Abstract
Ein großer Teil des menschlichen Genoms transkribiert wird, aber nicht übersetzt. In diesem Beitrag genomischen Ära, regulatorische Funktionen von RNA haben gezeigt, dass immer mehr wichtig zu sein. RNA-Funktion hängt oft von seiner Fähigkeit, alternative Strukturen annehmen, ist es schwierig, RNA dreidimensionale Strukturen direkt Sequenz vorherzusagen. Einzelmolekül Ansätze zeigen Potentiale, das Problem der RNA strukturellen Polymorphismus durch Überwachen Molekülstrukturen ein Molekül zu einem Zeitpunkt zu lösen. Diese Arbeit stellt eine Methode, um die Faltung und Struktur der einzelnen RNA-Moleküle mit Hilfe der optischen Pinzette gerade manipulieren. Erstens, Methoden zu synthetisieren Moleküle geeignet für Einzelmolekül-mechanische Arbeit werden beschrieben. Als nächstes werden verschiedene Eichverfahren, um die entsprechenden Operationen der optischen Pinzette sicherzustellen diskutiert. Als nächstes werden verschiedene Experimente erläutert. Um den Nutzen der Technik zu demonstrieren, Ergebnisse der mechanisch Entfaltung RNA Haarnadeln und ein einzelnes RNA Kissing Komplexes sind als Beweismittel verwendet. In diesen Beispielen wurde die Nanomanipulationstechnik verwendet, um das Falten der einzelnen Strukturdomäne, einschließlich sekundären und tertiären studieren unabhängig. Schließlich werden die Beschränkungen und zukünftige Anwendungen des Verfahrens diskutiert.
Introduction
Die Entwicklung der optischen Pinzette Technik seit langem mit ihrer Anwendung in der biologischen Forschung begleitet. Wenn das optische Falleneffekt zuerst entdeckt wurde, beobachtet Arthur Ashkin, dass Bakterien in verunreinigtem Wasser kann an der Laserfokus 1 gefangen werden. Seitdem, Trapping Bakterien hat sich zu einem unbeabsichtigten, lustiges Experiment für Generationen von Studenten der Biophysik sowie eine ernsthafte Recherche-Tool, um mikrobielle Physiologie 2,3 studieren. Das optische Einfangen Technik verwendet fokussierten Laserstrahls, um einen mikroskopischen Objekt 1 immobilisieren. Praktisch wird ein Laserfalle als ein optischer Feder, die auch Maßnahmen Kraft (F) auf dem eingeklemmten Gegenstand durch die Verschiebung von der Mitte der Falle (AX). Innerhalb kurzer Reichweite, F = κ x AX, in κ die Federkonstante der Falle. Die optische Falle kann verwendet werden, um Kraft in Pikonewton (pN) Präzision, um ein Micros auszuübenkopische Objekt und messen ihre Position mit Nanometer (nm) Genauigkeit. In den vergangenen zwei Jahrzehnten haben optische Pinzette zu einem der am häufigsten verwendeten Einzelmolekültechniken in der Biophysik. Die Technik wurde verwendet, um das Falten und Mechanik der DNA 4-6, 7-9 RNA und Proteine 10,11 studieren. Optische Pinzetten wurden auch verwendet, um die DNA-Replikation 12 13 RNA-Transkription und Proteinsynthese 14,15 sowie viele andere biomolekulare Ereignisse 16-18 beobachten.
In RNA Strukturforschung sind Einzelmolekül-Ansätze beschäftigt vor allem auf die robuste Klappenergielandschaft von RNA zu erkunden. Eine RNA-Sequenz kann in der Regel in mehrere stabile, sich gegenseitig ausschließende Strukturen falten, aufgrund der einfachen chemischen Zusammensetzung und Basenpaarung Regeln der RNA. Es ist seit langem bekannt, dass RNA strukturellen Polymorphismus, wie er in Riboswitches 19,20 auftritt, spielt eine wichtige Rolle bei der Genregulation. Ein Vor kurzet genomweite Umfrage hat ergeben, dass Temperaturschwankungen so gering wie ein paar Grad Struktur und die Proteinsynthese eines großen Teils des zellulären Transkriptoms 21 stark beeinflussen. Dieses Beispiel deutet an, dass die biologische Rolle von RNA-Faltung Alternative ist vielleicht noch wichtiger und durchdringend, als bisher angenommen. Struktur Polymorphismus jedoch eine Herausforderung für die traditionellen biochemischen und biophysikalischen Ansätzen, die durchschnittlichen Eigenschaften vieler Moleküle zu untersuchen. Zum Beispiel kann die "An" und "Aus"-Konformationen eines RNA-Schalter sich gegenseitig aus. Eine gemittelte Struktur von heterogenen Strukturen abgeleitet ist wahrscheinlich nicht eine der biologisch relevante Konformationen ähneln. Darüber hinaus untranslatierte RNA und mRNA bilden in der Regel Strukturen. Ihre Wechselwirkung mit Proteinen und regulatorischen RNAs häufig benötigt Entfaltung bestehende Struktur als Teil der Interaktion. Daher studieren RNA Entfaltung / Rückfaltung wird eine relevanteAusgabe von RNA Biologie. Um eine solche Herausforderung zu begegnen, hat die Einzelmolekül-Ansatz eingesetzt, um RNA-Struktur Polymorphismus durch das Studium ein Molekül in einer Zeit, 22-27 entwirren.
Im Vergleich zu den beliebten Einzelmolekülfluoreszenzverfahren, Pinzette basierend mechanische Entfaltung bietet den Vorteil, dass Konformationen einzelner Moleküle können durch angelegte Kraft manipuliert werden und mit Nanometer-Präzision gemessen werden. Diese Nanomanipulationsfähigkeit kann verwendet werden, um das Aufklappen / Zusammenklappen der einzelnen strukturellen Domänen, so daß die hierarchische Falten eines großen RNA präpariert 28 werden überwacht. Alternativ kann ein einzelner Strang gerichtet, in eine von mehreren Konformere zu falten; oder eine bestehende Struktur mechanisch induziert werden, um in eine andere Konformation 29 falten. Unter biologischen Bedingungen kann eine RNA-Struktur bei Temperaturänderung oder die Ligandenbindung verändert werden. Die Fähigkeit direkt zu bearbeiten Molekular struktur öffnet eine neue Spielstätte der RNA-Struktur Studie. Grundsätzlich andere mechanische Techniken wie Rasterkraftmikroskop und magnetische Pinzette, können auch verwendet werden, um das Falten der einzelnen RNA-Moleküle zu untersuchen. Jedoch sind solche Anwendungen weitgehend aufgrund der relativ niedrigen räumlichen Auflösung 30 begrenzt.
