Abstract
Большая часть человеческого генома транскрибируется, но не переведены. В этом почтовом геномной эры, регуляторные функции РНК, как было показано, чтобы быть более важным. В функции РНК часто зависит от его способности принимать альтернативные структуры, трудно предсказать РНК трехмерные структуры непосредственно из последовательности. Одиночных молекул подходы показывают потенциал для решения проблемы РНК структурной полиморфизма путем мониторинга молекулярных структур одну молекулу в то время. Эта работа представляет собой метод, чтобы точно управлять складывание и структуру отдельных молекул РНК с использованием оптических пинцет. Во-первых, методы синтеза молекулы, пригодные для одиночных молекул механическую работу описаны. Обсуждаются Следующая, различные процедуры калибровки для обеспечения надлежащей работы оптического пинцета. Далее, различные эксперименты объясняются. Чтобы продемонстрировать полезность техники, результаты механически разворачивающихся РНК шпильки и одна РНК целуемсяг комплекс используются в качестве доказательств. В этих примерах, техника наноманипулирование был использован для изучения складывания каждого структурного домена, в том числе вторичные и третичные, независимо. Наконец, обсуждаются ограничения и будущие применения метода.
Introduction
Развитие оптического пинцета техники уже давно сопровождается ее применения в биологических исследованиях. Когда оптический эффект захвата был впервые обнаружен, Артур Ashkin заметил, что бактерии в загрязненной воде может оказаться в ловушке в фокусе лазера 1. С тех пор, бактерии пленения стала непреднамеренным, забавный эксперимент для поколений студентов биофизики, а также серьезный инструмент исследования для изучения микробного физиологию 2,3. Техника оптического захвата использует сфокусированный лазерный луч, чтобы обездвижить микроскопический объект 1. Практически, лазерной ловушки функционирует как оптического источника, который также измеряет силу (F) на захваченного объекта путем его перемещения от центра ловушки (АХ). В течение короткого диапазона, F = κ х АХ, в κ постоянная пружины из ловушки. Оптическая ловушка может быть использован, чтобы оказывать усилие в picoNewton (PN) точностью до микроскопииОбъект Copic и измерить его положение с нанометровой (нм) точности. В последние два десятилетия, оптический пинцет стали одним из наиболее часто используемых методов одиночных молекул в биофизике. Техника использовалась для изучения складывания и механику ДНК 4-6, РНК 7-9, и белков 10,11. Оптический пинцет также использовались для наблюдения репликации ДНК 12, транскрипции РНК 13, и синтез белка 14,15, а также многие другие биомолекулярные события 16-18.
Одиночных молекул подходы используются в РНК структурных исследований главным образом для изучения прочный складной энергетический ландшафт РНК. Последовательность РНК, как правило, раз в несколько стабильных, взаимоисключающих структур, в связи с простых химического состава и база Paring правил РНК. Давно известно, что РНК структурный полиморфизм, как, например, происходит в riboswitches 19,20, играет важную роль в регуляции генов. Recenт генома опрос показал, что колебания температуры как малые, как на несколько градусов существенно повлиять структуры и синтез белка в значительной части клеточного транскриптома 21. Этот пример подсказывает, что биологическая роль альтернативного РНК складывания, пожалуй, более важным и распространенным, чем предполагалось ранее. Структурная полиморфизм, однако, представляет собой вызов для традиционных биохимических и биофизических подходов, которые рассматривают средние свойства многих молекул. Например, "на" и "выключено" конформации riboswitch являются взаимоисключающими. Среднем структура получена из гетерогенных структур, вероятно, не похожи на любой из биологически соответствующих конформеров. Кроме того, нетранслируемая РНК и мРНК обычно образуют структуры. Их взаимодействие с белками и регулирующих РНК обычно требуется раскрытие существующей структуры в рамках взаимодействия. Поэтому, изучая РНК разворачивается / повторной укладки становится уместенВопрос РНК биологии. Для удовлетворения такой вызов, подход одиночных молекул был использован, чтобы разгадать РНК структурный полиморфизм, изучая одну молекулу в то время 22-27.
По сравнению с популярным методом флуоресцентной одиночных молекул, пинцет, основанные механическая разворачивается предлагает преимущество, что конформации отдельных молекул можно управлять с помощью приложенной силы и быть измерена с нанометровой точностью. Эта возможность наноманипулирование могут быть использованы для мониторинга разворачивается / складной отдельных структурных доменов таким образом, что иерархическое складывание большого РНК можно разрезать 28. Кроме того, одной нити могут быть направлены на сгиб в одном из нескольких конформеров; или Существующая структура может быть механически индуцированной чтобы повторно сворачивают в другую конформацию 29. В биологических условиях, структура РНК может быть изменен на изменение температуры или связывание лиганда. Возможность непосредственного использования молекулярных стуру открывает новую площадку РНК структурной исследования. В принципе, другие механические методы, такие как атомного микроскопа силы и магнитных пинцетов, также может быть использован для изучения складывания отдельных молекул РНК. Тем не менее, такие приложения ограничиваются в основном за счет относительно низкой пространственной разрешающей 30.
Применение оптического пинцета позволяет РНК структуры, чтобы быть развернута по механической силы.
Преимущество механической разворачивается в несколько раз. Сила может быть использован, чтобы развернуть как вторичные и третичные структуры, тогда как металлические ионы и лигандом индуцированного складывающиеся в основном ограничивается третичных структур. Температура и денатуранта могут существенно влиять на деятельность воды и растворенных веществ. В отличие от этого, сила прикладывается локально, чтобы возмущать молекулярных структур; Эффект силы на окружающую среду можно пренебречь. Кроме того, тепловое плавления лучше всего использовать для изучения сворачивания термодинамики малых структур РНК,в то время как оптический пинцет были использованы для изучения РНК структуры с различными размерами в диапазоне от семи пар оснований tetraloop шпильки 28 до 400 нуклеотидов рибозима 31. Кроме того, РНК структуры могут быть механически развернулась в мезофильных температурах. В отличие от этого, разворачиваться РНК в эксперименте теплового плавления, температура, как правило, поднят значительно выше физиологических температурах, что существенно увеличивает гидролиз РНК, особенно в присутствии ионов Mg2 +.
