Abstract
Uma grande parte do genoma humano é transcrito, mas não traduzidos. Neste pós genómico, as funções reguladoras de RNA foram mostrados para ser cada vez mais importante. Como função de ARN, muitas vezes depende da sua capacidade para adoptar estruturas alternativas, isto é difícil de prever a estrutura tridimensional de ARN directamente a partir da sequência. Uma única molécula de abordagens apresentam potenciais para resolver o problema de polimorfismo de ARN através da monitorização de estruturas moleculares de uma molécula de cada vez. Este trabalho apresenta um método para manipular com precisão o dobramento e estrutura de moléculas de RNA utilizando pinças ópticas. Primeiro, os métodos para sintetizar moléculas adequadas para o trabalho mecânico única molécula são descritos. A seguir, vários procedimentos de calibração para garantir as operações próprias dos pinças ópticas são discutidos. Em seguida, vários experimentos são explicados. Para demonstrar a utilidade da técnica, os resultados de desdobramento mecanicamente grampos de ARN e um único RNA Kissing complexo são usados como prova. Nestes exemplos, a técnica nanomanipulação foi utilizado para estudar dobragem de cada domínio estrutural, incluindo secundário e terciário, de forma independente. Por fim, são discutidas as limitações e as futuras aplicações do método.
Introduction
O desenvolvimento da técnica de pinças ópticas tem sido acompanhada com a sua aplicação no domínio da investigação biológica. Quando o efeito de captura óptica foi descoberto pela primeira vez, Arthur Ashkin observado que as bactérias em água contaminada pode ser preso no foco do laser 1. Desde então, as bactérias trapping tornou-se um involuntário, experiência divertida para gerações de estudantes de biofísica, bem como uma ferramenta de pesquisa séria para estudar a fisiologia microbiana 2,3. A técnica de captura óptica usa raio laser focado para imobilizar um objeto microscópico 1. Na prática, uma série de funções de armadilha de laser como uma fonte óptica, que também mede a força (F) sobre o objecto preso pelo seu deslocamento a partir do centro da armadilha (AX). Dentro de um curto intervalo, F = κ x AX, em κ é a constante da mola de prender. A armadilha óptica pode ser utilizado para exercer uma força em piconewton (pN) de precisão para uma microscopic objeto e medir a sua posição com nanômetros (nm) de precisão. Nas últimas duas décadas, pinças ópticas tornaram-se uma das técnicas de moléculas individuais mais utilizados em biofísica. A técnica tem sido utilizada para estudar e dobragem mecânica de ADN de 4-6, 7-9 de ARN, e proteínas de 10,11. As pinças ópticas também têm sido utilizados para observar a replicação de DNA de 12, a transcrição do RNA 13, e a síntese de proteínas 14,15, bem como muitos outros eventos biomoleculares 16-18.
Abordagens de moléculas individuais são empregadas na pesquisa estrutural RNA principalmente para explorar a paisagem de energia dobrável robusto de RNA. Uma seqüência de RNA geralmente pode dobrar em várias estruturas, que se excluem mutuamente estáveis, devido às regras de composição química e desbastes de base simples de RNA. Tem sido conhecido que o polimorfismo de ARN, como a que ocorre em riboswitches 19,20, desempenha um papel importante na regulação de genes. A recent levantamento de todo o genoma revelou que as variações de temperatura tão pequenas como alguns graus influenciar grandemente a estrutura e síntese de proteínas de grande parte do transcriptoma celular 21. Este exemplo sugere que o papel biológico de alternativa dobrar RNA é talvez mais importante e abrangente do que o suposto anteriormente. Polimorfismo estrutural, no entanto, representa um desafio para as abordagens tradicionais bioquímicos e biofísicos, que examinam as propriedades médias de muitas moléculas. Por exemplo, o "on" e conformações "off" de uma riboswitch são mutuamente exclusivas. Uma estrutura média derivada de estruturas heterogéneas não é provável que se assemelham a um dos confórmeros biologicamente relevantes. Além disso, o ARN não traduzida do mRNA e geralmente formar estruturas. Sua interação com proteínas e RNAs regulatórios comumente requer desdobramento da estrutura existente, como parte da interação. Portanto, estudar RNA desdobramento / redobramento se torna um pertinenteemissão de biologia ARN. Para atender a este desafio, foi empregue uma abordagem única molécula de ARN de desvendar polimorfismo estudando uma molécula de cada vez 22-27.
Em comparação com o método popular de fluorescência única molécula, com base pinça mecânica desdobramento oferece uma vantagem que as conformações das moléculas individuais podem ser manipulados pela força aplicada e ser medido com uma precisão nanométrica. Esta capacidade nanomanipulação pode ser utilizado para monitorar o desdobramento / dobragem de domínios estruturais individuais de tal modo que a dobragem hierárquica de um grande de RNA podem ser dissecados 28. Alternativamente, um único filamento pode ser dirigido a dobrar-se em um dos diversos confórmeros; ou uma estrutura existente pode ser induzida mecanicamente para redobrar a uma conformação diferente 29. Sob condições biológicas, uma estrutura de ARN podem ser alterados em caso de alteração da temperatura ou a ligação do ligando. A capacidade de manipular diretamente s molecularestructure abre um novo espaço de estudo estrutural RNA. Em princípio, outras técnicas mecânicas, tais como microscopia de força atómica e pinças magnéticas, também podem ser usadas para estudar dobra de moléculas de ARN individuais. No entanto, essas aplicações são limitadas em grande parte devido à relativamente baixa resolução espacial de 30.