Der Einsatz von optischen Pinzetten können RNA-Strukturen, um durch mechanische Kraft entfaltet werden.
Der Vorteil der mechanischen Entfaltung ist mehrfach. Kraft kann verwendet werden, um die sekundäre und die tertiäre Strukturen entfalten, wobei Metallionen und Liganden-induzierte Falten sind hauptsächlich tertiäre Strukturen beschränkt. Temperatur und Denaturierungsmittel kann erhebliche Auswirkungen auf die Aktivitäten von Wasser und gelöste Stoffe. Im Gegensatz dazu wird die Kraft lokal auf molekularer Strukturen stören aufgebracht; Die Krafteinwirkung auf die Umgebung vernachlässigbar ist. Darüber hinaus wird die thermische Schmelz besten verwendet, um das Falten der Thermodynamik von kleinen RNA-Strukturen zu untersuchen,wohingegen optische Pinzetten wurden verwendet, um RNA-Strukturen mit verschiedenen Größen zu untersuchen, die von einem Sieben-Basenpaar-Haarnadel Tetraloop 28 zu einem 400-Nukleotid-Ribozym 31. Ferner kann RNA-Strukturen mechanisch mesophilen Temperaturen entfaltet werden. Im Gegensatz zu RNAs in einem thermischen Schmelzexperiment zu entfalten, wird die Temperatur in der Regel deutlich über physiologischen Temperaturen, die deutlich erhöht RNA-Hydrolyse, insbesondere in Gegenwart von Mg 2 +-Ionen erhöht.
Es ist wichtig zu beachten, dass die mechanische Wirkung der Kraft abhängig, wie es sich auf eine Struktur angewendet wird. Die aufgebrachte Kraft kippt die Falten Energielandschaft. Zum Beispiel, wenn eine Kraft auf eine Haarnadel aufgebracht wird, die Basenpaare nacheinander gebrochen, eine zu einem Zeitpunkt (Abbildung 1a). Die Rippen Gabel schreitet entlang der Schraubenachse, die senkrecht zu der aufgebrachten Kraft ist. Wenn dagegen eine minimale küssen Komplex ist unter Spannung, die beiden küssenBasenpaare, die parallel zu der aufgebrachten Kraft sind, teilen sich die Kraftbelastung (Abbildung 1b). Die unterschiedlichen Geometrien der Haarnadel und kissing Komplexes relativ zu der aufgebrachten Kraft infolge ihrer unterschiedlichen mechanischen Resonanz, die verwendet werden kann, um sekundäre und tertiäre Faltung 28,32 unterscheiden. Der theoretische Aspekt der mechanischen Entfaltung zuvor überprüft worden 8,9,30. Diese Arbeit werden die grundlegenden Ansätze zur Einrichtung und führen Sie eine Einzelmolekül-mechanische Entfaltung Assay.
Versuchsaufbau. In unserem mechanisches Ziehen Experiment wurde die RNA-Probe für Pinzetten aus der RNA von Interesse durch zwei doppelsträngige DNA / RNA flankiert Griffe (2) 7. Das gesamte Molekül kann zwei oberflächenbeschichteten Mikrometergröße Kügelchen (Spherotech) über Streptavidin-Biotin-und Digoxigenin-anti-Digoxigenin-Antikörper-Wechselwirkungen bzw. angebunden werden. Einem Wulst wird durch einen Kraftmess optischen tr gehaltenAP, während die andere an der Spitze einer Mikropipette gehalten. Der relative Abstand zwischen den Kügelchen können entweder durch die Steuerung der Falle oder Bewegen der Mikropipette geändert werden. Mit diesem Ansatz kann ein einzelnes RNA-Molekül Tethering die Perlen gedehnt und entspannt werden.
Herstellung der Proben. Die Synthese von RNA-Proben zum Zupfen beinhaltet einige Schritte (Abbildung 3). Zuerst wird die DNA-Sequenz, die dem RNA von Interesse zuerst in einen Plasmidvektor kloniert. Als nächstes werden drei PCR Reaktionen durchgeführt, um die zwei Handgriffe und eine Vorlage für die Transkription zu erzeugen. Die Transkription Vorlage umfasst die Griff Regionen und die eingefügten Sequenzen. Der Volllängen-RNA wird durch in vitro-Transkription synthetisiert. Zuletzt werden die RNA und chemisch modifizierte Griffe zusammen getempert, um die Moleküle zu zupfen erzeugen.
Kalibrierung und Betrieb der Pinzette. Das grundlegende Design des Minitweezers Einsatzd in dieser Arbeit folgt, dass der Dual-Beam-optischen Pinzette 33. Mit vielen Verbesserungen, die Minitweezers anzuzeigen außergewöhnliche Stabilität im Vergleich zur ersten Generation optischen Pinzette. Eine Reihe von Forschungsgruppen in mehreren Ländern die Minitweezers verwenden in ihren Einzelmolekül-Forschung 14,15,34-37. Die Details der Konstruktion, Kalibrierung und Betrieb des Gerätes, einschließlich Lehrvideos, sind in der "Pinzette Lab"-Website (http://tweezerslab.unipr.it) zur Verfügung. Dabei sind Verbesserungen und Kalibrierungsverfahren, die auf täglicher Basis durchgeführt werden müssen, im Detail beschrieben.
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Protocol
1. Vorbereitung von RNA-Molekülen für Einzelmolekül-zupfen
- Klonieren der Sequenz von Interesse. Klonierung der DNA-Sequenz, die dem RNA-Struktur in einen Vektor.
- Synthese und Reinigung der Transkriptionsvorlage. Synthetisieren eine Transkription Vorlage durch PCR. [Ort Tabelle 1 hier] nächstes reinigen die PCR-Produkte mit Hilfe eines PCR-Reinigungs-Kits, und konzentrieren sich die Probe auf> 200 ng / ul. Weil die gereinigte DNA wird für die Transkription verwendet wird, sollte RNase freies Wasser in den Elution und Konzentration verwendet werden.
- In-vitro-Transkription. Synthese von RNA durch in vitro-Transkription bei 37 ° C über Nacht, um RNA-Ausbeute zu maximieren. [Ort Tabelle 2 hier] Nach der Transkription, fügen 1 ul DNase I, um die DNA-Vorlage für 15 min bei 37 ° C zu verdauen. Reinige den RNA unter Verwendung einer Silica-Spin-Säule.