Важно отметить, что механическое действие силы зависит от того, как оно применяется к структуре. Приложенная сила наклоняет складной энергетический ландшафт. Например, когда сила приложена к шпильке, что пар оснований последовательно разбиты, по одному за раз (фиг.1а). Копирования вилки прогрессирует по винтовой оси, перпендикулярной к приложенной силе. В отличие от этого, когда минимальное поцелуи комплекс находится под натяжением, два целоватьсяпар оснований, которые параллельны приложенной силы, распределить нагрузку силы (1б). Различные геометрии шпильке и целуя комплекса по отношению к приложенной силы в результате их различных механических ответ, который может быть использован, чтобы отличить вторичную и третичную складывание 28,32. Теоретико аспект механической разворачивается ранее отзывы 8,9,30. Эта работа излагаются основные подходы по созданию и выполнить один-молекулы механическую разворачивается анализа.
Экспериментальная установка. В нашей механической потянув эксперимента, РНК образец для выщипывания состоит из РНК интереса в окружении двух двухцепочечными ручками ДНК / РНК (рисунок 2) 7. Вся молекула может быть привязан к двум бисером микронного размера поверхностных покрытием (SPHEROTECH) через стрептавидин- биотина и дигоксигенином анти-дигоксигенин антител взаимодействий, соответственно. Один шарик удерживается измерения усилия оптической трап, в то время как другой проводится на кончике микропипеткой. Относительное расстояние между шариков может быть изменено либо рулевой ловушку или перемещение микропипетки. Используя этот подход, одна молекула РНК привязывать шарики могут быть растянуты и расслаблены.
Получение образцов. Синтез образцов РНК для выщипывания включает несколько шагов (рисунок 3). Сначала ДНК-последовательность, соответствующую РНК интереса сначала клонировали в плазмидный вектор. Далее, три ПЦР-реакции выполняются генерировать две ручки и шаблон для транскрипции. Шаблон транскрипции охватывает ручки регионы и вставленные последовательности. Полная длина РНК синтезировали с помощью транскрипции в пробирке. Последние, РНК и химически модифицированные ручки отжигают вместе, чтобы сформировать молекулы для выщипывания.
Калибровка и эксплуатация Пинцет. Базовая конструкция использованием Minitweezersд в этой работе следует, что из двойного пучка оптического пинцета 33. Со многими улучшения, Minitweezers отображения чрезвычайной устойчивостью по сравнению с оптического пинцета первого поколения. Ряд научно-исследовательских групп в ряде стран использовать Minitweezers в своих исследованиях одиночных молекул 14,15,34-37. Детали конструкции, калибровки и работы устройства, в том числе инструкции видео, доступны на веб-сайте "Пинцет Lab" (http://tweezerslab.unipr.it). Здесь, улучшения и процедуры калибровки, которые должны быть выполнены на ежедневной основе, описаны в деталях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Получение РНК молекул для выщипывания отдельных молекул
- Клонирование последовательность интерес. Клонирование ДНК-последовательность, соответствующую структуре РНК в вектор.
- Синтез и очистка шаблона транскрипции. Синтезировать шаблон транскрипции с помощью ПЦР. [Таблица 1 место здесь] Далее, очистить продукты ПЦР с использованием набора для очистки ПЦР, и концентрат образца до> 200 нг / мкл. Поскольку Очищенную ДНК используют для транскрипции, РНКазы свободной воды следует использовать в элюирования и концентрации шагов.
- В пробирке транскрипции. Синтезировать РНК транскрипции в пробирке при 37 ° С в течение ночи, чтобы максимизировать выход РНК. [Таблица 2 место здесь] После транскрипции, добавить 1 мкл ДНКазы I переварить матричной ДНК в течение 15 мин при 37 ° С. Очищают РНК, используя колонку с силикагелем, отжима.
- Синтез биотинилированной ручкой А. Первый, производить немодифицированную обрабатывать с помощью ПЦР с использованием праймеров автофокусировки и Ar и концentrate амплифицированной ДНК к> 200 нг / мкл. Далее, включают модификации биотин в ПЦР-продукта с использованием праймера реакцию удлинени. [Таблица 3 место здесь] Примечание: биотинилированный ручка (биотин-HA) может быть непосредственно использован при отжиге без дополнительной очистки. Как биотин-HA должен быть отжигают с РНК, очень важно, чтобы использовать РНКазы свободной воды в обоих этапов.
- Синтез дигоксигенином изменение ручкой Б. синтезировать дигоксигенином изменение ручку B (DIG-HB) с помощью ПЦР с использованием праймера Bf и дигоксигенином изменение олиго DIG-Br (Рисунок 3). Далее, очистки продукта ПЦР и концентрируют образца до> 200 нг / мкл.
- Отжига РНК к ручкам. Отжига РНК с ручками. [место таблицы 4 и 5 здесь]
- Очищают отожженного образца. Добавить 3 объемов этанола из отожженного образца и хорошо перемешать. Хранить смесь при -70 ° С в течение, по крайней мере 1 часа. Спин вниз на 15 800 мкг в и отбросить супернатант. Высушите осадок в лиофилизатор. Растворить осадок в100 мкл РНКазы свободной воды. Примечание: Образец готов к использованию и может храниться при температуре от -20 ° C.
2 Калибровка и эксплуатация оптических пинцетов
- Калибровка Pixel Размер видеомонитора
- Используйте оптическая ловушка для улавливания шарик с известного диаметра (стандартный размер).
- Захват изображения из захваченного борта с использованием обработки изображений (Рисунок 4).
- Определить диаметр буртика, используя программное обеспечение обработки изображений, основанный на методе центроида.
- Повторите эту процедуру, чтобы определить диаметры шариков разного размера.