O emprego de pinças ópticas permite que estruturas de RNA a ser desdobrada pela força mecânica.
A vantagem mecânica desdobramento é várias vezes. Força pode ser usado para desdobrar as estruturas tanto secundárias e terciárias, enquanto íons de metal e ligante induzida dobrável são principalmente limitado a estruturas terciárias. Temperatura e desnaturante pode afetar significativamente as atividades de água e solutos. Em contraste, a força é aplicada localmente para perturbar as estruturas moleculares; o efeito da força sobre o meio ambiente é insignificante. Além disso, a fusão térmica é melhor usado para estudar termodinâmica dobragem de pequenas estruturas de ARN,Considerando que as pinças ópticas têm sido utilizadas para o estudo das estruturas de ARN com vários tamanhos, que vão desde um de sete pares de bases tetraloop grampo 28 para um ribozima 400 nucleótidos 31. Além disso, as estruturas de ARN pode ser desdobrada mecanicamente a temperaturas mesófilas. Em contraste, os ARN de se desdobrar em uma experiência de fusão térmica, a temperatura é normalmente levantada bem acima das temperaturas fisiológicas, o que aumenta significativamente a hidrólise de ARN, especialmente na presença de iões Mg2 +.
É importante notar que o efeito da força mecânica depende de como ele é aplicado a uma estrutura. A força aplicada inclina o panorama energético dobrar. Por exemplo, quando a força é aplicada a um gancho de cabelo, as pares de bases são sequencialmente quebrada, um de cada vez (Figura 1-A). O garfo rasgando progride ao longo do eixo helicoidal, que é perpendicular à força aplicada. Em contraste, quando um complexo de beijos mínima está sob tensão, os dois kissingpares de bases, que são paralelas à força aplicada, partilhar a carga de força (Figura 1b). As diferentes geometrias do gancho e kissing relativamente complexo para o resultado a força aplicada na sua resposta mecânica diferentes, que podem ser utilizados para distinguir dobragem secundário e terciário 28,32. O aspecto teórico da mecânica desdobramento foi previamente analisado 8,9,30. Este trabalho descreve as abordagens básicas para configurar e executar uma única molécula de ensaio desdobramento mecânico.
Configuração Experimental. Na nossa experiência, puxando mecânica, a amostra de ARN para pinça consiste no ARN de interesse ladeado por duas pegas de ADN / ARN de cadeia dupla (Figura 2) 7. Toda a molécula pode ser amarrado a dois micro-grânulos revestidos de tamanho de superfície (SPHEROTECH) através de estreptavidina-biotina e as interacções de anticorpos anti-digoxigenina-digoxigenina, respectivamente. Um cordão é realizada por um tr óptico de medição de forçaap, enquanto que a outra é mantida na ponta de uma micropipeta. A distância relativa entre os grânulos pode ser alterada por dirigir o movimento da armação ou da micropipeta. Usando esta abordagem, uma única molécula de ARN de amarrar os grânulos pode ser esticado e relaxado.
Preparação de Amostras. A síntese das amostras de ARN para pinça inclui alguns passos (Figura 3). Em primeiro lugar, a sequência de DNA correspondente ao RNA de interesse é clonado em primeiro lugar num vector de plasmídeo. Em seguida, três reacções de PCR são realizadas para gerar as duas alças e um molde para a transcrição. O modelo de transcrição engloba as regiões do puxador e as sequências inseridas. O ARN completo é sintetizado por transcrição in vitro. Por último, o ARN e alças quimicamente modificados são hibridados em conjunto para gerar as moléculas de pinça.
Calibração e Operação de pinças. O projeto básico do uso Minitweezersd neste trabalho segue a dos dual-feixe de pinças ópticas 33. Com muitos melhoramentos, os Minitweezers exibir extraordinária estabilidade, em comparação com as pinças ópticas da primeira geração. Um certo número de grupos de pesquisa em vários países usam os Minitweezers em sua pesquisa uma única molécula 14,15,34-37. Os detalhes da construção, calibração e operação do dispositivo, incluindo vídeos de instrução, estão disponíveis no site "Pinças Lab" (http://tweezerslab.unipr.it). Aqui, os procedimentos de calibração e as melhorias que precisam ser executadas em bases diárias são descritos em detalhe.
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Protocol
1 Preparação de RNA Moléculas por uma única molécula Arrancar
- A clonagem da sequência de interesse. Clonar a sequência de ADN correspondente à estrutura de ARN em um vector.
- Síntese e purificação de molde a transcrição. Sintetizar um molde por PCR de transcrição. [Tabela 1 aqui lugar] Em seguida, purificar os produtos de PCR, utilizando um kit de purificação de PCR, e concentrar a amostra para> 200 ng / mL. Uma vez que o ADN purificado é usado para a transcrição, de RNase isenta de água deve ser utilizada nos passos de eluição e de concentração.