- Synthese der biotinylierten Griff A. Erste, produzieren die unveränderte Griff A durch PCR unter Verwendung von Primern Af und Ar und konzEntrate die amplifizierte DNA auf> 200 ng / ul. Als nächstes übernehmen Biotin-Modifikationen in den PCR-Produkt mit einer Primer-Extension-Reaktion. [Ort Tabelle 3 hier] HINWEIS: Das biotinylierte Griff A (Biotin-HA) können direkt in der Annealing ohne Reinigung verwendet werden. Wie das Biotin-HA mit RNA geglüht werden, ist es entscheidend, RNase-freiem Wasser in beiden Stufen zu verwenden.
- Synthese der Digoxigenin-modifizierten Griff synthetisieren B. Digoxigenin durch PCR modifiziert Griff B (dig-HB) unter Verwendung von Primer Bf und Digoxigenin-modifizierten Oligo Dig-Br (3). Nächsten, reinigen das PCR-Produkt und konzentrieren sich die Probe auf> 200 ng / ul.
- Annealing-RNA an den Griffen. Glühen die RNA mit Griffen. [Ort Tabellen 4 und 5 hier]
- Reinigen geglüht Probe. Hinzufügen 3 Volumen Ethanol der wärmebehandelten Probe und gut mischen. Speichern der Mischung bei -70 ° C für mindestens 1 Stunde. Spin-Down bei 15.800 xg und Überstand verwerfen. Trocknen Sie die Pellets mit einer Gefriertrocknungsanlage. Das Pellet in100 ul RNase freiem Wasser. ANMERKUNG: Die Probe kann nun verwendet werden kann und bei -20 ° C gelagert werden.
2. Kalibrierung und Betrieb der optischen Pinzette
- Kalibrieren Pixelgröße von Video-Monitor
- Verwenden Sie den optischen Falle zu fangen eine Perle mit bekanntem Durchmesser (Größe Standard).
- Machen Sie Bilder der gefangenen Perle mit Imaging-Software (Abbildung 4).
- Bestimmung der Durchmesser der Kugel mit der Bildverarbeitungssoftware auf der Basis der Schwerpunktmethode.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang zu einem Durchmesser von Perlen unterschiedlicher Größe zu bestimmen.
- Passen die gemessenen und bekannten Durchmesser der Kügelchen durch eine lineare Regression auf die physikalische Grße eines Pixels zu erhalten.
- Stellen Sie sicher, Entfernung Kalibrierung
- Verwenden Sie den optischen Falle zu fangen eine Perle.
- Bestimmt die Pixelposition seines Schwerpunkts von der Bildaufnahmesoftware und notieren Sie die Position mit den Minitweezers.
- Steuern die Wulst zu DIFFe mieten Positionen und wiederholen Sie die Positionsbestimmung.
- Konvertieren der X und Y-Positionen des Wulstes von Pixeln m Einheit unter Verwendung des kalibrierten Pixelgröße.
- Vergleichen der X und Y zwischen den Positionen von Video-und die Minitweezers gemessen. Die beiden Sätze von Werten sollten übereinstimmen. Als die Bildauflösung> 0,1 um, bewegen Sie den Wulst über 1 um zwischen den Messungen, um die Genauigkeit zu gewährleisten. Wenn der Abstand Kalibrierung ist nicht vergleichbar mit dem in den Minitweezers gespeichert, kalibrieren Sie das Instrument.
- Trap Steifigkeit Kalibrierung
- Nehmen Sie ein Wulst mit der optischen Falle und halten Sie sie immer noch.
- Notieren Sie die Kraft der Falle mit einem Bypass-schnelle Datenerfassung mit einer Geschwindigkeit> 5 kHz für 3 Sekunden.
- Erzeugen ein Leistungsspektrum von der Aufnahme der Wulst Bewegung mit der Software. Passen das Leistungsspektrum zu einer Lorentz (Abbildung 5) 38:
542 / 51542eq1.jpg "width =" 200 "/> (Gl. 1)
in dem S (f) ist die Leistung bei der Frequenz f ist, f c die Grenzfrequenz, und S 0 die asymptotische Kraft. Die Eckfrequenz f c ist die Frequenz, bei der die Leistung des Wärmebewegung auf die Hälfte des asymptotischen Wert verringert. Als f c variiert mit Laserleistung und Korngröße, kalibrieren jeden gefangen Perle einzeln. - Berechnen Sie die Federkonstante der Falle, κ, von f c:
(Gl. 2)
in dem γ ist der Widerstandskoeffizient des Wulst (Gl. 3). Verwenden Sie die Federkonstante Erweiterung Änderungen eines RNA aus Kraftänderung zu bestimmen.
- Law Test-Stokes '
- Nehmen Sie ein Wulst mit der optischen Falle. Bewegen des Wulstes hin-und Kraft mit unterschiedlicher Geschwindigkeit.
- Notieren Sie sich die Bewegung der Raupe und Kraft mit den Minitweezers.
- Berechnen des Radius des Wulstes.
HINWEIS: Die Reibungskraft, F d, die durch die Bewegung eines kugelförmigen Teilchens in einer Flüssigkeit erzeugt wird, durch das Stokessche Gesetz beschrieben werden:
(Gl. 3)
wobei r der Radius der Kugel, v die Geschwindigkeit ist und h die dynamische Viskosität der Flüssigkeit, die in Referenztabellen zu finden ist. Verwendung der gemessenen Kraft F D, kann der Radius des Wulstes mit Gleichung berechnet werden. 3 (Figur 6) und ist mit dem von der Bildaufnahme-Software bestimmt zustimmen. Die Stokes 'Gesetz Test effektiv testet die Gesamt Kalibrierungen und die Leistung des Gerätes.
(Gl. 2) 
(Gl. 3) 3. Nanomanipulation von RNA-Einzelmolekülen
- Fluidik machen.
- Bohren sechs Löcher (2 mm Durchmesser) auf einem Deckglas Nr. 2 (7a) und schneiden Sie drei Schlitze (2 mm Breite) in doppelseitigen Klebeband Polyimid (Abbildung 7b) mit einem Laser-Graveur.
- Machen Sie eine Flusskammer durch Zwischen zwei Deckglas mit zwei Schichten von doppelseitigen Klebeband Kapton. Legen Sie eine Mikropipette und zwei Bypassrohre zwischen dem Band (7c).