- Установите измеренные и известные диаметры шариков линейной регрессии для получения физический размер пикселя.
- Убедитесь Расстояние Калибровка
- Используйте оптическая ловушка для улавливания бусинку.
- Определить положение пикселя центроидом со стороны программного обеспечения для съемки и записи свои позиции с помощью Minitweezers.
- Руководить шарик ра арендовать позиции и повторите определение местоположения.
- Преобразование X и Y позиции борта из пикселей в м блоке с помощью калиброванного размера пикселя.
- Сравните X и Y между позициями, измеряемых видео и по Minitweezers. Два набора значений следует согласиться. Как разрешение изображения> 0,1 мкм, переместить шарик более 1 мкм между измерениями для обеспечения точности. Если калибровка расстояние не сравнимо с тем, что хранится в Minitweezers, калибровку прибора.
- Ловушка Жесткость Калибровка
- Захват шарик с помощью оптического ловушку и удерживать ее до сих пор.
- Запишите силу ловушку, используя обходной быстрый сбор данных со скоростью> 5 кГц для 3 сек.
- Генерация спектр мощности от записи движения шарика с помощью программного обеспечения. Установите спектр мощности для лоренцевом (рисунок 5) 38:
542 / 51542eq1.jpg "ширина =" 200 "/> (уравнение. 1)
в которой S (е) есть сила на частоте F, F C частота угол, и S 0 является асимптотической мощности. Частота угол, F C, частота, где сила теплового движения снизилась до половины асимптотического значения. Как F C зависит от мощности лазера и размер гранул, калибровки каждого захваченного шарик индивидуально. - Вычислить жесткости пружины ловушки, κ, от F C:
(Уравнение. 2)
, в котором γ является коэффициент сопротивления борта (Eq. 3). Используйте константу пружины для определения изменений внутренних линий РНК от изменения силы.
- Закон Тест Стокса
- Захват бусинку, используя оптический ловушку. Перемещение шарик назад и сила с разной скоростью.
- Запишите движение шарика и заставить с помощью Minitweezers.
- Вычислить радиус шарика.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сила трения, F д, порожденный движения сферической частицы в жидкости может быть описана законом Стокса:
(Уравнение. 3)
в которой R является радиусом сферы, V есть скорость, и ч является динамическая вязкость жидкости, которые можно найти в справочных таблицах. Используя измеренную силу, F D, радиус шарика может быть вычислена по формуле. 3 (Рисунок 6) и должна с этим согласиться определяется программным обеспечением захвата изображений. Закон тест Стокса эффективно тесты общей калибровки и работу прибора.
(Уравнение. 2) 
(Уравнение. 3) 3 наноманипулирование Единого РНК молекул
- Создание FLUIDICS.
- Дрель шесть отверстий (диаметром 2 мм каждая) на номер 2 покровного стекла (7А) и сократить три прорези (2 мм в ширину) в двухсторонней полиимидной лентой (рисунок 7b) с помощью лазерного гравера.
- Сделать проточную камеру на сэндвич два покровного стекла с двумя слоями двусторонней каптоновой ленты. Вставьте микропипетку и два перепускных труб между лентой (фиг.7с).
- Установите потока камеру на металлической раме путем сопоставления жидкостный отверстия (рис 7D).
- Подключите жидкостных каналов камеры 10 мл шприцев, наполненных буфера выбора через полиэтиленовых трубок (Рисунок 7e).
- Установите весь камеру на оптических пинцетов между двумя целями. Убедитесь, что передняя сторона камеры с жидкостных каналов, обращен вправо. Уберите право цель и подключить контакты латунные фрейма (Рисунок 7e) в отверстия на тон пинцет. Затянуть винты для фиксации положения камеры.
- Смешивание отожженного образца и бусы. Смешайте отожженного образца с анти-дигоксигенином покрытых шариков (DIG-бусы), и дайте смеси остаться при комнатной температуре в течение 5-10 мин. Как правило, 1 мкл отожженного образца смешивают с 5 мкл DIG-шариков в 1 мл буфера. ПРИМЕЧАНИЕ: Количество шариков должен быть загружен в проточной камеры должны быть выбраны для обеспечения разумное количество шариков, которые будут поставляться из шунтирующего трубки. Отношение отожженного образца к гранулам, не может быть легко количественно. В идеальном случае, большинство шарики не имеют РНК такой, что только небольшая часть из бисера может быть только один молекулу РНК на гранулу. Как отожженные образцы и шарик подвеска трудно поддаются количественной оценке, лучший и единственный способ в настоящее время является изменение соотношения смешивания и проверить смесь на пинцета.
- Поставьте шарики к реакционной сайта в проточной камеры (т.е., несколько микрометров в верхней части миcropipette наконечник, рисунке 7в).
- Загрузите суспензии покрытых стрептавидином бисера (стрептококковые-бусы) в 1 мл шприц.
- Подключение шприц с текучей трубки, ведущей к нижней канала проточной камеры (7А).
- Нажмите шприц течь стрептококковые бусы в камеру.
- Переместить всю камеру, используя программное обеспечение управления двигателем, чтобы поместить оптическую ловушку около открытия нижней отводной трубе (фиг.7В). Тогда работать оптической ловушке на трекбол, чтобы захватить стрептококковая-бусину.
- Перемещение шарик близко к кончику микропипетки с помощью программного обеспечения управления двигателем.
- Потяните шприц, соединенный с микропипеткой сосать бусинку на микропипеткой.
- Применить поток мягко нажимая шприц к среднему каналу, чтобы избавиться от лишних стрептококком бусы.
- Точно так же, поставить смесь образца и DIG-шарики (см шаг 3,2) в верхнем канале камеры.
- Захват DIG-шарик и принести его близко к стрептококковой-шарик с помощью оптического ловушку.
- Очистите средний канал, применяя поток. Примечание: септический и DIG-шарики выбираются так, чтобы быть разных размеров, так что они могут быть выделены визуально при микроскопическом зрения (фиг.4).