- Transcrição in vitro. Sintetizar ARN por transcrição in vitro a 37 ° C durante a noite para maximizar o rendimento de ARN. [Lugar tabela 2 aqui] Após a transcrição, adicionar 1 ml de DNase I para digerir o ADN molde durante 15 minutos a 37 ° C. Purifica-se o ARN, utilizando uma coluna de sílica de centrifugação.
- Síntese da pega biotinilado A. Em primeiro lugar, produzir o punho não modificado A por PCR utilizando iniciadores e Af Ar e concentrate o DNA amplificado a> 200 ng / mL. Em seguida, incorporar modificações biotina no produto de PCR utilizando uma reacção de extensão do iniciador. [Tabela 3 aqui lugar] NOTA: O identificador biotinilada (biotina-HA) pode ser utilizado directamente no recozimento sem purificação. Como a biotina-HA é para ser recozido com ARN, é crítica a utilização de RNase isenta de água em ambos os passos.
- Síntese da pega modificada com digoxigenina B. sintetizam digoxigenina modificado pega B (dig-HB) por PCR utilizando o iniciador oligo Bf e modificado com digoxigenina Dig-Br (Figura 3). Em seguida, purificar o produto de PCR e concentrar a amostra para> 200 ng / mL.
- RNA Annealing para as alças. Recozimento a RNA com alças. [local tabelas 4 e 5 aqui]
- Purificar amostra recozido. Adicionar 3 volumes de etanol a amostra tratada termicamente e misturar bem. Armazenar a mistura a -70 ° C durante pelo menos 1 hr. Girar a 15.800 xg e elimine o sobrenadante. Seca-se o sedimento utilizando um liofilizador. Dissolve-se o sedimento em100 RNase água livre l. NOTA: A amostra está pronta para ser utilizada e pode ser armazenada a -20 ° C.
2. Calibração e Operação das Pinças ópticas
- Calibrar Tamanho do Pixel do Monitor de Vídeo
- Use a armadilha óptica para prender um cordão com diâmetro conhecido (tamanho padrão).
- Capturar imagens de um cordão preso usando software de imagem (Figura 4).
- Determinar o diâmetro do grânulo utilizando o software de imagem com base no método do centróide.
- Repita este procedimento para determinar diâmetros de gotas de tamanho diferente.
- Montar os diâmetros medidos e conhecidos dos grânulos por uma regressão linear para se obter o tamanho físico de um pixel.
- Verifique Calibração Distância
- Use a armadilha óptica para prender um cordão.
- Determinar a posição do pixel de seu centróide pelo software de captura de imagem e gravar a sua posição utilizando as Minitweezers.
- Orientar o talão de dife alugar posições e repita a determinação da posição.
- Converter as posições X e Y do cordão de pixels para m unidade usando o tamanho do pixel calibrado.
- Comparar o X e Y entre as posições medidas pelo vídeo e pelas Minitweezers. Os dois conjuntos de valores devem concordar. Como a resolução da imagem é> 0,1 mícron, mova o talão sobre 1 mícron entre as medidas para garantir a precisão. Se a calibração de distância não é comparável com a armazenada nas Minitweezers, recalibrar o instrumento.
- Calibração Rigidez Armadilha
- Capturar um talão usando a armadilha óptica e segurá-la ainda.
- Grave a força da armadilha usando um bypass aquisição rápida de dados a uma taxa> 5 kHz por 3 seg.
- Gerar um espectro de energia a partir da gravação do movimento talão usando software. Monte o espectro de potência de um Lorentz (Figura 5) 38:
542 / 51542eq1.jpg "width =" 200 "/> (Eq. 1)
em que a S (f) é a potência à frequência de f, f c é a frequência de corte, e S é 0 a poder assintótica. A freqüência de canto, f c, é a freqüência em que o poder do movimento térmico diminuiu para metade do valor assintótico. Como f c varia com a potência do laser e o tamanho do grânulo, calibrar cada talão prendido individualmente. - Calcula-se a constante de mola da armadilha, κ, a partir de f c:
(Equação 2.)
em que γ é o coeficiente de arrasto do talão (Equação 3.). Use a constante da mola para determinar as mudanças de extensão de um RNA de mudança vigor.
- Stokes Lei teste
- Capturar um talão usando a armadilha óptica. Mova o talão de vai-e-força em velocidade diferente.
- Gravar o movimento do cordão de forçar e usando as Minitweezers.
- Calcula-se o raio da pérola.
NOTA: A força de atrito, F d, gerada pelo movimento de uma partícula esférica num fluido pode ser descrito pela Lei de Stokes:
(Equação 3.)
em que r é o raio da esfera, v é a velocidade, e h é a viscosidade dinâmica do fluido, o que pode ser visto na tabela de referência. Usando a força medidos como F d, o raio da esfera pode ser calculado usando a Equação. 3 (Figura 6), e deve de acordo com o determinado pelo software de aquisição de imagem. Teste lei de Stokes testa efetivamente as calibrações eo desempenho geral do instrumento.
(Equação 2.) 
(Equação 3.) 3. NANOmanipulação de Solteiro RNA Moléculas
- Fazendo fluídica.
- Perfurar seis furos (2 mm de diâmetro cada) em uma tampa de vidro No. 2 (Figura 7a) e cortou três fendas (largura 2 mm) em poliimida fita dupla face (Figura 7b), utilizando um gravador laser.