- Die Flusskammer auf einem Metallrahmen zu montieren durch pass fluidischen Löcher (Abbildung 7d).
- Verbinden der Fluidkanäle der Kammer auf 10 ml Spritzen mit Puffer der Wahl durch Polyethylenschläuche (7e) gefüllt.
- Die gesamte Kammer Halterung auf der optischen Pinzette zwischen den beiden Zielen. Sicherzustellen, dass die Vorderseite der Kammer mit dem Fluidkanäle nach rechts zeigt. Ziehen Sie die richtige Ziel und die Messingstifte des Rahmens (7e) anschließen, um Befestigungslöcher auf Ter Pinzette. Schrauben anziehen, um die Kammer Position zu fixieren.
- Mischen der wärmebehandelten Probe und Perlen. Mischen Sie die Probe mit geglüht Anti-Digoxigenin-beschichteten Kügelchen (dig-Kugeln), und lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 5-10 min zu bleiben. Typischerweise wird 1 ul der wärmebehandelten Probe mit 5 ul DIG-Kügelchen in 1 ml Puffer gemischt. HINWEIS: Die Menge der Kügelchen in der Strömungskammer geladen werden, sollten so gewählt werden, um sicherzustellen, eine angemessene Menge der Kügelchen von der Umgehungsröhre geliefert werden. Das Verhältnis der wärmebehandelten Probe an die Perlen nicht leicht quantifiziert werden. Im Idealfall haben die meisten Kügelchen keine RNA, so dass nur ein kleiner Anteil der Perlen kann nur ein RNA-Molekül pro Kügelchen haben. Da die Proben geglüht und die Partikelsuspension schwer zu quantifizieren sind, ist die beste und einzige Möglichkeit derzeit, das Mischungsverhältnis variieren und testen Sie die Mischung auf der Pinzette.
- Liefern Kügelchen zu der Reaktionsstelle in der Strömungskammer (dh wenige Mikrometer über der micropipette Spitze, 7c).
- Laden Sie eine Suspension von Streptavidin-beschichtete Beads (Perlen-Hals) in eine 1-ml-Spritze.
- Verbinden Sie die Spritze mit der fluidischen Gasweg des unteren Kanal der Strömungskammer (Abbildung 7a).
- Schieben Sie die Spritze mit dem Strep-Perlen in die Kammer fließen.
- Bewegen Sie die gesamte Kammer mit Motorsteuersoftware, um die optische Falle in der Nähe der Öffnung des unteren Bypassrohr (7b) zu platzieren. Dann durch einen Trackball betreiben die optische Falle, um eine Streptokokken-Perle zu erfassen.
- Bewegen der Wulst in der Nähe der Spitze der Mikropipette mit der Motorsteuerungssoftware.
- Ziehen Sie die Spritze in die Mikropipette verbunden, um die Perle auf der Mikropipette saugen.
- Gelten Strom sanft, indem Sie die Spritze mit dem Mittelkanal zu spülen, besonders Streptokokken-Perlen.
- Ebenso liefern die Mischung der Probe und die DIG-Perlen (siehe Schritt 3.2) an den oberen Kanal der Kammer.
- Nehmen Sie ein DIG-Wulst und bringen es nah an der Strep-Wulst mit der optischen Falle.
- Reinigen Sie den mittleren Kanal, der durch die Anwendung Fluss. HINWEIS: Der Strep und DIG-Kügelchen werden so ausgewählt, um verschiedene Größen aufweisen, so dass sie optisch unter dem Mikroskopaufnahme unterschieden werden (Abbildung 4).
- Fishing "ein Einzelmolekül-Tethering zwischen einem Paar von Perlen.
- Legen Sie die DIG-Wulst vertikal auf der Oberseite des Strep-Wulst (Abbildung 4).
- Bewegen Sie die DIG-Wulst nach unten in Richtung der Streptokokken-Perle durch die Lenkung der Falle. Öffnen Sie ein Kraft-Weg-Diagramm-Fenster auf Computer, um Kraft Veränderungen sichtbar zu machen.
- Beim Kontakt der beiden Perlen, bewegen Sie den DIG-Wulst senkrecht weg von der Strep-Perle.
- Wenn keine spezifischen Kontakt gemacht wird, bleibt die Kraft, fast Null. Wenn die beiden Wülste von Molekülen verbunden ist, steigt die Kraft beträchtlich, wenn die beiden Wülste trennt. Dieses Verfahren, das allgemein als "fishing" bezeichnet wird, ist oft perfORMED mehrmals auf jedes Paar von Perlen, um eine effektive Einzelmolekül-Halteseil finden.
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Representative Results
Durch den Raum begrenzt ist, wird Nanomanipulation von einzelnen RNA-Moleküle, die durch die nur mechanische Entfaltung Beispiele für RNA-Haarnadeln und ein RNA mit Tertiärstruktur demonstriert.
Manipulieren Einzel Hairpin Moleküle
Sobald ein Halteseil zwischen den Perlen hergestellt ist, kann Verlängerung und Kraft auf das Halteseil mit einem Benutzer-definierten Protokoll bearbeitet werden. Vier gemeinsamen Manipulation Protokolle werden häufig verwendet.
Kraft-Rampe Experiment. Die intuitive und gemeinsame Experiment, um einen einzelnen RNA zu manipulieren ist, um wiederholt zu strecken und zu entspannen, die das Molekül in der Richtung der Helixachse der Griffe (vertikal, wie in 4 gezeigt). Die Kraft F, und Trap Position, Y, als Funktion der Zeit aufgezeichnet. F / κ, in denen ist die Federkonstante der tra - die Ausdehnung des Moleküls, e, kann durch e = Y berechnet werdenSeite Die Ziehergebnis kann als Kraft-Dehnungskurve (8a) angezeigt werden. Die Dehnung der doppelsträngigen Griffe durch die ansteigende Kurve mit positiver Steigung dargestellt. Die Entspannungskurve der Griffe zeichnet, dass der Reck. Der Strukturwandel von einer einfachen, zwei-State-Klapphaarnadel zeigt eine "Abzocke" mit negativer Steigung, was auf einen einzigen, kooperative Entfaltungsübergang 39. Die Rückfaltung der Haarnadel wird durch ein "Reißverschluss" auf die Kraft-Dehnungs-Kurve angegeben. Wichtig ist, dass das gleiche Molekül entfaltet und jedes Mal bei unterschiedlichen Kräfte rückgefaltet werden. Ein solcher Trend ist offensichtlich auf den Ausschüttungen der Übergangs Kräfte (Abbildung 8b). Üblicherweise wird die Kraft als eine lineare Funktion der Zeit, das heißt geändert, in einem festen Laden / Entladen Rate. Unter einem konstanten Laden / Entladen Rate kann die Kraft abhängig Kinetik aus Ausschüttungen der Übergangs Kräfte 40-42 extrahiert werden.