- Рыбалка "один-молекула привязывать между парой шариков.
- Поместите DIG-шарик вертикально сверху острый-шарик (рис 4).
- Перемещение DIG-шарик вниз к стрептококковой-бусинки, регулируя ловушку. Откройте участок окно сила-расстояние от компьютера для визуализации изменения силы.
- При контакте двух шариков, переместить DIG-шарик вертикально от стрептококковой-бусинки.
- Если никаких конкретных контакт не сделан, сила остается практически нулевой. Если два борта соединены молекул, увеличивается сила значительно, когда две отдельные шарики. Эта процедура, как правило, называют "рыбалки", часто перфорацияОрмед несколько раз на каждой пары шариков найти эффективный привязь одиночных молекул.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ограничено пространства, наноманипулирование одиночных молекул РНК демонстрируется, показав только механические, разворачивающиеся примеры РНК шпильки и РНК с третичной структуры.
Манипулирование Одноместный шпилька Molecules
После троса устанавливается между бисером, расширение и сила на тросе можно манипулировать, используя протокол, определяемое пользователем. Четыре общие протоколы манипуляции обычно используются.
Force-рампа Эксперимент. Наиболее распространенным интуитивным и эксперимент, чтобы манипулировать одну РНК повторно растянуть и расслабить молекулы в направлении винтовой оси ручки (вертикально, как показано на рисунке 4). Усилие, F, а также позиции ловушки, Y записываются в виде функции времени. Расширение молекулы, Е, может быть вычислена по электронной = Y - F / κ, в котором пружины из TRAс. Потянув результат может отображаться в виде кривой сила-расширения (Рисунок 8а). Растяжение двухцепочечными ручками показано на восходящей кривой с положительным наклоном. Кривая релаксации ручек откатывается, что из растяжения. Структурный переход из простого, двух государств-складной шпильке отображает "рип" с отрицательным наклоном, что указывает на одиночный, кооперативный разворачивается переход 39. Рефолдинг шпильке обозначается "молнией" на кривой сила-расширения. Важно отметить, что та же молекула может быть развернут и повторной укладке на разных сил каждый раз. Такая тенденция наблюдается на распределений переходных сил (Рисунок 8b). Как правило, сила изменяется как линейная функция времени, т.е. в размере фиксированной погрузки / разгрузки. При постоянной скорости загрузки / разгрузки, сила зависимые кинетики могут быть извлечены из распределений переходных сил 40-42.
постоянной силы Эксперимент. В режиме постоянной силы, прибор использует механизм обратной связи, чтобы компенсировать отклонения силы от заданного значения. Расширение молекулы РНК записывается в виде функции времени (фигура 9). Установка силы на или вблизи перехода силу перехода конкретной молекулы РНК дает возможность наблюдения и количественной оценки молекулярных растяжения состояний. Времена жизни молекулы в каждом государстве могут быть объединены вместе, чтобы вычислить кинетики структурного перехода 7. Эксперимент постоянная сила используется для контроля обратимое складывание, например, те из шпилек 7,28.
Force Перейти Эксперимент. В эксперименте сила прыжка, сила стремительно превращается в другое значение и поддерживается постоянным; Срок службы первого перехода контролируется 43. Сила скачок особенно полезно характеризовать кинетикунеобратимые процессы, потому что времена жизни в прямом и обратном реакции могут быть непосредственно измерены отдельно на разных сил. В каждой силовой прыжка / падения, только одну жизнь наблюдается. Таким образом, несколько раундов таких экспериментов должны быть выполнены для того, чтобы собрать достаточные наблюдения для извлечения кинетики.
Пассивные эксперименты. Под пассивном режиме, позиции ловушки и микропипеткой оба фиксированной (Рисунок 10). Шпилька имеет два состояния, соответствующие разложенном и сложенном РНК вблизи ее переходных сил. В отличие от постоянной силы эксперимента, как в силу и расширение изменения молекулы при структурном переходе. Устранение управление с обратной связью позволяет молекулярные переходы, которые будут непосредственно контролироваться без вмешательства извне. Тем не менее, трудно поддерживать постоянную силу в пассивный режим показывает. Как захваченного борта внедряются в оптической ловушке, изменения силы соответственно. Чтэ пассивный режим не подходит для измерения молекулярных состояний с длинными времени задержки, в течение которого сила значительно изменили. Плюсы и минусы постоянной силы и пассивных режимов были широко изучены и обсуждены 44.
Unravel Складывание вторичная и третичная структуры
Механическая разворачивание двух пар оснований целовать РНК, образованного двумя связанных GACG tetraloop шпилек используется в качестве примера здесь (рисунок 11а). Оба шпильки 9-пар оснований стебель письмо, хотя последовательности стволовые отличаются. Механический разворачивается путь РНК (Рисунок 11а) характеризуется методов сила рампы 34. Когда сила поднимается, целуя комплекс первого нарушена, а затем последовательное разворачивание из шпилек. На повторной укладки, шпильки раз первым, а затем поцелуя взаимодействия при низкой силе. Эти переходы видны на кривой сила-расширения (Рисунок11b). Для подтверждения назначения шпильке переходов, каждый из шпилек может быть индивидуально изучены. Отнесение unkissing / целовались переходов может быть проверена путем изучения мутантный РНК, в которых tetraloops мутируют, чтобы предотвратить образование поцелуев взаимодействия 28. С другой стороны, низкое усилие может быть установлен на 10 PN, более высоких, чем целование сил. Как и ожидалось, кривая силы-расширение в таких условиях показывает только разворачивается / рефолдинг шпильках (Рисунок 11c) 34. Таким образом, можно исследовать складывания целоваться взаимодействие и каждый из двух шпилек независимо друг от друга на разных сил.