- Faça uma câmara de fluxo imprensando dois tampa de vidro com duas camadas de fita dupla face Kapton. Insira uma micropipeta e dois tubos de desvio entre a fita (Figura 7c).
- Montar a câmara de fluxo para uma estrutura de metal, combinando furos fluídicos (Figura 7d).
- Ligue os canais fluídicos da câmara de 10 ml cheias com tampão de escolha através de tubos de polietileno (Figura 7e).
- Monte a câmara inteiro para as pinças ópticas entre os dois objetivos. Assegurar que o lado frontal da câmara, com os canais fluídicos enfrenta à direita. Recolha o objetivo certo e ligue os pinos de metal do quadro (Figura 7e) para furos de montagem na tele pinça. Aperte os parafusos para fixar a posição da câmara.
- Misturar a amostra e os grânulos recozido. Misturar a amostra recozida com contas de anti-digoxigenina-revestidos (DIG-esferas), e deixe a mistura ficar em temperatura ambiente por 5-10 min. Tipicamente, 1 mL de amostra recozida é misturada com 5 ul DIG-pérolas em 1 ml de tampão. NOTA: A quantidade de pérolas a ser carregado para dentro da câmara de fluxo deve ser escolhido para assegurar uma razoável quantidade de pérolas a ser entregue a partir do tubo de bypass. A razão entre a amostra recozida a os grânulos não podem ser facilmente quantificadas. Num caso ideal, a maioria dos grânulos não têm ARN de tal modo que apenas uma pequena fracção dos grânulos pode ter apenas uma molécula de ARN por pérola. À medida que as amostras tratadas e da suspensão de esferas são difíceis de quantificar, o melhor e única forma actualmente é variar a razão de mistura e de testar a mistura sobre as pinças.
- Entregar grânulos para o local de reacção na câmara de fluxo (isto é, alguns micrômetros no topo da miponta cropipette, Figura 7c).
- Carregar uma suspensão de grânulos revestidos com estreptavidina (strep-esferas) para uma seringa de 1 ml.
- Ligar a seringa para a tubagem que conduz fluídica com o canal inferior da câmara de fluxo (Figura 7a).
- Empurre a seringa para escoar a strep-grânulos para a câmara.
- Mover toda a câmara através de software de controlo do motor para colocar a armadilha óptica perto da abertura do tubo de derivação de fundo (Figura 7b). Em seguida, operar a armadilha óptica por um trackball para capturar um strep-pérola.
- Mover o grânulo perto da ponta da micropipeta, utilizando o software de controlo do motor.
- Puxar a seringa ligada à micropipeta para sugar o grânulo em micropipeta.
- Aplicar fluxo suavemente pressionando a seringa no canal do meio para expulsar strep-contas extras.
- Da mesma forma, entregar a mistura de amostra e os DIG-contas (veja o passo 3.2) para o topo do canal da câmara.
- Capture uma dig-pérola e trazê-lo perto do strep-talão usando a armadilha óptica.
- Limpar o canal por meio da aplicação do fluxo. NOTA: O Streptomyces e DIG-grânulos são escolhidos para ter tamanhos diferentes, de modo que eles podem ser distinguidos visualmente sob o ponto de vista microscópico (Figura 4).
- Pesca "uma única molécula de amarrar entre um par de esferas.
- Coloque a escavação talão verticalmente na parte superior do grânulo-strep (Figura 4).
- Mova o dig-talão para baixo para o strep-pérola, orientando a armadilha. Abra uma janela de plotagem força-distância no computador para visualizar as alterações de força.
- Em contacto das duas esferas, mova a dig-talão verticalmente longe do strep-pérola.
- Se nenhum contato específico é feito, a força permanece quase zero. Se as duas esferas estão ligados por moléculas, a força aumenta significativamente quando as duas esferas de separar. Este procedimento, comumente referido como "fishing", é muitas vezes perfvárias vezes ORMED em cada par de esferas para encontrar uma solução eficaz única molécula de tirante.
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Representative Results
Limitado pelo espaço, nanomanipulação de moléculas de RNA é demonstrado ao mostrar apenas exemplos desdobramento mecânicas dos grampos de RNA e RNA com uma estrutura terciária.
Manipular Único Hairpin Moléculas
Uma vez que uma corrente é estabelecida entre as esferas, a extensão do e vigor na corda pode ser manipulado através de um protocolo definido pelo usuário. Quatro protocolos comuns de manipulação são comumente usados.
Experiência Force-rampa. A experiência mais intuitiva e comum para manipular um único RNA é alongar e relaxar repetidamente a molécula na direcção do eixo helicoidal das alças (verticalmente conforme mostrado na Figura 4). A força, F, ea posição armadilha, Y, são registados como uma função do tempo. A extensão da molécula, e, pode ser calculado por e Y = - F / κ, em que é a constante de mola do trap. O resultado de tracção pode ser visualizada como a curva de força-de extensão (Figura 8a). O alongamento das hastes de cadeia dupla é mostrado pela curva ascendente com declive positivo. A curva de relaxamento das alças remonta a do alongamento. A transição estrutural de um simples, hairpin dois dobrar-estado exibe um "rip" com inclinação negativa, indicando uma única cooperativa transição desdobramento 39. O re-enrolamento do gancho de cabelo é indicado por um "fecho de correr" na curva força-extensão. É importante ressaltar que a mesma molécula pode ser desdobrado e redobrado a forças diferentes de cada vez. Esta tendência é evidente nas distribuições das forças de transição (Figura 8b). Geralmente, a força é alterada como uma função linear do tempo, ou seja, a uma / taxa de descarga de carregamento fixa. Sob uma taxa de carga / descarga constante, as forças cinéticas dependentes pode ser extraído a partir de distribuições de as forças de transição 40-42.
