Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Nanomanipulation من واحدة RNA الجزيئات بواسطة الملقط البصرية

Published: August 20, 2014 doi: 10.3791/51542
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 4,5
1Nanoscale Engineering Graduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 2Nanoscale Science Undergraduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 3Nanobioscience Constellation, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 4The RNA Institute, University at Albany, State University of New York, 5Department of Biological Sciences, University at Albany, State University of New York

Abstract

هو كتب جزء كبير من الجينوم البشري ولكن لم تترجم. في هذا العصر الجينومي آخر، وقد تبين أن المهام التنظيمية من الحمض النووي الريبي لتكون ذات أهمية متزايدة. وظيفة RNA غالبا ما يعتمد على قدرته على اعتماد هياكل بديلة، فمن الصعب التنبؤ RNA الهياكل ثلاثية الأبعاد مباشرة من التسلسل. يقترب احد جزيء تظهر إمكانات لحل مشكلة RNA تعدد الأشكال الهيكلي من خلال مراقبة الهياكل الجزيئية جزيء واحد في كل مرة. يقدم هذا العمل وسيلة للتلاعب على وجه التحديد للطي وبنية جزيئات الحمض النووي الريبي واحدة باستخدام ملاقط بصرية. أولا، طرق لتجميع وصفها جزيئات مناسبة للجزيء واحد العمل الميكانيكي. وتناقش المقبلة، مختلف الإجراءات المعايرة لضمان عمليات السليم للملاقط بصرية. المقبل، وأوضح تجارب مختلفة. للتدليل على فائدة هذه التقنية، نتائج تتكشف ميكانيكيا دبابيس الشعر RNA و RNA واحد كيسينوتستخدم ز مجمع كدليل. في هذه الأمثلة، تم استخدام تقنية nanomanipulation لدراسة لطي من كل مجال الهيكلي، بما في ذلك الثانوية والثالثية، بشكل مستقل. وأخيرا، وتناقش القيود والتطبيقات المستقبلية لهذه الطريقة.

Introduction

منذ فترة طويلة رافقت تطور تقنية ملاقط بصرية مع تطبيقه في الأبحاث البيولوجية. عندما اكتشفت لأول مرة تأثير محاصرة البصرية، لاحظ آرثر Ashkin أن البكتيريا في المياه الملوثة يمكن محاصرين في التركيز الليزر 1. منذ ذلك الحين، أصبحت محاصرة البكتيريا وغير مقصود، تجربة ممتعة لأجيال من طلاب الفيزياء الحيوية وكذلك أداة بحثية جادة لدراسة علم وظائف الأعضاء الميكروبية 2،3. تستخدم تقنية محاصرة البصرية شعاع الليزر مركزة لشل حركة كائن مجهري 1. عمليا، فخ الليزر وظائف باعتباره الربيع البصري، الذي يقيس أيضا القوة (F) على الكائن المحاصرين من النزوح لها من مركز فخ (ΔX). ضمن نطاق قصير، F = κ س ΔX، في κ هو ثابت ربيع الفخ. فخ البصرية يمكن أن تستخدم لممارسة القوة في picoNewton (PN) الدقة إلى صغار جداالكائن copic وقياس موقفها مع نانومتر الدقة. في العقدين الماضيين، أصبحت ملاقط بصرية واحدة من التقنيات جزيء واحد الأكثر استخداما في الفيزياء الحيوية. واستخدمت هذه التقنية لدراسة لطي واليات 4-6 DNA، RNA 7-9، والبروتينات 10،11. كما تم استخدام ملاقط بصرية لمراقبة تكرار الحمض النووي 12، RNA النسخ 13، وتخليق البروتين 14،15، فضلا عن العديد من الأحداث الجزيئية البيولوجية الأخرى 16-18.

ويعمل نهج واحد جزيء RNA في البحوث الهيكلي أساسا لاستكشاف المناظر الطبيعية الوعرة الطاقة للطي من الحمض النووي الريبي. تسلسل RNA يمكن طيها عادة في هياكل متعددة مستقرة ويستبعد بعضها بعضا، وذلك بسبب قواعد التركيب الكيميائي والتقشير قاعدة بسيطة من الحمض النووي الريبي. منذ فترة طويلة كان من المعروف أن RNA تعدد الأشكال الهيكلية، مثل أن يحدث في riboswitches 19،20، يلعب دورا هاما في تنظيم الجينات. وrecenوقد كشف مسح ر الجينوم على نطاق أن تغيرات درجة الحرارة صغيرة مثل بضع درجات تؤثر بشكل كبير هيكل والبروتين من جزء كبير من Transcriptome على الخلوي 21. تلميحات هذا المثال أن الدور البيولوجي للRNA البديل للطي هو ربما أكثر أهمية وانتشارا مما كان يفترض سابقا. تعدد الأشكال الهيكلي، ومع ذلك، يشكل تحديا للنهج البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية التقليدية، التي تدرس متوسط ​​خصائص العديد من الجزيئات. على سبيل المثال، "على" والتشكل "OFF" لriboswitch حصرية بشكل متبادل. هيكل المتوسط ​​المستمدة من الهياكل غير متجانسة من غير المحتمل أن تشبه أي من المتشاكلات ذات الصلة من الناحية البيولوجية. وعلاوة على ذلك، RNA الأهرام ومرنا عادة ما تشكل الهياكل. تفاعلها مع البروتينات والرنا التنظيمية يتطلب عادة تتكشف من الهيكل الحالي كجزء من التفاعل. لذلك، ودراسة RNA تتكشف / refolding يصبح وثيقة الصلةقضية البيولوجيا RNA. لمواجهة مثل هذا التحدي، فقد تم توظيف نهج واحد جزيء RNA لكشف تعدد الأشكال الهيكلي من خلال دراسة جزيء في وقت واحد 22-27.