Constant Force Experiment. Unter der konstanten Kraft-Modus bietet das Gerät einen Rückkopplungsmechanismus, um die Kraft Abweichungen von einem Sollwert auszugleichen. Die Verlängerung eines RNA-Moleküls wird als eine Funktion der Zeit (Abbildung 9) aufgezeichnet. Einstellen der Kraft an oder nahe dem Übergang Kraft des bestimmten RNA-Molekül Übergang erlaubt die Beobachtung und Quantifizierung der molekularen Dehnungszustände. Die Lebensdauern der Moleküle in jedem Zustand können zusammengeführt werden, um die Kinetik der strukturellen Übergang 7 zu berechnen. Die Konstantkraft Experiment verwendet wird, um eine reversible Faltung, wie sie von Haarnadeln 7,28 überwachen.
Kraft Jump Experiment. In einem Kraftsprung-Experiment wird die Kraft schnell in einen anderen Wert geändert und konstant gehalten; die Lebensdauer der erste Übergang 43 überwacht. Die Kraft Sprung ist besonders nützlich, um die Kinetik zu charakterisierenirreversible Prozesse, da die Lebensdauer der Vorwärts und Rückwärtsreaktionen direkt getrennt an verschiedenen Kräfte gemessen werden. Bei jedem Sprung Kraft / Drop, wird nur eine Lebenszeit beobachtet. Daher mehrere Runden der Versuche müssen, um eine ausreichende Kinetik Beobachtungen extrahieren sammeln geführt werden.
Passive Experimente. Unter der passiven Betriebsart werden die Positionen der Falle und der Mikropipette fixen (Abbildung 10). Eine Haarnadel zeigt zwei Zustände entsprechend entfaltet und gefaltet RNA in der Nähe von seinem Übergangskräfte. Im Gegensatz zu der konstanten Kraft Experiment sowohl die Kraft und Ausdehnung des Moleküls Änderung bei der Gefügeumwandlung. Beseitigung Regelung ermöglicht molekulare Übergänge, um direkt ohne Einmischung von außen überwacht werden. Jedoch ist es schwierig, konstante Kraft aufrecht zu erhalten unter der passive Modus zeigt. Da die eingeschlossene Wulst diffuse in der optischen Falle, Kraft ändert sich entsprechend. ThE passiven Modus ist für die Messung Molekülzuständen mit langen Verweilzeit, in der Kraft wesentlich verändert ungeeignet. Die Vor-und Nachteile der konstanten Kraft und passive Modi wurden umfassend untersucht und diskutiert 44.
Entwirren Sie Folding von sekundären und tertiären Strukturen
Mechanische Entfaltung eines zwei-Basenpaar küssen RNA durch zwei miteinander verbundene GACG Tetraloop Haarnadeln gebildet wird hier als Beispiel (Abbildung 11a) eingesetzt. Beide Haarnadeln ein 9-Basenpaar-Stamm, wenn die Stammsequenzen unterschiedlich sind. Die mechanische Entfaltung Pfad der RNA (Abbildung 11a) wurde von Kraftrampe Methoden 34 gekennzeichnet. Wenn die Kraft erhöht wird, wird die erste komplexe küssen brochen, gefolgt von aufeinanderfolgenden Entfaltung der Haarnadeln. Auf der Rückfaltung, falten die Haarnadeln, gefolgt von einer Wechselwirkung bei niedrigen küssen Kraft. Diese Übergänge von der Kraft-Dehnungs-Kurve sichtbar sind (Abbildung11b). Um die Zuordnung der Haarnadel-Übergänge zu bestätigen, kann jede der Haarnadeln einzeln untersucht werden. Die Zuordnung der unkissing / küssen Übergänge können durch das Studium eine mutierte RNA, bei der die Tetraloops mutiert, um die Bildung der Interaktions küssen 28 verhindern prüft werden. Alternativ kann die niedrigste Kraft bei 10 pN, höher als die küssen Kräfte eingestellt werden. Wie erwartet, ist die Kraft-Dehnungs-Kurve unter solchen Bedingungen, zeigt nur das Entfalten / Rückfaltung der Haarnadeln (11c) 34. Daher ist es möglich, zu untersuchen, Falten des kissing Interaktion und jeder der beiden Haarnadeln unabhängig voneinander bei unterschiedlichen Kräften.
Auffällig ist, dass die Faltung der beiden Haarnadeln ist reversibel, während die küssen Interaktion ist sehr irreversibel, wie offensichtlich von sehr unterschiedlichen unkissing und küssen Kräfte und durch große Hysterese. Daher können die Klapp Kinetik der Haarnadeln sucht werden directly mit den konstanten Kraft Experimenten. Die Kinetik der Interaktion küssen, muss jedoch mit der Kraft springen Verfahren gemessen werden. Die Abbildung 12a zeigt eine typische Kraft Sprung Experiment 28. Bei 3 pN, wird die gesamte RNA gefaltet. Die Kraft wird dann schnell auf 22 pN erhöht und konstant gehalten. Nach einigen Sekunden wird die gesamte RNA wird in einen Einzelstrang als offensichtlich durch einen plötzlichen Anstieg der Ausdehnung von ~ 30 nm entfaltet. Die Kraft wird dann auf 30 pN angehoben, um die RNA weiter dehnen, bevor es bis 13 pN abgesenkt ist. Nach dem Falten der Haarnadeln, wird die Kraft schnell auf 8 pN tropft. Die Bildung des Komplexes wird durch Küssen Verkürzung der Erweiterung durch ~ 7-8 nm angegeben. Durch das Sammeln von vielen dieser Lebensdauermessungen, unkissing und küssen Kinetik bei konstanter Kräfte berechnet werden.