Следует отметить, что складывающиеся из двух шпилек является обратимым, в то время как поцелуи взаимодействие крайне необратимым, как видно по очень разной unkissing и целовались сил, и по большим гистерезисом. Таким образом, складные кинетика шпильки могут быть изучены directlу с помощью экспериментов постоянной силы. Кинетика целовать взаимодействия, однако, должна быть измерена с помощью метода сила прыжка. На рисунке 12а показана типичная силы прыжка эксперимент 28. В 3 П.Н., вся РНК складывается. Усилие затем быстро повышают до 22 пН и поддерживается постоянной. Через несколько секунд, весь развернулась РНК в одну нить, как видно по резкому увеличению продления ~ 30 нм. Усилие затем поднимают до 30 пН дальнейшего растянуть РНК, прежде чем он будет снижена до 13 PN. После складывания из шпилек, сила быстро упал до 8 портов. Формирование целовать комплекса обозначается сокращения расширения на ~ 7-8 нм. Собирая многие из этих измерений времени жизни, unkissing и целовать кинетики при постоянных сил можно вычислить.
При всех условиях эксперимента, целуя комплекс всегда развернул первый. В сил, что шпильки неустойчивой сами по себе, взаимодействуют поцелуиионный защищает шпилечные структуры от разворачивания. Такое ограничение скорости эффект также выявлены силы скачка экспериментов. Как показано на рисунке 12b 28, когда сила подскочила до 16 PN, расширение молекулы остается в основном неизменной в течение нескольких секунд, а затем разворачивается увеличением расширения по ~ 20 нм. Изменения в расширении указано слабее, семь пар оснований шпильки разворачивается сразу после нарушить из целовать комплекса. Метастабильность шпильке очевидно временами жизни. После того, как поцелуи нарушается, шпилька быстро переходит между свернутых и развернутых состояний; времена жизни менее чем на 1 сек. По сути, это наблюдение постоянная сила эксперимент для разворачивания заколку. В отличие от этого, он принимает в течение 10 сек, чтобы разорвать поцелуи комплекс вместе с шпильке. Кроме того, сила вырос до 17,7 PN (Рисунок 12c), при котором весь развернулась РНК в одну нить, как это видно на Inскладка в расширении ~ 30 нм. Бистабильность большой, 11-пар оснований шпильке можно рассматривать как расширение хмель между двумя значениями. Опять же, короткие времена жизни шпильке в резком контрасте с длительным сроком службы в метастабильном состоянии. Используя сочетание силы рампы и сила прыжка экспериментов, термодинамики и кинетики индивидуальный разворачивающихся / складной шаги могут быть измерены 28. Прямые наблюдения преломлении и формирования целовать комплекса позволяет проанализировать энергетические вклады фланговые базы до минимального поцелуи комплекса 34 и измерить зависимость соли в поцелуи взаимодействия 45.
Рисунок 1. РНК структуры по отношению к приложенной силы. а) шпилька под натяжением. б) Тяговая два-base-пара целовать комплекс. Два петли шпильки окрашены в красный и желтый.
2 Экспериментальная установка Рисунок. Структура РНК в окружении двух ДНК / РНК ручками. Через химических модификаций на концах ручки, все молекулы могут быть подключены к паре белка покрытием микронного размера шариков. Один из бисера проводится рулевого, измерения усилия оптической ловушке. Другой помещают на микропипетки, который приводится в действие пьезоэлектрического стадии flexture. На чертеже это не в масштабе.
Рисунок 3 Общая схема синтезировать молекулы РНК с ручками. Ручка, ручка B, и тШаблон ranscription генерируются с помощью ПЦР из плазмиды с клонированной последовательности РНК. Ручка модифицируется digoxigenins (DIG) на концах 3 '. Ручка B имеет модификацию биотин в 5'-конце одной цепи. Полная длина РНК транскрибируется из шаблона транскрипции. РНК и модифицированные ручки смешивают и отжигают. Должным образом молекулы могут быть привязаны к паре шариков, покрытых стрептавидином с и анти-дигоксигенин антитела. На чертеже это не в масштабе.
Рисунок 4. Изображения рыбалки одиночных молекул между двумя бортами, захваченных видеокарты. Один шарик помещается на кончике микропипеткой путем отсасывания. Другой проводится направляя на измерения усилия оптической ловушке. Направления движений ловушки указаны стрелками. В ловушке шарик первые шагивертикально к бусинки на микропипеткой. После контактов, захваченный шарик движется вверх. Если троса установлена между шариков, отделение шариков тянет на молекулу, и сила возрастает, как молекула увеличивается. Если два борта не связаны никаким молекулы, отвод движения не генерирует силу.
Рисунок 5 спектр мощности броуновского движения захваченного борта. Сплошная кривая нужным уравнения лоренцевской (Eq. 1), как показано на вставке. Пружины из ловушки может быть вычислена от углового частоты (EQ. 2).
Рисунок 6 Пример правоохранительных теста Стокса.
Рисунок 7 проточная камера для выщипывания. а) шесть отверстий, каждое диаметром 2 мм, сверлят в номер 2 покровного стекла с помощью лазерного гравера. б) Три 2 мм всей щели нарезать двухсторонних лент полиимидных. в) внимательно посмотреть в экспериментальной области, содержащей микропипетки и два перепускных труб. Шарики из верхней и нижней каналов пройти через их соответствующие пробирки объездных (синих и зеленых) к ЕКСТрал канал в направлениях, указанных стрелками. г) Установите жидкостный камеру на металлической раме путем сопоставления жидкостных отверстия. е) камерного трехканальный подключен течь трубы. Центральный канал используется для вытягивания РНК. Верхний (синий) и нижний (зеленый) каналы используются для доставки шариков. Экспериментальная область обозначается красным квадратом.
Рисунок 8. Force рампы. а) кривая сила-расширение механически разворачивание шпильке. Тяговая показаны синим цветом и релаксации в красный. Разразившийся / рефолдинг шпильке указаны стрелками. Б) Распределения разворачивается (синий) и повторной укладки (красные) силы шпильке. На рисунке адаптирована из представленной рукописи 39.