بالمقارنة مع شعبية واحدة جزيء طريقة مضان، ملاقط استنادا الميكانيكية تتكشف تقدم ميزة أن التشكل من الجزيئات الفردية يمكن التلاعب بالقوة التطبيقية وقياسها بدقة نانومتر. ويمكن استخدام هذه القدرة nanomanipulation لمراقبة تتكشف / للطي من المجالات البنيوية الفردية بحيث للطي الهرمي من RNA كبير يمكن تشريح 28. بدلا من ذلك، ضفيرة واحدة يمكن أن توجه إلى أضعاف في واحدة من عدة المتشاكلات. أو هيكل قائم يمكن أن يتسبب ميكانيكيا لrefold إلى التشكل مختلفة 29. تحت الظروف البيولوجية، بنية RNA يمكن تغييرها بناء على التغير في درجة الحرارة أو يجند ملزمة. القدرة على التلاعب مباشرة ق الجزيئيةtructure يفتح مكان جديد من الحمض النووي الريبي دراسة الهيكلية. من حيث المبدأ، والتقنيات الميكانيكية الأخرى، مثل مجهر القوة الذرية وملاقط المغناطيسية، يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة لطي من جزيئات الحمض النووي الريبي واحدة. ومع ذلك، هذه الطلبات تقتصر إلى حد كبير نظرا لدقة المكاني منخفض نسبيا 30.

توظيف ملاقط بصرية يسمح الهياكل RNA أن تكشفت بالقوة الميكانيكية.

ميزة الميكانيكية التي تتكشف هي عدة أضعاف. ويمكن استخدام القوة لتتكشف الهياكل كلا الثانوية والثالثية، في حين ايونات المعادن ويجند الناجم لطي تقتصر أساسا إلى هياكل التعليم العالي. درجة الحرارة وممسخ يمكن أن تؤثر تأثيرا كبيرا على أنشطة المياه والمواد المذابة. في المقابل، يتم تطبيق قوة محليا إلى التشويش على الهياكل الجزيئية. تأثير القوة على البيئة المحيطة لا يكاد يذكر. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام أفضل ذوبان الحراري لدراسة ديناميكا الحرارية للطي الهياكل RNA الصغيرة،في حين تم استخدام ملاقط بصرية لدراسة الهياكل RNA مع أحجام مختلفة، تتراوح بين سبعة tetraloop دبوس قاعدة الزوج 28 إلى ribozyme 400 النوكليوتيدات 31. وعلاوة على ذلك، والهياكل RNA يمكن تكشفت ميكانيكيا في درجات حرارة متوسطة الحرارة. في المقابل، تتكشف الرنا في تجربة ذوبان الحرارية، ودرجة الحرارة وعادة ما المثارة أعلاه جيدا درجات الحرارة الفسيولوجية، مما يزيد بشكل كبير RNA المائي، خاصة في وجود أيونات المغنيسيوم 2+.

من المهم أن نلاحظ أن التأثير الميكانيكي للقوة يعتمد على كيفية تطبيقه على هيكل. قوة التطبيقية يميل المشهد الطاقة للطي. على سبيل المثال، عندما يتم تطبيق قوة إلى منعطف حاد، يتم تقسيم أزواج قاعدة بالتتابع، في وقت واحد (الشكل 1A). شوكة تمزيق تقدم على طول محور حلزونية، وهو عمودي على القوة المستخدمة. في المقابل، عندما مجمع التقبيل الحد الأدنى هو تحت التوتر، وهما التقبيلأزواج قاعدة، هي موازية للقوة التطبيقية، تبادل الحمل القوة (الشكل 1B). هندستها مختلفة من دبوس الشعر والتقبيل قريب معقدة إلى نتيجة القوة المطبقة في استجابتها الميكانيكية المختلفة، والتي يمكن استخدامها للتمييز بين الثانوي والعالي للطي 28،32. تم استعراض الجانب النظري من الميكانيكية التي تتكشف في وقت سابق 8،9،30. ويعرض هذا العمل النهج الأساسية لإعداد وتنفيذ واحد جزيء الميكانيكية فحص تتكشف.

الإعداد التجريبية. في تجربة سحب الميكانيكية لدينا، وتتكون عينة الحمض النووي الريبي لنتف الريش من الحمض النووي الريبي التي تهم يحيط بها اثنان مقابض DNA / RNA المزدوج تقطعت بهم السبل (الشكل 2) 7. يمكن المربوطة الجزيء بأكمله لاثنين من الخرز ميكرون حجم المغلفة سطح (Spherotech) عبر streptavidin البيوتين وتفاعلات الأجسام المضادة digoxigenin-مكافحة digoxigenin، على التوالي. يقام حبة واحدة من قبل آر البصرية قياس القوةا ف ب، في حين أن الآخر هو عقد على غيض من micropipette. المسافة النسبية بين حبات يمكن تغيير إما عن طريق توجيه فخ أو نقل micropipette. باستخدام هذا النهج، جزيء RNA وحيد يربطون حبات يمكن أن تمتد والاسترخاء.

إعداد العينات. تجميع عينات الحمض النووي الريبي لنتف الريش يتضمن خطوات قليلة (الشكل 3). أولا، يتم استنساخ تسلسل الحمض النووي RNA المقابلة لمن الفائدة لأول مرة في ناقلات البلازميد. بعد ذلك، يتم تنفيذ ثلاثة تفاعلات PCR لتوليد اثنين من مقابض وقالب لالنسخ. القالب النسخ يشمل المناطق المقبض وتسلسل المدرجة. يتم تصنيعه طول RNA كاملا في المختبر النسخ. أخيرا، ويلدن الحمض النووي الريبي ومقابض معدلة كيميائيا معا لتوليد جزيئات لنتف الريش.