Unter allen Versuchsbedingungen wird die komplexe küssen immer zuerst entfaltet. Bei Kräften, dass die Haarnadeln sind instabil durch sie selbst, das Küssen InteractIonen schützt die Haarnadelstrukturen aus Entfaltung. Solch eine geschwindigkeitsbegrenzenden Wirkung wird auch mit Gewalt Sprung Experimente zeigten. Wie in der Figur 12b 28, wenn die Kraft auf 16 pN sprang gezeigt, bleibt die Verlängerung des Moleküls im Wesentlichen unverändert für ein paar Sekunden, gefolgt von einer Erhöhung der Entfaltung der Verlängerung von ~ 20 nm aufweist. Die Änderungen in der Verlängerung zeigte die schwächeren sieben Basenpaaren Haarnadel wird direkt nach der entfaltete stören küssen komplex. Die Metastabilitäts der Haarnadel ist von den Lebenszeiten deutlich. Sobald das Küssen ist gebrochen, die Haarnadel schnell Transite zwischen gefalteten und entfalteten Zuständen; die Lebensdauern von weniger als 1 Sekunde. Im Wesentlichen ist diese Beobachtung eine konstante Kraft Experiment zur Entfaltung der Haarnadel. Im Gegensatz dazu dauert es über 10 Sekunden, um das Küssen Komplex zusammen mit der Haarnadel zu brechen. In ähnlicher Weise wird Kraft von 17,7 pN (12c), an dem die gesamte RNA wird in einen Einzelstrang, wie ersichtlich durch die in ungefaltet, sprangFalte in der Verlängerung von ~ 30 nm aufweist. Die Bistabilität des großen, 11-Basenpaar-Haarnadel kann gesehen werden, wie die Verlängerung Hops zwischen zwei Werten. Auch hier sind die kurze Lebensdauer der Haarnadel in scharfem Kontrast zu seiner langen Lebensdauer in der metastabilen Zustand. Mit einer Kombination aus Kraft und Kraft Rampe springen Experimente, die Thermodynamik und Kinetik der einzelnen Entfaltung / Klapptritt gemessen 28 werden. Direkte Beobachtungen der Bruch und die Bildung des Komplexes küssen können wir energetischen Beiträge von flankierenden Basen der minimalen küssen Komplex 34 zu analysieren und die Salzabhängigkeit der Interaktion küssen 45 zu messen.
Abbildung 1. RNA-Strukturen relativ zu der angelegten Kraft. a) Eine Haarnadel unter Spannung. b) Ziehen eines zwei-BasePaar küssen komplex. Die zwei Haarnadelschleifen sind in rot und gelb gefärbt.
Abbildung 2. Versuchsaufbau. Die RNA-Struktur wird von zwei DNA / RNA-Griffe flankiert. Durch die chemische Modifikationen an den Enden der Handgriffe kann das gesamte Molekül zu einem Paar von proteinbeschichteten Mikrometergröße Kügelchen verbunden werden. Einer der Perlen wird durch eine steuerbare, kraftmess optischen Falle gehalten. Der andere basiert auf einer Mikropipette, die durch einen piezoelektrischen flexture Stufe angetrieben wird, angeordnet. Die Zeichnung ist nicht maßstäblich.
Abbildung 3. Eine allgemeine Regelung zur RNA-Moleküle mit Griffen zu synthetisieren. Der Griff A, B behandeln, und transcription Vorlage durch PCR aus einem Plasmid mit der RNA-Sequenz kloniert erzeugt. Der Griff wird durch eine digoxigenins (DIG) am 3'-Ende modifiziert. Der Griff B eine Modifikation an Biotin am 5'-Ende des einen Strangs. Die volle Länge RNA wird von der Transkriptions Vorlage transkribiert. Die RNA und modifizierten Griffe werden vermischt und geglüht. Die einwand Moleküle gebunden an ein Paar von Wülsten durch Streptavidin und Anti-Digoxigenin-Antikörper beschichtet ist. Die Zeichnung ist nicht maßstäblich.
Abbildung 4. Bilder von Fischerei ein Einzelmolekül zwischen zwei Perlen von der Videokarte erfasst. Ein Wulst an der Spitze einer Mikropipette abgesaugt platziert. Die andere gehalten wird und durch eine Kraftmesslichtfalle gelenkt. Die Richtungen der Falle Bewegungen durch Pfeile angedeutet. Die eingeschlossenen Wulst ersten Schrittevertikal zu der Wulst an der Mikropipette. Kontakte auf, bewegt sich das eingeschlossene abperlt. Wenn ein Halteseil zwischen den Perlen gegründet, zieht die Trennung von Perlen auf dem Molekül und Kraft nimmt zu, wenn das Molekül verlängert. Wenn zwei Perlen sind von keinem Molekül verbunden, erzeugt der Rückzugsbewegung keine Kraft.
Figur 5 ein Leistungsspektrum der Brownschen Bewegung der gefangenen Perle. Die ausgezogene Kurve ist eine Anpassung an die Lorentz-Gleichung (Eq. 1), in dem Einsatz gezeigt. Die Federkonstante der Falle aus der Eckfrequenz (Gl. 2) berechnet werden.
Abbildung 6. Ein Beispiel für das Gesetz von Stokes-Test.
Abbildung 7. Ein Durchflusskammer für zupfen. a) Sechs Löcher, die jeweils mit einem Durchmesser von 2 mm, werden in eine Nr. 2 Deckglas mit einem Laser-Gravur. b) Drei 2 mm breite Schlitze in doppelseitigen Polyimid-Bänder geschnitten gebohrt. c) Ein genauer Blick im experimentellen Bereich, der die Mikropipette und die zwei Bypass-Rohre. Die Perlen aus den oberen und unteren Kanäle durchqueren durch ihre jeweiligen Bypassrohre (blau und grün) der CENtralen Kanal in den durch Pfeile angedeuteten Richtungen. d) Montieren Sie die fluidische Kammer auf einem Metallrahmen mit passenden fluidischen Löcher. e) ein Drei-Kanal-Kammer fließen Rohre verbunden sind. Der Zentralkanal ist für das Ziehen von RNA verwendet. Der obere (blau) und unten (grün) Kanäle für die Bereitstellung von Perlen verwendet. Die experimentelle Region wird von einem roten Quadrat gekennzeichnet.
Abbildung 8. Force-Rampe. a) Eine Kraft-Dehnungskurve von mechanisch Entfaltung einer Haarnadel. Ziehen ist in blau und Entspannung in rot dargestellt. Die Entfaltung / Rückfaltung der Haarnadel werden durch die Pfeile angezeigt. B) Verteilungen der Entfaltung (blau) und der Rückfaltung (rot) Kräfte der Haarnadel. Die Figur ist aus einem Manuskript eingereicht 39 angepasst.