Рисунок 9 шпилька РНК под постоянной силы. а) Схема эксперимента. Положение ловушку изменяется через обратную связь, чтобы поддерживать постоянную силу на шпильки. Б) силы и положение в зависимости от времени для шпильки ООН / складывания. Как сила остается постоянной, положение ловушку колеблется между двумя значениями, показывающий бистабильности шпильке в силу. Биномиальное распределение распределения ловушек дает изменение расширения на шпильке разворачивающейся на 19,4 ± 0,2 нм. На рисунке адаптирована из представленной рукописи 39.
Рисунок 10. Пассивный режим шпильке. а) Б) силы и расширение в зависимости от времени из шпильки под пассивном режиме.
Рисунок 11 Force рампа из двух пар оснований целовать РНК. а) Иерархическая складывающиеся из двух пар оснований целовать РНК при механическом напряжении. б) кривая силы-расширение. Структурные переходы обозначены стрелками. С) группа-расширения кривой, когда минимальное усилие устанавливается на 10 PN, чтобы предотвратить взаимодействие целоваться. Фантастическиефигура адаптирована с разрешения Журнал Американского химического общества 34.
Рисунок 12 Force скачок двух пар оснований целовать РНК. а) цикл сила прыжок / падение измерить unkissing и поцелуи жизней в двух разных сил. На верхней панели показаны временные следов силу. Нижняя панель показывает относительное расширение молекул. Сила сначала прыгнул с 3 ПШ 22 пН для измерения времени жизни поцелуи комплекса на 22 портов. Unkissing указывает на быстрое увеличение расширения на ~ 30 нм, что указывает на всю РНК разворачивается в одну нить. На релаксации, сила снижается до 14 ПШ позволить двум шпильки в сложите. Усилие затем упала до 8 портов. Формирование поцелуи взаимодействия указывает снижение расширение ~ 7-8 нм. Б)Как сила подскочила до 16 PN, время-расширение следа показывает, что он занимает несколько секунд для поцелуев комплекса и семь-пар оснований шпильке разворачиваться, после чего шпилька разворачивается и refolds быстро. Грн) Весь поцелуи комплекс развернулась в одну нить через несколько секунд после силы подскочила до 17,7 PN. Оставшиеся следы показывает бистабильность 11-пар оснований шпильке. Каждый из структурных переходов в разворачивая целовать РНК показывает отличительный X. На рисунке приспособленную с разрешения Труды Национальной академии наук 28.
| Реагент | мкл |
| Плазмида (10 нг / мл) | 10 |
| Грунтовка T7F (100 мм) | 10 |
| Грунтовка тормозной (100 мм) | 10 |
| дНТФ смесь (каждый 25 мм) | 10 |
| 10xПЦР буфера | 100 |
| H 2 O | 850 |
| Полимеразной Taq ДНК | 10 |
| Всего | 1000 |
Примечание: Типичный термический цикл синтеза 3 кб ДНК является: 95 ° C 45 секунд, 53 ° C 1 минута, 72 ° C 3 минуты.
Таблица 1 Пример синтеза ПЦР шаблон транскрипции.
| Реагент | мкл |
| Шаблон (> 200 нг / мл) | 8 |
| НПТ | 8 (2 мл каждого) |
| 10x реакционного буфера | 2 |
| Т7 РНК-полимераза | 2 |
| Всего | 20 |
Примечание: Инкубируют реакцию при 37 ° C overniGHT.
Таблица 2 В пробирке транскрипции.
| Реагент | мкл |
| Ручка A (~ 10 мг) | 50 |
| Биотин-11UTP | 5 |
| T4 реакция пол буфер | 5 |
| Решение BSA | 1 |
| ДНК-полимеразой Т4 | 5 |
| Всего | 66 |
Примечание: Инкубируют реакционную смесь при комнатной температуре в течение 20 минут. Инактивации фермента при нагревании при 70 ° С в течение 20 минут с последующим медленным охлаждением до комнатной температуры.
Таблица 3 Удлинение праймера реакция.
| Реагент | мкл |
| Формамид | 800 |
| ЭДТА (0,5 М, рН 8,0) | 2 |
| ТРУБЫ (1 М, рН 6,3) | 40 |
| NaCl (5M) | 80 |
| Всего | 922 |
Таблица 4 Рецепт буфера отжига.
| Реагент | |
| Биотин-HA | 1000 нг |
| Dig-HB | 1000 нг |
| РНК | 1000 нг |
| Отжиг буфер | 80 мл |
Примечание: Типичный термический цикл для отжига: 95 ° С 10 минут, 62 ° С 1 час, 52 ° С 1 час, после чего наращивают до 4 ° С.
Таблица 5 отжига РНК с ручками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модификация и устранение неисправностей в подготовке выщипывания Образцы
Выбор вектора клонирования. Хотя общая схема описано здесь (фиг.3) не требует специального клонирующий вектор, вектор предпочтительно не имеют внутреннюю Т7 или Т3 промотор для простоты транскрипции таким образом, что промотор может быть введен с помощью ПЦР в нужном месте.
Последовательность и Длины ручек. Там нет конкретных требований последовательность для ручек. Тем не менее, близкий к коэффициенту ГК AT является предпочтительным, в то время как гомополимерные и высоко повторяющиеся последовательности следует избегать. В опубликованных работах, две ручки хранятся как подобные длины такие, что структура РНК интереса, размещенные примерно в середине. Предыдущая работа показывает, что общая длина ручки варьируется от 500 до 10000 пар оснований тонко влияет измеренные кинетика 46,47.