معايرة وتشغيل الملقط. التصميم الأساسي لاستخدام Minitweezersد في هذا العمل يتبع ذلك من ملاقط بصرية مزدوجة شعاع 33. مع العديد من التحسينات، عرض Minitweezers الاستقرار الاستثنائي بالمقارنة مع ملاقط بصرية الجيل الأول. وهناك عدد من المجموعات البحثية في العديد من البلدان استخدام Minitweezers في مجال البحوث جزيء واحد من 14،15،34-37. تفاصيل البناء، والمعايرة، وتشغيل الجهاز، بما في ذلك أشرطة الفيديو التعليمية، وتتوفر في "الملقط لاب" على الانترنت (http://tweezerslab.unipr.it). هنا، يتم وصف التحسينات وإجراءات المعايرة التي تحتاج إلى أن يقوم على أسس اليومية بالتفصيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد RNA الجزيئات لجزيء واحدة نتف الريش

  1. استنساخ تسلسل الفائدة. استنساخ تسلسل الحمض النووي المقابلة لبنية الحمض النووي الريبي في ناقلات.
  2. التوليف وتنقية من القالب النسخ. تجميع قالب النسخ بواسطة PCR. [المائدة 1 مكان هنا] التالي، وتنقية المنتجات PCR باستخدام طقم تنقية PCR، وتركيز العينة ل> 200 نانوغرام / ميكرولتر. لأنه يتم استخدام الحمض النووي لتنقية النسخ، ريبونوكلياز المياه مجانا وينبغي أن تستخدم في شطف وتركيز الخطوات.
  3. في النسخ المختبر. توليف الحمض النووي الريبي في المختبر النسخ عند 37 درجة مئوية خلال الليل لتعظيم العائد الحمض النووي الريبي. [المائدة 2 مكان هنا] بعد النسخ، إضافة 1 ميكرولتر الدناز أنا لهضم قالب الحمض النووي لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تنقية RNA باستخدام عمود السيليكا زيادة ونقصان.
  4. تركيب المقبض المعقدة البيروكسيديز A. الأولى، ينتج مقبض معدلة A عن طريق PCR باستخدام بادئات آف وعار واضربentrate تضخيم الحمض النووي ل> 200 نانوغرام / ميكرولتر. المقبل، تتضمن التعديلات البيوتين في المنتج باستخدام PCR رد فعل تمديد التمهيدي. [المكان الجدول 3 هنا] ملاحظة: المؤشر المعقدة البيروكسيديز ألف (البيوتين-HA) يمكن استخدامها مباشرة في الصلب دون تنقية. كما البيوتين-HA هو أن صلب مع RNA، من المهم جدا لاستخدام ريبونوكلياز المياه مجانا في كل الخطوات.
  5. تركيب المقبض المعدلة digoxigenin B. توليف digoxigenin تعديل مقبض B (DIG-HB) بواسطة PCR باستخدام التمهيدي فرنك بلجيكي وتعديل digoxigenin بنسبة ضئيلة حفر-BR (الشكل 3). المقبل، تنقية المنتج PCR وتركيز العينة ل> 200 نانوغرام / ميكرولتر.
  6. الصلب RNA إلى مقابض. يصلب RNA مع مقابض. [مكان الجداول 4 و 5 هنا]
  7. تنقية عينة صلب. إضافة 3 مجلدات من الإيثانول من العينة صلب وتخلط جيدا. تخزين الخليط في -70 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل. تدور باستمرار على 15،800 XG وتجاهل طاف. تجفيف بيليه باستخدام مجفاد. حل بيليه في100 ميكرولتر ريبونوكلياز المياه مجانا. ملاحظة: عينة جاهزة لاستخدامها ويمكن تخزينها في -20 درجة مئوية.

2. معايرة وتشغيل ملاقط بصرية

  1. معايرة بكسل حجم شاشة فيديو
    1. استخدام فخ البصرية إلى اعتراض حبة مع قطر معروف (حجم قياسي).
    2. التقاط صور لحبة المحاصرين باستخدام برامج التصوير (الشكل 4).
    3. تحديد قطر حبة باستخدام برامج التصوير على أساس طريقة النقطه الوسطى.
    4. كرر هذا الإجراء لتحديد أقطار حبات من حجم مختلف.
    5. تناسب أقطار قياس ويعرف من الخرز من قبل الانحدار الخطي للحصول على الحجم الفعلي بكسل.
  2. تحقق من معايرة القطر
    1. استخدام فخ البصرية إلى اعتراض حبة.
    2. تحديد موقف بكسل النقطه الوسطى من خلال البرنامج التقاط الصور وتسجيل موقفها باستخدام Minitweezers.
    3. توجيه حبة لزراعية مختلفة استئجار المواقف وتكرار تحديد الموقف.
    4. تحويل مواقف X و Y من حبة من بكسل إلى m الوحدة باستخدام حجم بكسل معايرة.
    5. مقارنة X و Y بين المواقف تقاس الفيديو والتي Minitweezers. يجب مجموعتين من القيم نوافق على ذلك. ودقة وضوح الصورة هو> 0.1 ميكرون، حرك حبة أكثر من 1 ميكرون بين القياسات لضمان الدقة. إذا معايرة المسافة ليست مماثلة لتلك المخزنة في Minitweezers، إعادة ضبط الصك.
  3. فخ تصلب المعايرة
    1. التقاط حبة باستخدام فخ البصرية والاحتفاظ بها حتى الآن.
    2. تسجيل قوة في فخ باستخدام الحصول على البيانات بسرعة الالتفافية بمعدل> 5 كيلو هرتز لمدة 3 ثانية.
    3. توليد الطاقة من الطيف تسجيل حركة حبة باستخدام البرمجيات. تناسب الطيف السلطة إلى Lorentzian (الشكل 5) 38:
      542 / 51542eq1.jpg "العرض =" 200 "/> (المعادلة 1)
      حيث S (و) هي قوة في تواتر و، ج و هي تردد الزاوية، وS 0 هي قوة مقارب. تردد الزاوية، و ج، هو التردد حيث انخفضت قوة الحركة الحرارية لنصف قيمة مقارب. كما و ج يختلف مع قوة الليزر وحجم حبة، حبة المحاصرين معايرة كل على حدة.
    4. حساب ثابت الربيع من فخ، κ، من و ج:
      المعادلة 2 (المعادلة 2)
      التي γ هو معامل السحب من حبة (المعادلة 3). استخدام ثابت الربيع لتحديد التغييرات امتداد لRNA من التغيير بالقوة.
  4. اختبار قانون ستوكس
    1. التقاط حبة باستخدام فخ البصرية. نقل حبة ذهابا والقوة بسرعة مختلفة.
    2. تسجيل حركة حبة وإجبار باستخدام Minitweezers.
    3. حساب نصف قطر حبة.
      ملاحظة: قوة الاحتكاك، F د، الناتجة عن حركة الجسيمات كروية في السوائل يمكن وصف بموجب القانون ستوكس:
      المعادلة 3 (المعادلة 3)
      حيث r هي نصف قطر الكرة، والخامس هو السرعة، و h هو اللزوجة الديناميكية للسوائل، والتي يمكن العثور عليها في الجداول المرجعية. باستخدام القوة تقاس على أنها F د، نصف قطر حبة يمكن حسابها باستخدام المعادلة. 3 (الشكل 6)، وينبغي أن يتفق مع يحددها البرنامج الحصول على الصور. وستوكس اختبار اختبارات القانون بشكل فعال المعايرة الشاملة والأداء الصك.