Abbildung 9. Ein RNA-Haarnadel unter konstanter Kraft. a) Schematische Darstellung der Experiment. Die Position der Falle wird durch Rückkopplung über die Zeit für Haarnadel un / Abkanten verändert, um eine konstante Kraft auf die Haarnadel. B aufrechtzuerhalten) Kraft und Position. Da die Kraft konstant gehalten wird, schwankt die Position der Falle zwischen zwei Werten, Bistabilität zeigt der Haarnadel in die Kraft. Die Binomialverteilung der Falle Verteilung ergibt die Erweiterung Änderung nach der Haarnadelkurve Entfaltung von 19,4 ± 0,2 nm auf. Die Figur ist aus einem Manuskript eingereicht 39 angepasst.
Abbildung 10. Passivmodus einer Haarnadel. a) B) Kraft und Erweiterung als Funktion der Zeit einer Haarnadel unter passiven Modus.
Abbildung 11. Force-Rampe der zwei-Basenpaar küssen RNA. a) Hierarchische Faltung eines zwei-Basenpaar küssen RNA unter mechanischer Spannung. b) Kraft-Dehnungs-Kurve. Strukturübergänge sind durch Pfeile. C) Kraft-Dehnungs-Kurve, wenn die niedrigste Kraft bei 10 pN gesetzt, um die Interaktion zu verhindern küssen angezeigt. Der figurieren wird mit Genehmigung von Journal of American Chemical Society 34 angepasst.
Abbildung 12. Force-Sprung von der Zwei-Basenpaar küssen RNA. a) Eine Kraft, Sprung / Drop-Zyklus unkissing und küssen Lebenszeiten bei zwei verschiedenen Kräfte zu messen. Das obere Feld zeigt die Zeitspur von Gewalt. Das untere Feld zeigt die relative Ausdehnung des Moleküls. Die Kraft wird zuerst sprang von 3 bis 22 pN pN, um die Lebensdauer des Komplexes küssen bei 22 pN zu messen. Die unkissing durch einen schnellen Anstieg der Verlängerung von ~ 30 nm angegeben, die die gesamte RNA wird in einen Einzelstrang entfaltet. Entspannung wird die Kraft bis auf 14 pN hochgefahren, damit die beiden Spitzkehren zu falten. Die Kraft wird dann sank auf 8 pN. Bildung des küssen Wechselwirkung wird durch Abnahme der Erweiterung von ~ 7-8 nm angegeben b.)Als Kraft auf 16 pN sprang, zeigt die Zeit-Ausdehnungskurve, dass es dauert mehrere Sekunden, bis die küssen komplex und der Sieben-Basenpaar-Haarnadel, sich zu entfalten, nach der Haarnadelkurve faltet und entfaltet sich rasch. C) Der gesamte Komplex ist Küssen in einem einzigen Strang wenige Sekunden nach Kraft auf 17,7 pN sprang entfaltet. Die verbleibende Spur zeigt die Bistabilität des 11-Basenpaar-Haarnadel. Jeder der Strukturübergänge in die Entfaltung der RNA küssen zeigt markante X. Die Figur wird mit Genehmigung von Proceedings of National Academy of Sciences 28 angepasst.
| Reagens | ul |
| Plasmid (10 ng / ml) | 10 |
| Primer T7F (100 mM) | 10 |
| Primer Br (100 mM) | 10 |
| dNTP-Mix (je 25 mM) | 10 |
| 10xPCR-Puffer | 100 |
| H 2 O | 850 |
| Taq-DNA-Polymerase | 10 |
| Gesamt | 1000 |
Hinweis: Ein typischer Wärmezyklus für die Synthese von 3 kbp-DNA: 95 ° C 45 Sekunden 53 ° C 1 Minute, 72 ° C 3 Minuten.
Tabelle 1 Ein Beispiel für die Synthese von PCR-Transkriptionsvorlage.
| Reagens | ul |
| Schablone (> 200 ng / mL) | 8 |
| NTPs | 8 (2 ml) |
| 10x Reaktionspuffer | 2 |
| T7-RNA-Polymerase | 2 |
| Gesamt | 20 |
Hinweis: Inkubieren der Reaktion bei 37 ° C overnight.
Tabelle 2. In-vitro-Transkription.
| Reagens | ul |
| Griff A (~ 10 mg) | 50 |
| Biotin-11UTP | 5 |
| T4 pol Reaktionspuffer | 5 |
| BSA-Lösung | 1 |
| T4-DNA-Polymerase | 5 |
| Gesamt | 66 |
Hinweis: Inkubieren der Reaktion bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Inaktivierung des Enzyms durch Erwärmen auf 70 ° C für 20 Minuten, gefolgt von langsamer Abkühlung auf Raumtemperatur.
Tabelle 3. Primer-Extension-Reaktion.
| Reagens | ul |
| Formamid | 800 |
| EDTA (0,5 M, pH 8,0) | 2 |
| PIPES (1 M, pH 6,3) | 40 |
| NaCl (5M) | 80 |
| Gesamt | 922 |
Tabelle 4. Rezept des Glühen Puffer.
| Reagens | |
| Biotin-HA | 1.000 ng |
| Dig-HB | 1.000 ng |
| RNA | 1.000 ng |
| Annealing-Puffer | 80 ml |
Hinweis: Ein typischer Wärmezyklus für das Glühen ist: 95 ° C 10 min 62 ° C 1 h 52 ° C 1 Stunde, gefolgt von Erhöhen auf 4 ° C beträgt.
Tabelle 5. Glühen RNA mit Griffen.
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Discussion
Umbau und Fehlerbehebung in Vorbereitung der Proben Tweezing
Wahl des Klonens von Vector. Obwohl die hier beschriebenen allgemeinen Schema (Figur 3) erfordert keine besondere Klonierungsvektor wird der Vektor bevorzugt, keine intrinsische T7 oder T3-Promotor für die Leichtigkeit der Transkription, so dass ein Promotor mittels PCR an den gewünschten Positionen eingebracht werden müssen.