Experiência Força Constant. Sob o modo de força constante, o instrumento emprega um mecanismo de feedback para compensar os desvios de força de um valor definido. A extensão de uma molécula de RNA é registada como uma função do tempo (Figura 9). Definindo a força na ou perto da força de transição do tipo de transição molécula de ARN permite a observação e quantificação de estados extensionais moleculares. Os tempos de vida da molécula em cada estado pode ser reunidos de modo a calcular a cinética da transição estrutural 7. O experimento de força constante é usado para monitorar dobragem reversíveis, tais como os grampos de 7,28.
Força Ir Experiment. Numa experiência força de salto, a força é rapidamente transformada em um valor diferente e mantida constante; o tempo de vida da primeira transição 43 é monitorizada. O salto de força é particularmente útil para caracterizar as cinéticas deprocessos irreversíveis, porque o tempo de vida da frente e verso, as reações podem ser diretamente medidos separadamente em diferentes forças. Em cada força salto / drop, apenas uma vida é observado. Portanto, múltiplos ciclos de tais experiências devem ser realizadas a fim de recolher as observações suficientes para extrair cinética.
Experiências passiva. De acordo com o modo passivo, as posições da armadilha e a micropipeta são fixos (Figura 10). A hairpin apresenta dois estados correspondentes ao RNA desdobrado e dobrado perto de suas forças de transição. Ao contrário da experiência força constante, tanto da força e extensão da modificação sobre a molécula de transição estrutural. Eliminando controle de feedback permite transições moleculares a serem monitorados diretamente, sem interferência externa. No entanto, é difícil manter uma força constante sob o modo passivo revela. Como o cordão de difuso preso na armadilha óptico, alterações de força em conformidade. The de modo passivo é inadequado para medir estados moleculares com o tempo de permanência longo, durante o qual a força é significativamente alterada. Os prós e contras da força constante e modos passivos têm sido amplamente estudados e discutidos 44.
Unravel Folding de estruturas secundárias e terciárias
Desdobramento mecânica de um ARN kissing dois pares de bases formado por dois ganchos ligados tetraloop GACG é usado aqui como um exemplo (Figura 11a). Ambos hairpins uma haste 9 pares de bases, embora as sequências de tronco são diferentes. O caminho mecânica desdobramento do RNA (Figura 11a) tem se caracterizado por métodos de rampa força 34. Quando a força é aumentada, o complexo é quebrado kissing em primeiro lugar, seguido por sequencial desdobramento dos grampos. Em redobramento, os grampos vezes em primeiro lugar, seguido por uma interação beijando em baixo vigor. Essas transições são visíveis na curva força-extensão (Figura11b). Para confirmar a atribuição das transições em gancho, cada um dos grampos pode ser estudado individualmente. A atribuição dos unkissing / transições kissing pode ser verificada através do estudo de um mutante de ARN, em que os tetraloops são mutados para evitar a formação da interacção kissing 28. Alternativamente, o menor força pode ser definida em 10 PN, maiores do que as forças de beijo. Como esperado, a curva força-extensão sob tais condições só apresenta o desdobramento / redobramento dos grampos (Figura 11c) 34. Por conseguinte, é possível dobrar para investigar a interacção kissing e cada um dos dois grampos, independentemente, em diferentes forças.
É perceptível que o dobrar dos dois grampos de cabelo é reversível, enquanto que a interação se beijando é altamente irreversível, como é evidente por muito diferente unkissing e forças de beijo, e por grande histerese. Directl Assim, a cinética da dobragem dos grampos pode ser estudaday utilizando os ensaios de força constante. As cinéticas da interacção de kissing, no entanto, deve ser medido usando o método de força salto. A Figura 12a mostra um salto experimento vigor típico 28. Em 3 pN, todo o RNA é dobrado. A força é então rapidamente aumentada para 22 e mantida constante pN. Após alguns segundos, todo o RNA é desdobrada em um único fio, como é evidente por um aumento súbito da extensão de ~ 30 nm. A força é então aumentada para 30 pN alongar ainda mais o ARN, antes que ele seja reduzido a 13 pN. Depois de dobrar os grampos, a força é rapidamente caiu para 8 pN. A formação do complexo de beijar é indicado pela redução da extensão por ~ 7-8 nm. Ao coletar muitas dessas medições ao longo da vida, unkissing e beijando cinética em forças constantes podem ser calculadas.