3. Nanomanipulation من واحدة RNA الجزيئات

  1. جعل fluidics.
    1. حفر ستة ثقوب (2 مم لكل منهما) على الغطاء الزجاجي رقم 2 (الشكل 7A) وقطع ثلاثة الشقوق (2 ملم العرض) في الوجهين الشريط بوليميد (الشكل 7B) باستخدام الليزر.
    2. جعل غرفة التدفق بواسطة يقحم اثنين من الزجاج غطاء مع طبقتين من الوجهين الشريط KAPTON. إدراج micropipette واثنين من الأنابيب الالتفافية بين الشريط (الشكل 7C).
    3. جبل غرفة التدفق على إطار معدني عن طريق مطابقة الثقوب الموائعية (الشكل 7D).
    4. ربط قنوات الموائعية من الغرفة إلى 10 مل المحاقن مليئة عازلة الاختيار عن طريق شبكة أنابيب من البولي ايثيلين (الشكل 7E).
    5. جبل الغرفة بأكملها على ملاقط بصرية بين الهدفين. تأكد من أن الجانب الأمامي للغرفة مع قنوات الموائعية يواجه نحو اليمين. التراجع عن الهدف الحق والمكونات دبابيس نحاسية من الإطار (الشكل 7E) إلى تصاعد ثقوب على رانه الملقط. تشديد الخناق لتحديد موقف الغرفة.
  2. خلط العينة والخرز صلب. مزيج العينة صلب مع حبات المغلفة مكافحة digoxigenin (حفر الخرز)، والسماح للخليط للبقاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقيقة. عادة، يتم خلط 1 ميكرولتر من العينة صلب مع 5 ميكرولتر حفر حبات في 1 مل من العازلة. ملاحظة: كمية من الخرز ليتم تحميلها في غرفة تدفق ينبغي اختيار لضمان وجود كمية معقولة من الخرز ليتم تسليمها من الأنبوب تجاوز. نسبة من العينة صلب إلى الخرز لا يمكن قياسها كميا بسهولة. في الحالة المثالية، ومعظم حبات ليس لها RNA هذا أنه ليس هناك سوى جزء صغير من الخرز قد يكون جزيء RNA واحد فقط لكل حبة. كما العينات صلب وتعليق حبة يصعب قياسها كميا، وأفضل وسيلة فقط حاليا هو أن تختلف نسبة الخلط واختبار الخليط على ملاقط.
  3. تقديم حبات لموقع رد الفعل في غرفة التدفق (أي بضعة ميكرومتر على رأس ميلغيض cropipette، الشكل 7C).
    1. تحميل تعليق الخرز streptavidin المغلفة (بكتيريا الخرز) في حقنة 1 مل.
    2. ربط المحقنة إلى الأنبوب فلويديك المؤدية إلى قناة السفلى من غرفة التدفق (الشكل 7A).
    3. دفع الحقنة في التدفق على بكتيريا الخرز في الغرفة.
    4. نقل غرفة بأكملها باستخدام برامج التحكم في المحركات لوضع فخ الضوئية قرب افتتاح أنبوب التفافي السفلي (الشكل 7B). ثم تعمل في فخ البصرية من قبل كرة لالتقاط بكتيريا حبة.
    5. نقل حبة قريبة من غيض من micropipette باستخدام برنامج التحكم في المحركات.
    6. سحب حقنة متصلة micropipette لامتصاص حبة على micropipette.
    7. تطبيق تدفق برفق عن طريق الضغط على حقنة إلى القناة الوسطى لطرد إضافية بكتيريا الخرز.
    8. وبالمثل، تقديم مزيج من العينة والخرز حفر (راجع الخطوة 3.2) إلى القناة العليا من الغرفة.
    9. القبض على حفر حبة وجعله على مقربة من بكتيريا حبة باستخدام فخ البصرية.
    10. تنظيف القناة الوسطى من خلال تطبيق التدفق. ملاحظة: strep- وحفر الخرز يتم اختيار أن تكون أحجام مختلفة بحيث يمكن تمييزها بصريا تحت نظر المجهري (الشكل 4).
  4. الصيد "على جزيء واحد يربطون بين زوج من الخرز.
    1. وضع حفر حبة عموديا على أعلى من بكتيريا حبة (الشكل 4).
    2. نقل حفر حبة أسفل نحو بكتيريا حبة من توجيه الفخ. فتح نافذة مؤامرة القوة لمسافات على جهاز الكمبيوتر لتصور التغييرات القوة.
    3. بناء على اتصال من الخرز اثنين، حرك حفر حبة عموديا بعيدا عن بكتيريا حبة.
    4. إذا تم إجراء أي اتصال معين، تبقى قوة الصفر تقريبا. إذا كنت متصلا حبات اثنين من الجزيئات، ويزيد من قوة بشكل ملحوظ عندما فصل حبات اثنين. هذا الإجراء، ويشار إليها باسم "الصيد"، وغالبا ما يكون الأداء الإقتصادي الأداءormed عدة مرات على كل زوج من الخرز للعثور على حبل فعال واحدة جزيء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

محدودة من الفضاء، ويتجلى nanomanipulation من جزيئات الحمض النووي الريبي واحدة من خلال عرض أمثلة الميكانيكية الوحيدة التي تتكشف من دبابيس الشعر وRNA RNA مع هيكل العالي.