ve_content "> Контроль качества и количественного отожженном смеси. Кроме предполагаемого РНК с ручками, конечный продукт содержит также неотожженных ручки ДНК и РНК, а также другие. Трудно и неэкономичным, чтобы очистить выщипывания молекулы. Вместо этого отожженные смесь может быть непосредственно использована для выщипывания, так как только надлежащим отожженных нуклеиновых кислот могут быть привязаны к двум поверхностными покрытием шариков. Правильно отжигают продукт также трудно отличить от ручки и РНК на электрофореза в агарозном геле. Лучший способ, чтобы проверить Качество и для количественной оценки концентрации отожженного продукта для проверки его на пинцета. Тем не менее, было бы полезно, чтобы проверить и количественной оценки ПЦР и продукты транскрипции на каждой стадии с использованием различных методов молекулярной биологии.Альтернативные подходы привязанный РНК в бисер. Есть много мыслимые методы ссылающиеся молекулы РНК на поверхности ковалентно или нековалентно 48
Одно- против Multiple-молекула Tether. Пара септический и DIG-бусинок может быть связан с несколькими молекулами. Чтобы подразнить такую возможность нескольких молекул привязывать бусинку, кривые сила-расстояние должны быть внимательно изучены. Троса одиночных молекул отображать червеобразные цепи эластичность 4, который обычно невидимый в нескольких молекул тросов. Дополнительные контрольные эксперименты для каждой конкретной системы может потребоваться для подтверждения привязь в одиночных молекул.
Улучшения в Minitweezers
Быстрой и медленной записи данных. Minitweezers имеет встроенный в системах сбора данных, которая записывает до 21 инструментальных параметров в размере 200 Гц в компьютер, который будет называться в качестве операционной компьютера в этой работе. Однако, некоторые приложение для раДополнения и калибровки требуют высокую скорость сбора данных. Для этого, электронные сигналы силы и расстояния разделены для записи в новый компьютер, на "фаст-записи" компьютера, в дополнение к приобретению данных в операционной компьютера. Компьютер быстро записи считывает данные через отдельную карту сбора данных и программного обеспечения, что позволяет несколько каналов до 1 МГц. Новый компьютер и сбор данных не мешать работе прибора, который исключительно управляется операционной компьютера. В эксперименте, данные одновременно записываются на обоих компьютерах с различными скоростями. Синхронизация по времени выполняется во время анализа данных, сравнивая соответствующие файлы данных.
Запись видео изображения. Видеокарта и ПО для обработки изображений установлены на компьютере быстро записи захватить живые образы реакции и анализировать видеоизображение. Эта разработка позволяет реализовать тон размер пикселя и расстояние калибровки описано выше.
Ограничения и будущие применения метода
Были обсуждены методы, чтобы точно манипулировать и измерить конформационные изменения одной молекулы РНК. Такие способности позволяют контролировать структурную перестройку в цепи РНК в режиме реального времени. Кроме того, сила может использоваться для влияния на структуру РНК и складные пути, позволяя редких и / или меньше оптимального структуры, которые будут сложены.
Тем не менее, существуют ограничения механического подхода. Наиболее важно, что расширение, которое используется для интерпретации конформационных изменений, является одномерным проекция трехмерных структур. Вполне возможно, что некоторые конформационные изменения не могут быть измерены 49-52, и / или кинетические барьеры скрыты от наблюдения 53. Существуют также различные инструментальные эффекты и ограничения, которые могутffect наблюдаемые термодинамика и кинетика 44,46,47.
Оптические пинцеты были применены для изучения ограниченное количество структур РНК, по сравнению с многочисленными транскриптов предложенных генома обследований 54. Техника будет использоваться для изучения различные структурные мотивы и большие РНК. Кроме того, этот метод будет находить новые приложения в РНК исследований. Например, РНК-связывающий лиганд и белки могут стабилизировать или изменить структуру РНК, которая может быть измерена с помощью механического подхода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minitweezers | Steven B. Smith Engineering | http://tweezerslab.unipr.it | |
| Data acquisition card | National Instruments | USB-6351 | |
| Video card | National Instruments | PCI-1407 | |
| Labview programming software | National Instruments | ||
| NI Vision Builder | National Instruments | ||
| Laser engraver | Epilogue laser systems | Zing-16 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MEGAscript T7 kit | Life Technologies | AM1334 | |
| MEGAclear kit | Life Technologies | AM1908 | |
| Biotin-11-UTP | Thermo Fisher | FERR0081 | |
| T4 DNA polymerase | New England Labs | M0203 | |
| Streptavidin coated microsphere | Spherotech | SVP-20-5 | |
| Antidigoxigenin coated microsphere | Spherotech | DIGP-20-2 | |
| Size standard microspheres | Spherotech | PPS-6K | |
| Kapton tape | Kaptontape.com | KPPTDE-1 | |
| No. 2 cover glass | Thermo Fisher | 12-543D |
References
- Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4853-4860 (1997).
- Maier, B. Using laser tweezers to measure twitching motility in Neisseria. Current opinion in microbiology. 8, 344-349 (2005).
- Wang, S., Arellano-Santoyo, H., Combs, P. A., Shaevitz, J. W. Measuring the bending stiffness of bacterial cells using an optical trap. Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).
- Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA the elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. 271, Science. New York, N.Y. 795-799 (1996).
- Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. 271, Science. New York, N.Y. 1835-1837 (1996).
- Bryant, Z., et al. Structural transitions and elasticity from torque measurements on DNA. Nature. 424, 338-341 (2003).
- Liphardt, J., Onoa, B., Smith, S. B., Tinoco, I., J,, Bustamante, C. Reversible unfolding of single RNA molecules by mechanical force. 292, Science. New York, N.Y. 733-737 (2001).
- Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA unfolds and refolds. Annu Rev Biochem. 77 (27), 21-24 (2008).
- Woodside, M. T., Garcia-Garcia, C., Block, S. M. Folding and unfolding single RNA molecules under tension. Current opinion in chemical biology. 12, 640-646 (2008).
- Cecconi, C., Shank, E. A., Bustamante, C., Marqusee, S. Direct observation of the three-state folding of a single protein molecule. 309, Science. New York, N.Y. 2057-2060 (2005).
- Shank, E. A., Cecconi, C., Dill, J. W., Marqusee, S., Bustamante, C. The folding cooperativity of a protein is controlled by its chain topology. Nature. 465, 637-640 (2010).
- Morin, J. A., et al. Active DNA unwinding dynamics during processive DNA replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 8115-8120 (2012).