Reihenfolge und Länge der Griffe. Es gibt keine spezifische Sequenz Voraussetzung für den Griffen. Es wird jedoch eine enge GC AT Verhältnis bevorzugt, während homopolymeren und hoch wiederholten Sequenzen sollten vermieden werden. In veröffentlichten Arbeiten werden die beiden Griffe als gleicher Länge, so dass die RNA-Struktur von Interesse ist etwa in der Mitte plaziert gehalten. Frühere Arbeiten zeigt, dass die Gesamtlänge der Griffe variiert von 500 bis 10.000 Basenpaare subtil beeinflusst die gemessenen Kinetik 46,47.
ve_content "> Qualitätsüberprüfung und Quantifizierung der geglühten Mischung. neben der beabsichtigten RNA mit Griffen, enthält das Endprodukt auch nicht getemperten DNA Griffe und RNAs, sowie andere. Es ist schwierig und unwirtschaftlich, die Pinzette Moleküle zu reinigen. Stattdessen wird das geglühte Mischung kann direkt für Pinzetten verwendet werden, da nur die korrekt geglüht Nukleinsäuren auf zwei Oberflächen beschichteten Kügelchen gebunden werden. richtig getempert Produkt ist auch schwierig, von den Griffen und der RNA auf Agarosegel-Elektrophorese zu unterscheiden. Die beste Art und Weise zu testen, Die Qualität und die Konzentration des geglühten Produkts zu quantifizieren, ist es auf der Pinzette zu testen. Es ist jedoch hilfreich, um zu überprüfen und zu quantifizieren, die PCR und die Transkriptionsprodukte in jeder Stufe unter Verwendung von verschiedenen molekularbiologischen Techniken.Alternative Ansätze zur Tether RNA an Perlen. Es gibt viele denkbare Methoden zur RNA-Moleküle auf Oberflächen kovalent oder nicht-kovalent zu verknüpfen 48
Single gegen Multiple-Molekül Tether. Ein Paar von Streptomycin und DIG-Perlen kann von mehreren Molekülen verknüpft werden. Um herauszuarbeiten, wie die Möglichkeit der Mehrfachmoleküle Tethering den Wulst, müssen die Kraft-Weg-Kurven, um genauer untersucht werden. Einzelmolekül-Halteseil zeigen eine wurmartige Kette Elastizität 4, die im Allgemeinen in Multi-Molekül Anbindehaltung im Verborgenen ist. Weitere Kontrollexperimente spezifisch für jedes System kann für die Bestätigung der Einzelmolekül-Halteseil erforderlich.
Verbesserungen der Minitweezers
Schnelle und langsame Datenerfassung. Die Minitweezers hat eine eingebaute Datenerfassung, die Datenblöcke zu 21 Geräteparameter mit einer Rate von 200 Hz in einem Computer, der als Bedienrechner in dieser Arbeit bezeichnet wird. Doch einige Anwenons und Kalibrierungen erfordern eine schnelle Datenerfassungsrate. Zu diesem Zweck werden die elektronischen Signale von Kraft und Weg aufgeteilt, um in einem neuen Computer, der "fast-Aufnahme" Computer aufgezeichnet werden, zusätzlich zu der Datenerfassung in dem Bedienrechner. Die schnell Aufzeichnungs Computer liest Daten über einen separaten Datenerfassungskarte und Software, die mehrere Kanäle mit bis zu 1 MHz ermöglicht. Der neue Computer und Datenerfassung nicht mit dem Betrieb des Instruments, die nur von dem Betriebscomputer gesteuert wird, stören. In einem Experiment werden gleichzeitig Daten auf beiden Computern mit unterschiedlicher Geschwindigkeit aufgezeichnet. Zeitsynchronisation bei der Datenanalyse durch Vergleichen der entsprechenden Datendateien durchgeführt.
Videobild-Aufnahme. Eine Video-Karte und Bildbearbeitungssoftware sind auf die schnelle Aufnahme-Computer installiert werden, um Live-Bilder der Reaktion zu erfassen und Videobilder zu analysieren. Diese Entwicklung ermöglicht die Umsetzung ter Pixelgröße und Abstand Kalibrierungen oben beschrieben.
Einschränkungen und zukünftige Anwendungen der Methode
Verfahren genau bearbeiten und messen Konformationsänderungen eines einzelnen RNA-Molekül diskutiert. Solche Fähigkeiten ermöglichen es, strukturelle Umlagerung eines RNA-Stranges in Echtzeit überwachen. Weiterhin kann Kraft verwendet, um die RNA-Struktur und Faltungswege beeinflussen, so dass selten und / oder weniger als optimale Strukturen gefaltet werden kann.
Es gibt jedoch Einschränkungen der mechanischen Ansatz. Am wichtigsten ist, die Erweiterung, die verwendet wird, um Konformationsänderungen zu interpretieren, ist eine eindimensionale Projektion der dreidimensionalen Strukturen. Es ist möglich, dass einige Konformationsänderungen nicht gemessen werden 49-52 und / oder kinetischen Barrieren werden aus Beobachtungen 53 verborgen. Es gibt auch verschiedene Instrumentaleffekte und Einschränkungen, die eine kannFFEKT beobachtet Thermodynamik und Kinetik 44,46,47.
Die optische Pinzetten wurden verwendet, um eine begrenzte Anzahl von RNA-Strukturen zu untersuchen, verglichen mit zahlreichen Transkripte durch genomweite Erhebungen 54 vorgeschlagen. Die Technik wird verwendet, um verschiedene Strukturmotive und große RNAs zu untersuchen. Darüber hinaus wird das Verfahren neue Anwendungen in RNA Forschung. Zum Beispiel, RNA-bindenden Liganden und Proteine stabilisieren oder die RNA-Struktur, die mit dem mechanischen Ansatz gemessen werden kann.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minitweezers | Steven B. Smith Engineering | http://tweezerslab.unipr.it | |
| Data acquisition card | National Instruments | USB-6351 | |
| Video card | National Instruments | PCI-1407 | |
| Labview programming software | National Instruments | ||
| NI Vision Builder | National Instruments | ||
| Laser engraver | Epilogue laser systems | Zing-16 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MEGAscript T7 kit | Life Technologies | AM1334 | |
| MEGAclear kit | Life Technologies | AM1908 | |
| Biotin-11-UTP | Thermo Fisher | FERR0081 | |
| T4 DNA polymerase | New England Labs | M0203 | |
| Streptavidin coated microsphere | Spherotech | SVP-20-5 | |
| Antidigoxigenin coated microsphere | Spherotech | DIGP-20-2 | |
| Size standard microspheres | Spherotech | PPS-6K | |
| Kapton tape | Kaptontape.com | KPPTDE-1 | |
| No. 2 cover glass | Thermo Fisher | 12-543D |
References
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