التلاعب الجزيئات واحدة دبوس الشعر

مرة واحدة يتم تأسيس حبل بين الخرز، وتمديد وقوة على حبل يمكن التلاعب بها باستخدام بروتوكول المعرفة من قبل المستخدم. وتستخدم أربعة بروتوكولات التلاعب المشتركة عادة.

قوة منحدر تجربة. التجربة الأكثر بديهية ومشتركة للتلاعب على RNA وحيد هو أن تمتد مرارا والاسترخاء جزيء في اتجاه محور حلزونية المقابض (عموديا كما هو مبين في الشكل 4). القوة، F، وفخ الموقف، Y، تسجل بوصفها وظيفة من الزمن. تمديد جزيء، ه، يمكن حسابها عن طريق البريد Y = - F / κ، والذي هو ثابت ربيع عام هيئة تنظيم الاتصالات ص. نتيجة سحب يمكن عرضها كما منحنى قوة التمديد (الشكل 8A). وتمتد من مقابض المزدوج تقطعت بهم السبل يتضح من ارتفاع منحنى مع ميل إيجابي. منحنى تخفيف مقابض يتتبع ذلك من التمدد. التحول الهيكلي بسيطة، دبوس الشعر للطي اثنين للدولة يعرض "مزق" مع ميل سلبي، مما يشير إلى واحد، التعاوني الانتقال تتكشف 39. يشار إلى refolding من منعطف حاد من قبل "الرمز" على منحنى قوة التمديد. الأهم من ذلك أن نفس الجزيء قد تكشفت وrefolded على قوات مختلفة في كل مرة. مثل هذا الاتجاه هو واضح على توزيع قوات الانتقالية (الشكل 8B). عادة، يتم تغيير القوة كدالة خطية من الزمن، أي في تحميل ثابت / معدل التفريغ. تحت معدل التحميل / التفريغ المستمر، حركية تعتمد القوة يمكن استخلاصها من توزيع قوات انتقال 40-42.

الحمار = "jove_content"> ثابت قوة التجربة. تحت وضع قوة ثابتة، وتوظف أداة آلية التغذية المرتدة لتعويض الانحرافات قوة من القيمة المحددة. يتم تسجيل تمديد جزيء RNA بوصفها وظيفة من الزمن (الشكل 9). وضع القوة في أو بالقرب من قوة انتقالية معينة من جزيء RNA التحول يسمح لمراقبة وتقدير الدول الممتدة الجزيئية. أعمار للجزيء في كل دولة يمكن تجميعها معا لحساب حركية التحول الهيكلي 7. يستخدم التجربة قوة ثابتة لمراقبة لطي عكسها، مثل تلك التي من 7،28 دبابيس الشعر.

الانتقال قوة التجربة. في تجربة قوة القفز، ويتم تغيير قوة بسرعة إلى قيمة مختلفة وتبقى ثابتة. ويتم رصد عمر الانتقالي الأول 43. القفزة قوة مفيد بشكل خاص لوصف حركيةعمليات لا رجعة فيها، لأن عمر من الأمام وعكس ردود الفعل يمكن قياسها مباشرة بشكل منفصل في القوى المختلفة. في كل قوة القفزة / قطرة، ويلاحظ مدى الحياة واحد فقط. لذلك، جولات متعددة من مثل هذه التجارب تحتاج إلى أن يؤديها من أجل جمع ملاحظات كافية لاستخراج حركية.

التجارب السلبية. في ظل الوضع السلبي، مواقف فخ وmicropipette كلاهما ثابت (الشكل 10). وهناك منعطف حاد المعارض دولتين الموافق RNA تكشفت ومطوية بالقرب القوات انتقالها. على عكس التجربة قوة ثابتة، فإن كلا من القوة وتمديد التغيير جزيء على التحول الهيكلي. القضاء على مراقبة ردود الفعل يسمح التحولات الجزيئية ليتم رصدها مباشرة دون تدخل خارجي. ومع ذلك، فمن الصعب الحفاظ على قوة ثابتة في ظل الوضع السلبي يكشف. كما منتشر حبة المحاصرين في فخ البصرية، والتغيرات القوة وفقا لذلك. عشرالوضع السلبي البريد غير مناسب لقياس الدول الجزيئية مع فترات انتظار طويلة، وتغيير كبير خلالها القوة. إيجابيات وسلبيات من قوة ثابتة وسائط سلبية وقد درس على نطاق واسع وناقش 44.

كشف الطي الهياكل الثانوية والثالثية

تتكشف الميكانيكية لتقبيل RNA يومين قاعدة الزوج شكلت من قبل اثنين مرتبطة GACG دبابيس الشعر tetraloop يستخدم كمثال هنا (الشكل 11A). كلا دبابيس الشعر جذع 9 قاعدة الزوج، على الرغم من تسلسل الجذعية مختلفة. وقد اتسم مسار تتكشف الميكانيكية من الحمض النووي الريبي (الشكل 11A) من خلال أساليب القوة منحدر 34. عندما يتم رفع قوة، هو كسر مجمع تقبيل الأولى، تليها متتابعة تتكشف من دبابيس الشعر. على refolding، ودبابيس الشعر أضعاف أولا، تليها التفاعل التقبيل في قوة منخفضة. هذه التحولات واضحة على منحنى قوة التمديد (الشكل11B). لتأكيد التنازل عن التحولات دبوس الشعر، كل من دبابيس الشعر يمكن دراستها بشكل فردي. التنازل عن unkissing / التحولات التقبيل يمكن التحقق من خلال دراسة مجموعة RNA متحولة، حيث يتم تحور في tetraloops لمنع تشكيل التفاعل تقبيل 28. بدلا من ذلك، يمكن تعيين أدنى النفاذ في 10 السندات الإذنية، أعلى من قوات التقبيل. كما هو متوقع، فإن منحنى قوة التمديد في ظل هذه الظروف يعرض فقط تتكشف / refolding من دبابيس الشعر (الشكل 11C) 34. وبالتالي، فمن الممكن للتحقيق للطي التفاعل تقبيل وكل من دبابيس اثنين بشكل مستقل في القوى المختلفة.