Em todas as condições experimentais, o complexo de beijar é sempre desdobrado em primeiro lugar. Às forças que os grampos são instáveis por si, interagem beijosion protege as estruturas hairpin de desdobramento. Tal efeito limitante da velocidade também é revelada através de experimentos força de salto. Tal como mostrado na Figura 12b, 28, quando a força é saltado para 16 pN, a extensão da molécula permanece praticamente inalterada durante alguns segundos, seguido de um aumento da extensão de desdobramento por ~ 20 nm. As mudanças na extensão indicada a mais fraca de sete pares de bases hairpin é desdobrada logo após interromper do complexo beijando. A metaestabilidade do hairpin é evidente pelas vidas. Uma vez que o beijo é quebrado, o hairpin transita rapidamente entre estados dobrada e desdobrada; as vidas são menos de 1 seg. Essencialmente, esta observação é uma experiência de força constante para desenrolar o hairpin. Em contraste, demora mais de 10 segundos para quebrar o complexo de beijos, juntamente com o gancho de cabelo. Do mesmo modo, a força é saltado para 17,7 pN (Figura 12c), no qual todo o RNA é desdobrada em um único fio, como é evidente pelo emaumento na extensão de ~ 30 nm. O biestabilidade dos grandes, de 11 pares de bases hairpin pode ser visto como a extensão saltos entre dois valores. Mais uma vez, as vidas curtas do hairpin estão em nítido contraste com o seu longo tempo de vida no estado metaestável. Usando uma combinação de força e vigor de rampa de salto experimentos, a termodinâmica e cinética de indivíduo que se desdobram / etapas dobráveis podem ser medidos 28. As observações diretas da quebra e formação do complexo beijando nos permite analisar as contribuições energéticas de flanqueamento bases para o complexo beijos mínimo 34 e medir a dependência sal da interação beijando 45.
Figura 1. estruturas de ARN em relação à força aplicada. a) A hairpin sob tensão. b) Puxar um dois-base-par beijando complexo. Os dois laços hairpin são coloridos em vermelho e amarelo.
Figura 2. Instalação experimental. A estrutura de RNA é flanqueado por duas pegas de ADN / ARN. Através das modificações químicas nas extremidades das pegas, toda a molécula pode ser ligada a um par de esferas revestidas com proteína de tamanho de micron. Uma das contas é realizada por um dirigível, armadilha óptica de medição de força. A outra é colocada sobre uma micropipeta, que é accionado por uma fase flexture piezoeléctrico. O desenho não está em escala.
Figura 3 Um esquema geral para sintetizar moléculas de RNA com alças. A alça A, lidar com B, e tMolde ranscription são geradas por PCR a partir de um plasmídeo com a sequência de ARN clonado. A alça A é modificado por digoxigenins (DIG) nas extremidades 3 '. O identificador B tem uma modificação biotina na extremidade 5 'de uma cadeia. O RNA é transcrito de comprimento completo a partir do molde de transcrição. As alças de RNA e modificados são misturados e recozido. As moléculas podem ser adequadamente presa a um par de esferas revestidas com estreptavidina e o anticorpo anti-digoxigenina. O desenho não está em escala.
Figura 4 Imagens de pesca, de uma só molécula entre duas esferas de vídeo captadas pelo cartão. Uma esfera é colocada sobre a ponta de uma micropipeta, por sucção. O outro é mantido e dirigido por uma armadilha óptica de medição de força. As direcções dos movimentos de armadilha são indicadas por setas. Os primeiros talão preso movimentosverticalmente na direcção do talão na micropipeta. Após a contactos, o talão prendido se move para cima. Se uma corrente é estabelecida entre os grânulos, a separação dos grânulos puxa na molécula e de força aumenta à medida que a molécula é estendido. Se duas contas não estão ligados por qualquer molécula, o movimento de retração não gera força.
Figura 5 um espectro do movimento browniano de um talão prendido potência. Curva O sólido é um ajuste à equação de Lorentz (Eq. 1), mostrado na inserção. A constante da mola da armadilha pode ser calculado a partir da frequência de canto (Equação 2.).
Figura 6 Um exemplo de teste lei de Stokes.
Figura 7 A câmara de fluxo para pinça. a) Seis buracos, cada um com um diâmetro de 2 mm, são perfurados em uma tampa de vidro n º 2, utilizando um gravador laser. b) Três fendas 2 mm de largura são cortadas em fitas de poliamida dupla face. c) Um olhar mais atento na região experimental contendo a micropipeta e dois tubos de derivação. As contas dos canais superior e inferior atravessar seus respectivos tubos de by-pass (azul e verde) para o central canal nas direcções indicadas pelas setas. d) montar a câmara de fluidos numa estrutura de metal por furos correspondentes fluidos. e) Uma câmara de três canais conectadas a tubos de fluxo. O canal central é utilizada para puxar o RNA. A parte superior (azul) e inferior (verde) canais são usados para entregar contas. A região experimental é indicado por um quadrado vermelho.
Figura 8 rampa Force. a) A curva força-extensão do desdobramento mecanicamente de um hairpin. Puxando é mostrado em azul e relaxamento em vermelho. O desdobramento / reenrolamento do grampo estão indicadas pelas setas. B) Distribuição de desdobramento (azul) e redobragem (vermelho) forças de gancho de cabelo. A figura é uma adaptação de um manuscrito submetido 39.