- Larson, M. H., Landick, R., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase one singular sensation every little step it takes. Molecular cell. 41, 249-262 (2011).
- Wen, J. D., et al. Following translation by single ribosomes one codon at a time. Nature. 452, 598-603 (2008).
- Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
- Pease, P. J., et al. Sequence-directed DNA translocation by purified FtsK. 307, Science. New York, N.Y. 586-590 (2005).
- Dumont, S., et al. RNA translocation and unwinding mechanism of HCV NS3 helicase and its coordination by ATP. Nature. 439, 105-108 (2006).
- Greenleaf, W. J., Woodside, M. T., Block, S. M. High-resolution, single-molecule measurements of biomolecular motion. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 36, 171-190 (2007).
- Serganov, A., Nudler, E.
- Breaker, R. R. Prospects for riboswitch discovery and analysis. Molecular cell. 43, 867-879 (2011).
- Wan, Y., et al. Genome-wide measurement of RNA folding energies. Molecular cell. 48, 169-181 (1016).
- Dalgarno, P. A., et al.
- Wood, S., Ferre-D'Amare, A. R., Rueda, D. Allosteric tertiary interactions preorganize the c-di-GMP riboswitch and accelerate ligand binding. ACS chemical biology. 7, 920-927 (2012).
- Brenner, M. D., Scanlan, M. S., Nahas, M. K., Ha, T., Silverman, S. K. Multivector fluorescence analysis of the xpt guanine riboswitch aptamer domain and the conformational role of guanine. Biochemistry. 49, 1596-1605 (2010).
- Greenleaf, W. J., Frieda, K. L., Foster, D. A., Woodside, M. T., Block, S. M. Direct observation of hierarchical folding in single riboswitch aptamers. 319, Science. New York, N.Y. 630-633 (2008).
- Frieda, K. L., Block, S. M. Direct observation of cotranscriptional folding in an adenine riboswitch. 338, Science. New York, N.Y. 397-400 (2012).
- Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39, 7677-7687 (2011).
- Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Unusual Mechanical Stability of A Minimal RNA Kissing Complex. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15847-15852 (2006).
- Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Real-time control of the energy landscape by force directs the folding of RNA molecules. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 7039-7044 (2007).
- Tinoco Jr, I., Li, P. T. X., Bustamante, C. Determination of ther modynamics and kinetics of RNA reactions by force. Q Rev Biophys. 39, 325-360 (2006).
- Onoa, B., et al. Identifying kinetic barriers to mechanical unfolding of the T thermophila ribozyme. 299, Science. New York, NY. 1892-1895 (2003).
- Li, P. T., Tinoco Jr, I. Mechanical unfolding of two DIS RNA kissing complexes from HIV-1. J Mol Biol. 386, 1343-1356 (2009).
- Smith, S., Cui, Y., Bustamante, C. Optical-trap force transducer that operates by direct measurement of light momentum. Methods Enzymol. 361, 134-162 (2003).
- Stephenson, W., et al. The essential role of stacking adenines in a two-base-pair RNA kissing complex. J Am Chem Soc. 135, 5602-5611 (2013).
- Kaiser, C. M., Goldman, D. H., Chodera, J. D., Tinoco Jr, I., Bustamante, C. The ribosome modulates nascent protein folding. 334, Science. New York, NY. 1723-1727 (2011).
- Bizarro, C. V., Alemany, A., Ritort, F. Non-specific binding of Na+ and Mg2+ to RNA determined by force spectroscopy methods. Nucleic acids research. 40, 6922-6935 (2012).
- Bosaeus, N., et al. Tension induces a base-paired overstretched DNA conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15179-15184 (2012).
- Berg-Sørensen, K., Power Flyvbjerg, H. spectrum analysis for optical tweezers. Rev Sci Instrum. 75, 594-612 (2004).
- Stephenson, W., et al. Combining temperature and force to study folding of an RNA hairpin. Phys Chem Chem Phys. 16, 906-917 (2014).
- Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys J. 72, 1541-1555 (1997).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic rates and activation free energies from single-molecule pulling experiments. Phys Rev Lett. 96, 108101 (2006).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proc. Natl Acad Sci USA. 105, 15755-15760 (2008).
- Li, P. T. X., Collin, D., Smith, S. B., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Probing the Mechanical Folding Kinetics of TAR RNA by Hopping, Force-Jump and Force-Ramp Methods. Biophys J. 90, 250-260 (2006).
- Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S.
- Li, P. T. X. Analysis of Diffuse K+ and Mg2+ Ion Binding to a Two-Base-Pair Kissing Complex by Single-Molecule Mechanical Unfolding. Biochemistry. 52, 4991-5001 (2013).
- Wen, J. D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophys J. 92, 2996-3009 (2007).
- Manosas, M., et al. Force Unfolding Kinetics of RNA using Optical Tweezers II. Modeling Experiments Biophys J. 92, 3010-3021 (2007).
- Vilfan, I. D., et al. An RNA toolbox for single-molecule force spectroscopy studies. Nucleic acids research. 35, 6625-6639 (2007).
- Li, P. T. X. Formation of a metastable intramolecular RNA kissing complex by nanomanipulation. Soft Matter. 9, 3246-3254 (2013).
- Chen, G., Chang, K. Y., Chou, M. Y., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Triplex structures in an RNA pseudoknot enhance mechanical stability and increase efficiency of -1 ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 12706-12711 (2009).
- Chen, G., Wen, J. D., Tinoco Jr, I. Single-molecule mechanical unfolding and folding of a pseudoknot in human telomerase RNA. 13, RNA. New York, N.Y. 2175-2188 (2007).
- Tinoco, I., Chen, G., Qu, X. RNA reactions one molecule at a time. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2, a003624 (2010).
- Dudko, O. K., Graham, T. G., Best, R. B. Locating the barrier for folding of single molecules under an external force. Physical review letters. , 107-208301 (2011).
- Djebali, S., et al.