ومن الملاحظ أن للطي من اثنين دبابيس الشعر هو عكسها، في حين أن التفاعل التقبيل لا رجعة فيه للغاية، كما يتضح من unkissing مختلفة جدا وقوات التقبيل، والتباطؤ كبير. مباشره وبالتالي فإن حركية قابلة للطي من دبابيس الشعر يمكن دراستهاذ باستخدام تجارب قوة ثابتة. حركية التفاعل التقبيل، ومع ذلك، يجب أن تقاس باستخدام طريقة قوة القفز. يبين الشكل 12A قوة نموذجية قفزة التجربة 28. 3 في السندات الإذنية، ومطوية الحمض النووي الريبي بأكمله. ثم يتم رفع قوة بسرعة إلى 22 والسندات الإذنية، تبقى ثابتة. بعد بضع ثوان، وكشف الحمض النووي الريبي بأكمله في ضفيرة واحدة، كما يتضح من زيادة مفاجئة تمديد ~ 30 نانومتر. ثم يتم رفع القوة إلى 30 السندات الإذنية لمواصلة تمتد الحمض النووي الريبي، قبل أن يتم خفضه إلى 13 السندات الإذنية. بعد للطي من دبابيس الشعر، ويتم إسقاط القوة بسرعة إلى 8 السندات الإذنية. يشار إلى تشكيل مجمع تقبيل بتقصير التمديد من قبل ~ 7-8 نانومتر. من خلال جمع العديد من هذه القياسات مدى الحياة، وتقبيل unkissing حركية على قوات ثابتة يمكن حسابها.

تحت كل الظروف التجريبية، مجمع تقبيل دائما تكشفت أولا. في القوى التي دبابيس الشعر غير مستقرة في حد ذاتها، وتتفاعل التقبيلايون يحمي الهياكل دبوس الشعر من تتكشف. وكشف مثل هذا التأثير معدل الحد أيضا من تجارب قوة القفز. كما هو مبين في الشكل 12B 28، عندما قفز القوة إلى 16 السندات الإذنية، تمديد جزيء لم يتغير إلى حد كبير لبضع ثوان، تليها تتكشف زيادة التمديد ~ 20 نانومتر. وتشير التغيرات في التمديد تكشفت أضعف سبع قاعدة الزوج القاسي بعد حق تعطيل المجمع التقبيل. وmetastability من منعطف حاد واضح من قبل عمر. مرة واحدة يتم تقسيم التقبيل، دبوس الشعر، تمر بسرعة بين الدول مطوية وتكشفت. في عمر أقل من 1 ثانية. أساسا، هذه الملاحظة هي تجربة قوة ثابتة لتتكشف منعطف حاد. في المقابل، فإنه يأخذ أكثر من 10 ثانية لكسر مجمع التقبيل مع دبوس الشعر. وبالمثل، فإن القوة قفز إلى 17.7 السندات الإذنية (الشكل 12C)، التي يتم كشف الحمض النووي الريبي بأكمله في ضفيرة واحدة، كما يتضح من قبل فيتجعد في تمديد ~ 30 نانومتر. والبحث العجز في الكبير، 11 قاعدة الزوج القاسي يمكن اعتبار القفزات التمديد بين قيمتين. مرة أخرى، وأعمار قصيرة من دبوس الشعر هي في تناقض حاد مع عمر البطارية الطويل في الدولة متبدل الاستقرار. باستخدام مزيج من القوة منحدر وقوة القفزة التجارب، والديناميكا الحرارية وحركية الفرد تتكشف / الخطوات للطي يمكن قياس 28. الملاحظات المباشرة للكسر وتشكيل مجمع تقبيل تمكننا من تحليل مساهمات حيوية من المرافقة قواعد الحد الأدنى لمجمع التقبيل 34 وقياس الاعتماد الملح للتفاعل تقبيل 45.

الشكل 1
الرقم 1. الهياكل RNA النسبية للقوة التطبيقية. أ) دبوس الشعر تحت التوتر. ب) سحب A-الحالة الأساسية اثنينزوج تقبيل تعقيدا. يتم تلوين الحلقات دبوس اثنين باللون الأحمر والأصفر.

الشكل 2
الشكل 2. الإعداد التجريبي. ويحيط الهيكل RNA من قبل اثنين من مقابض DNA / RNA. من خلال التعديلات الكيميائية في نهايات المقابض، يمكن توصيل هذا الجزيء بأكمله إلى زوج من البروتين المغلفة الخرز ميكرون الحجم. واحد من الخرز والتي عقدت من قبل القابلة للتوجيه، قياس قوة فخ البصرية. يتم وضع البعض على micropipette، الذي يحركه مرحلة flexture كهرضغطية. الرسم ليس على نطاق كبير.

الرقم 3
الشكل 3. المخطط العام لتجميع جزيئات RNA مع مقابض. المقبض A، B التعامل، وريتم إنشاء قالب ranscription بواسطة PCR من البلازميد مع تسلسل RNA المستنسخة. يتم تعديل المقبض والتي digoxigenins (حفر) في نهايات 3 '. مقبض B لديه تعديل البيوتين في 5 'نهاية حبلا واحد. وكتب طول RNA الكامل من القالب النسخ. مقابض RNA وتعديل مختلطة وصلب. يمكن للجزيئات أن يكون صحيح المربوطة إلى زوج من الخرز streptavidin المغلفة بواسطة الأجسام المضادة ومكافحة digoxigenin. الرسم ليس على نطاق كبير.

