטריית מסה. יתר על כן, השיטה יכולה להיות מיושמת לבודד ולאפיין מתחמי nucleoprotein, כוללים אלה הפיך צולבים עם פורמלדהיד, כמו גם חלבוני קרום solubilized עם חומרי ניקוי. לבסוף, הכימי cross-linking אינו משנה באופן משמעותי את התכונות הפיסיקליות של שרף סטרפטוקוקוס-Tactin, מה שהופך את השרף צולבים שעלול להיות מתאים ליישומי תפוקה גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
אנו בתודה להכיר תמיכה הטכנית של סיני Miettinen, מינה Pöllänen וטארו Rautavesi. אנו מודים הלקינו Nurkkala למתן HEK 293 תאים להביע GFP-tagged תאום סטרפטוקוקוס וPekka evijarvi לאספקת ציוד הקלטת קול. עבודה זו מומנה על ידי האקדמיה של פינלנד, להעניק מספרים 138,329, 134,684 ו258,978.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mg | Pierce/Thermo Scientific | 21585 | www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection. |
| Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) | IBA | 2-1505 | www.iba-lifesciences.com |
| Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile | Costar (Corning) | 8163 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Dolphin-nose tubes | Costar (Corning) | 3213 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Avidin | IBA | 2-0204 | www.iba-lifesciences.com |
References
- Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).
- Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).
- Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).
- Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).
- Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).
- Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).
- Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).
- Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).
- Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).
- Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5 (9), (2010).
- Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63 (2011).
- Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
- Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45 (2011).