Figura 9 Um gancho de cabelo de ARN sob a força constante. a) Diagrama de experiência. A posição da armadilha é alterada através de realimentação de modo a manter uma força constante sobre o grampo. B) Força e posição em função do tempo para hairpin un / dobragem. À medida que a força é mantida constante, a posição da armadilha oscila entre dois valores, que mostra o gancho de cabelo de bi-estabilidade na força. A distribuição binomial da distribuição armadilha produz a mudança de extensão sobre o hairpin desdobramento de 19,4 ± 0,2 nm. A figura é uma adaptação de um manuscrito submetido 39.
Figura 10 modo passivo de um hairpin. um) B) Força de extensão em função do tempo e de um grampo sob o modo passivo.
Figura 11 rampa força dos dois pares de bases RNA beijando. a) dobrar hierárquica de um beijando RNA dois pares de bases sob tensão mecânica. b) Force-extensão curva. Transições estruturais estão indicadas pelas setas. C) curva força-extensão, quando a força mais baixa é fixada em 10 pN para evitar a interacção kissing. O figura é adaptado com permissão do Journal of American Chemical Society 34.
Figura 12 Força salto dos dois pares de bases RNA beijando. a) A força de ciclo salto / drop para medir unkissing e vidas beijando em duas forças diferentes. O painel superior mostra o traçado de tempo de força. O painel inferior mostra a extensão relativa da molécula. A força é primeiro saltou de 3 para 22 pN pN para medir o tempo de vida do complexo beijando a 22 pN. O unkissing é indicado por um aumento rápido na extensão de ~ 30 nm, indicando todo o RNA é desdobrada em um único fio. No relaxamento, força é desacelerada até 14 pN para permitir que os dois grampos para redobrar. A força é, em seguida, cai para 8 pN. Formação da interação beijando é indicado pela diminuição da extensão de ~ 7-8 nm b.)Como a força é saltou para 16 pN, o traço do tempo-extensão mostra que leva vários segundos para o complexo beijando e sete pares de bases hairpin a se desdobrar, após o qual o hairpin se desdobra e redobras rapidamente. C) Todo o complexo beijar é desdobrou-se em um único fio de alguns segundos depois que a força está saltou para 17,7 pN. O vestígio mostra a biestabilidade dos 11 pares de bases hairpin. Cada uma das transições estruturais no desdobramento da RNA beijando mostra X. distintivo A figura é adaptado com permissão de Proceedings of National Academy of Sciences 28.
| Reagente | mL |
| O plasmídeo (10 ng / mL) | 10 |
| Primer T7f (100 mM) | 10 |
| Primer Br (100 mM) | 10 |
| mix dNTP (25 mM cada) | 10 |
| 10xTampão de PCR | 100 |
| H2O | 850 |
| Polimerase de ADN Taq | 10 |
| Total | 1000 |
Nota: Um ciclo térmico típico para a síntese de ADN de 3 kpb é: 95 ° C 45 segundos, 53 ° C 1 minuto, 72 ° C 3 minutos.
Tabela 1 Um exemplo de modelo de PCR para sintetizar transcrição.
| Reagente | mL |
| Molde (> 200 ng / mL) | 8 |
| NTPs | 8 (2 ml cada) |
| De tampão de reacção de 10x | 2 |
| T7 ARN polimerase | 2 |
| Total | 20 |
Nota: Incubar a reacção a 37 ° C overnight.
Tabela 2 Transcrição in vitro.
| Reagente | mL |
| Manipular A (~ 10 mg) | 50 |
| Biotina-11UTP | 5 |
| De tampão de reacção de pol T4 | 5 |
| Solução de BSA | 1 |
| Polimerase de ADN de T4 | 5 |
| Total | 66 |
Nota: Incubar a reacção a temperatura ambiente durante 20 minutos. Inactivar a enzima por aquecimento a 70 ° C durante 20 minutos, seguido de arrefecimento lento até à temperatura ambiente.
Tabela 3 Primer reacção de extensão.
| Reagente | mL |
| Formamide | 800 |
| EDTA (0,5 M, pH 8,0) | 2 |
| Pipes (1 M, pH 6,3) | 40 |
| NaCl (5M) | 80 |
| Total | 922 |
Tabela 4 Receita do tampão de recozimento.
| Reagente | |
| Biotina-HA | 1.000 ng |
| Dig-HB | 1.000 ng |
| RNA | 1.000 ng |
| Tampão de recozimento | 80 ml |
Nota: Um ciclo térmico típico de recozimento é: 95 ° C 10 minutos, 62 ° C 1 h, 52 ° C, 1 hora, seguido pela elevação de 4 ° C.
Tabela 5 Anneal RNA com alças.
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Discussion
Modificação e solução de problemas em Preparação de Amostras de pinça
Escolha da Vector Clonagem. Embora o esquema geral descrito aqui (Figura 3) não necessita de um vector especial de clonagem, o vector é preferível não ter intrínseca T7 ou T3 promotor para a facilidade de transcrição de tal modo que um promotor pode ser introduzido, através de PCR nas posições desejadas.