الرقم 4
الرقم 4. صور الصيد جزيء وحيد بين اثنين من الخرز الفيديو التي تم التقاطها بواسطة البطاقة. يتم وضع حبة واحدة في غيض من micropipette بواسطة الشفط. ويعقد وتوجهها فخ الضوئية قياس قوة الآخر. يشار إلى توجهات الحركات فخ من السهام. أول التحركات حبة المحاصرينعموديا نحو حبة على micropipette. على الاتصالات، وحبة المحاصرين يتحرك صعودا. إذا ثبت حبل بين الخرز، والفصل بين حبات تسحب على جزيء وقوة الزيادات كما يتم توسيع الجزيء. إذا لم يتم ربط اثنين من الخرز من قبل أي جزيء، وتتراجع الحركة تولد أي قوة.

الرقم 5
الرقم 5. طيف الطاقة من الحركة البراونية من حبة المحاصرين. منحنى الصلبة هو صالح للمعادلة Lorentzian (المعادلة 1)، كما هو موضح في إدراج. ثابت ربيع فخ يمكن حسابها من وتيرة الزاوية (المعادلة 2).

الرقم 6
الرقم 6. مثال على ستوكس اختبار القانون.

الرقم 7
الرقم 7. غرفة تدفق لنتف الريش. أ) ستة ثقوب، كل بقطر 2 مم، يتم حفر في الغطاء الزجاجي رقم 2 باستخدام الليزر. ب) يتم قطع ثلاثة الشقوق 2 ملم واسعة في بوليميد الأشرطة على الوجهين. ج) نظرة فاحصة في المنطقة التجريبية التي تحتوي على micropipette واثنين من أنابيب الالتفافية. حبات من القنوات العلوية والسفلية تعبر من خلال أنابيب كل منها الالتفافية (الأزرق والأخضر) إلى CEN قناة ترال في الاتجاهات المشار إليها بواسطة الأسهم. د) جبل الغرفة الموائعية على إطار معدني عن طريق مطابقة الثقوب الموائعية. ه) غرفة ثلاث قنوات متصلة تدفق الأنابيب. يتم استخدام قناة المركزية لسحب الحمض النووي الريبي. أعلى (الازرق) وأسفل وتستخدم (الأخضر) قنوات لإيصال الخرز. يشار المنطقة التجريبية قبل المربع الأحمر.

الرقم 8
الرقم 8. قوة المنحدر. أ) منحنى قوة تمديد تتكشف ميكانيكيا من منعطف حاد. سحب يظهر باللون الأزرق والاسترخاء باللون الأحمر. وأشار تتكشف / refolding من دبوس الشعر بواسطة الأسهم. ب) توزيعات تتكشف (الازرق) وrefolding) القوات الأحمر (من منعطف حاد. ويتم تكييف هذا الرقم من مخطوطة المقدمة 39.

: المحافظة على together.within الصفحات = "دائما"> الرقم 9
الرقم 9. هناك منعطف حاد RNA تحت قوة ثابتة. أ) رسم تخطيطي من التجربة. يتم تغيير الموقف من فخ من خلال ردود الفعل وذلك للحفاظ على قوة ثابتة على منعطف حاد. ب) قوة وموقف مقابل الوقت لدبوس الشعر الامم المتحدة / للطي. كما يتم الاحتفاظ قوة ثابتة، موقف فخ يتقلب بين قيمتين، والتي تبين البحث العجز في منعطف حاد في القوة. توزيع ذي الحدين توزيع فخ ينتج التغيير تمديد تتكشف على منعطف حاد من 19.4 ± 0.2 نانومتر. ويتم تكييف هذا الرقم من مخطوطة المقدمة 39.

الرقم 10
الرقم 10. وضع الكامن من منعطف حاد. أ) ب) قوة والإرشاد مقابل الوقت لدبوس الشعر تحت وضع السلبي.

الرقم 11
الرقم 11. قوة المنحدر من الحمض النووي الريبي تقبيل يومين قاعدة الزوج. أ) قابلة للطي الهرمي من RNA تقبيل يومين قاعدة الزوج تحت الميكانيكية التوتر. ب) منحنى القوة والإرشاد. يشار إلى التحولات الهيكلية التي كتبها السهام. ج) منحنى القوة والإرشاد عند تعيين أدنى النفاذ في 10 السندات الإذنية لمنع التفاعل التقبيل. وفايويتم تكييف جوري بإذن من مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية 34.

الرقم 12
الرقم 12. قوة القفز من الحمض النووي الريبي تقبيل يومين قاعدة الزوج. أ) دورة قوة قفزة / قطرة لقياس unkissing وعمر التقبيل على اثنين من القوى المختلفة. تظهر اللوحة العلوية تتبع الوقت القوة. وتبين اللوحة السفلية تمديد النسبي للجزيء. وقفزت القوة الأولى في الفترة من 3 إلى 22 السندات الإذنية السندات الإذنية لقياس مدى الحياة من مجمع التقبيل في 22 السندات الإذنية. يشار إلى unkissing بزيادة سريعة في التمديد ~ 30 نانومتر، مما يدل على وتكشفت في ضفيرة واحدة الحمض النووي الريبي بأكمله. على الاسترخاء، ورفعت القوة وصولا الى 14 السندات الإذنية للسماح للدبابيس الشعر مرتين إلى refold. ثم يتم إسقاط القوة ل8 السندات الإذنية. يشار تشكيل التفاعل تقبيل بواسطة انخفاضا في تمديد ~ 7-8 نانومتر ب.)كما قفز القوة ل16 السندات الإذنية، تتبع الوقت والإرشاد يظهر أن يستغرق عدة ثوان لمجمع تقبيل والقاسي سبع قاعدة الزوج تتكشف، وبعد ذلك تتكشف منعطف حاد وrefolds بسرعة. ج) مجمع التقبيل كله تكشفت في ضفيرة واحدة بضع ثوان بعد قوة وقفز الى 17.7 السندات الإذنية. يعرض التتبع المتبقية البحث العجز في منعطف حاد 11 قاعدة الزوج. كل من التحولات الهيكلية في تتكشف RNA تقبيل معارض اكس المميز ويتم تكييف هذا الرقم بإذن من وقائع الاكاديمية الوطنية للعلوم 28.