Seqüência e comprimentos das alças. Não há exigência de seqüência específica para as alças. No entanto, uma razão de perto de GC AT é preferida, enquanto que as sequências homopoliméricas e altamente repetidos devem ser evitados. Em trabalhos publicados, os dois punhos são mantidos como comprimentos semelhantes de tal modo que a estrutura de ARN de interesse é colocado aproximadamente no meio. Trabalhos anteriores mostram que o comprimento total das alças variou de 500 a 10,000 pares de bases subtilmente afecta a cinética medidos 46,47.
ve_content "> de verificação da qualidade e quantificação da Mistura recozido. Além do RNA pretendido com alças, o produto final também contém pegas não recozido de ADN e ARN, bem como outros. É difícil e economicamente inviáveis para purificar as moléculas tweezing. Em vez disso, o recozido mistura pode ser utilizada directamente para a pinça, uma vez que apenas os ácidos nucleicos adequadamente emparelhados pode ser amarrado a duas esferas revestidas de superfície. produto adequadamente recozido também é difícil de ser distinguidas das alças e do ARN em gel de agarose. A melhor maneira de testar a qualidade e para quantificar a concentração do produto é recozido a testar sobre as pinças. No entanto, ela é útil para controlar e quantificar a PCR e os produtos de transcrição em cada passo utilizando várias técnicas de biologia molecular.Abordagens alternativas para Tether RNA para Beads. Existem muitos métodos possíveis para ligar as moléculas de ARN para as superfícies de forma covalente ou não covalente 48
Single- contra-Multiple molécula Tether. Um par de Streptomyces e DIG-esferas podem ser ligadas através de múltiplas moléculas. Para destrinchar essa possibilidade de múltiplas moléculas de amarrar o cordão, as curvas força-distância precisam ser examinados de perto. Molécula única corda exibir uma elasticidade-like-chain verme 4 que é geralmente invisível em amarras multi-molécula. Experiências de controlo adicionais específicas para cada sistema pode ser utilizada para confirmar a molécula única peia.
Melhorias das Minitweezers
Gravação de dados rápida e lenta. O Minitweezers tem um built-in de aquisição de dados que registra até 21 parâmetros instrumentais a uma taxa de 200 Hz em um computador, que será referido como o computador operacional neste trabalho. No entanto, algumas applications e calibrações exigem uma taxa de aquisição de dados rápida. Para este efeito, os sinais electrónicos de força e distância são divididos para ser gravado numa nova computador, o computador "fast-gravação", além de aquisição de dados no computador de operação. O computador lê rápido-gravação de dados por meio de um cartão de aquisição de dados separado e software, que permite que vários canais até 1 MHz. O novo computador de aquisição de dados e não interfere com o funcionamento do instrumento, a qual é controlada exclusivamente pelo computador de operação. Em um experimento, os dados são gravados simultaneamente em ambos os computadores a preços diferentes. A sincronização de tempo é realizada durante a análise dos dados comparando os ficheiros de dados correspondentes.
Gravação de Vídeo Imagem. A placa de vídeo e software de imagem são instalados no computador fast-gravação para capturar imagens ao vivo da reação e analisar imagens de vídeo. Este desenvolvimento torna possível a implementação de tele tamanho do pixel e calibrações distância descrito acima.
Limitações e futuras aplicações do método
Métodos para manipular e medir com precisão alterações de conformação de uma única molécula de ARN foram discutidos. Tais capacidades permitem monitorizar o rearranjo estrutural de uma cadeia de ARN em tempo real. Além disso, a força pode ser usada para influenciar as estruturas de ARN e vias de dobragem, permitindo estruturas raras e / ou menos do que ideal para ser dobrado.
No entanto, existem limitações da abordagem mecânica. Mais importante ainda, a extensão, a qual é usada para interpretar as mudanças conformacionais, é uma projecção unidimensional das estruturas tridimensionais. É possível que algumas mudanças de conformação não pode ser medido 49-52, e / ou barreiras cinéticas são escondidos da observação 53. Há também vários efeitos e limitações instrumentais que pode umffect a termodinâmica e cinética 44,46,47 observados.
As pinças ópticas foram aplicados ao estudo de um número limitado de estruturas de ARN, em comparação com numerosos transcritos sugeridas por pesquisas do genoma 54. A técnica será utilizada para estudar os motivos estruturais diferentes e grandes RNAs. Além disso, o método vai encontrar novas aplicações na pesquisa de ARN. Por exemplo, um ligando de ARN de ligação de proteínas e podem estabilizar ou alterar a estrutura de ARN, que pode ser medida usando o método mecânico.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minitweezers | Steven B. Smith Engineering | http://tweezerslab.unipr.it | |
| Data acquisition card | National Instruments | USB-6351 | |
| Video card | National Instruments | PCI-1407 | |
| Labview programming software | National Instruments | ||
| NI Vision Builder | National Instruments | ||
| Laser engraver | Epilogue laser systems | Zing-16 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MEGAscript T7 kit | Life Technologies | AM1334 | |
| MEGAclear kit | Life Technologies | AM1908 | |
| Biotin-11-UTP | Thermo Fisher | FERR0081 | |
| T4 DNA polymerase | New England Labs | M0203 | |
| Streptavidin coated microsphere | Spherotech | SVP-20-5 | |
| Antidigoxigenin coated microsphere | Spherotech | DIGP-20-2 | |
| Size standard microspheres | Spherotech | PPS-6K | |
| Kapton tape | Kaptontape.com | KPPTDE-1 | |
| No. 2 cover glass | Thermo Fisher | 12-543D |
References
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