كاشف ميكرولتر
بلازميد (10 نانوغرام / مل) 10
T7f التمهيدي (100 ملم) 10
التمهيدي برازيلي (100 ملم) 10
مزيج dNTP (25 ملم لكل منهما) 10
10Xعازلة PCR 100
H 2 O 850
طق البلمرة DNA 10
إجمالي 1،000

ملاحظة: دورة الحرارية نموذجية لتوليف الحمض النووي 3 KBP هي: 95 ° C 45 ثانية، 53 ° C 1 دقيقة، 72 ° C 3 دقائق.

الجدول 1. مثال PCR لتوليف قالب النسخ.

كاشف ميكرولتر
قالب (> 200 نانوغرام / مل) 8
البرامج الوطنية 8 (2 مل لكل منهما)
10X رد فعل العازلة 2
T7 RNA البلمرة 2
إجمالي 20

ملاحظة: احتضان رد الفعل عند 37 درجة مئوية overniGHT.

الجدول 2. في النسخ المختبر.

كاشف ميكرولتر
التعامل مع (~ 10 ملغ) 50
البيوتين-11UTP 5
T4 عازلة رد بول 5
حل BSA 1
T4 البلمرة DNA 5
إجمالي 66

ملاحظة: احتضان رد الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. تعطيل الإنزيم عن طريق التسخين عند 70 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، تليها تبريد بطيئة في درجة حرارة الغرفة.

الجدول 3. التمهيدي تمديد التفاعل.

كاشف ميكرولتر
الفورماميد 800
EDTA (0.5 M، ودرجة الحموضة 8.0) 2
أنابيب (1 M، ودرجة الحموضة 6.3) 40
كلوريد الصوديوم (5M) 80
إجمالي 922

الجدول 4. صفة المخزن المؤقت يصلب.

كاشف
البيوتين-HA 1،000 نانوغرام
حفر-HB 1،000 نانوغرام
RNA 1،000 نانوغرام
عازلة الصلب 80 مل

ملاحظة: دورة الحرارية نموذجية لالصلب هي: 95 ° C 10 دقائق، 62 ° C 1 ساعة، 52 ° C 1 ساعة، يليه التعلية إلى 4 درجات مئوية.

الجدول 5. يصلب RNA مع مقابض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تعديل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها في إعداد العينات نتف الريش

اختيار الاستنساخ المتجهات. على الرغم من أن المخطط العام الموصوفة هنا (الشكل 3) لا يتطلب ناقلات الاستنساخ خاص، ويفضل متجه ليس لديهم T7 جوهري أو T3 المروج لسهولة النسخ بحيث المروج يمكن إدخالها عبر PCR في المواقف المطلوبة.

تسلسل والأطوال للمقابض. لا يوجد أي شرط تسلسل محدد للمقابض. ومع ذلك، يفضل GC قريبة من نسبة AT، في حين ينبغي تجنب متواليات homopolymeric والمتكررة للغاية. في الأعمال المنشورة، يتم الاحتفاظ مقابض اثنين من أطوال مماثلة بحيث يتم وضع هيكل RNA من الفائدة تقريبا في الوسط. يظهر العمل السابق أن إجمالي طول المقابض تختلف من 500 إلى 10،000 أزواج قاعدة يؤثر بمهارة حركية محسوبة 46،47.

ve_content "> تحقق من الجودة والكميات من خليط صلب. إلى جانب RNA المقصود مع مقابض، يحتوي المنتج النهائي أيضا مقابض unannealed DNA والرنا، فضلا عن غيرهم. ومن الصعب وغير اقتصادية لتنقية جزيئات نتف الريش. بدلا من ذلك، صلب خليط يمكن استخدامها مباشرة لنتف الريش، فقط لأن الأحماض النووية صلب بشكل صحيح يمكن المربوطة لاثنين من حبات المغلفة السطح. المنتج صلب صحيح هو أيضا من الصعب تمييزها عن مقابض وRNA على الاغاروز الكهربائي للهلام. أفضل طريقة لاختبار نوعية وقياس تركيز المنتج صلب هو لاختبار ذلك على ملاقط. ومع ذلك، فإنه من المفيد لفحص وقياس PCR ومنتجات النسخ في كل خطوة باستخدام مختلف تقنيات البيولوجيا الجزيئية.

مقاربات بديلة لالحبل RNA إلى الخرز. هناك العديد من الطرق التي يمكن تصورها لربط جزيئات RNA على الأسطح تساهمي أو غير تساهمي 48

أحادية مقابل متعددة جزيء الحبل. زوج من strep- وحفر الخرز يمكن ربط جزيئات متعددة. من استبعاد مثل هذا الاحتمال من جزيئات متعددة يربطون حبة، تحتاج إلى دراسة عن كثب منحنيات القوة لمسافات. جزيء واحد حبل تعرض مرونة الدودة تشبه سلسلة 4 هذا هو الغيب عموما في حبال متعددة الجزيء. تجارب رقابة إضافية محددة لكل نظام قد تكون هناك حاجة لتأكيد حبل واحد جزيء.

إدخال تحسينات على Minitweezers

السريعة والبطيئة تسجيل البيانات. وMinitweezers له المدمج في الحصول على البيانات التي تسجل تصل إلى 21 المعلمات مفيدة بمعدل 200 هرتز في الكمبيوتر، والتي سوف تحال مثل الكمبيوتر التشغيل في هذا العمل. ومع ذلك، بعض تطبيق وإضافات والمعايرة تتطلب معدل الحصول على البيانات بسرعة. ولهذه الغاية، يتم تقسيم إشارات إلكترونية القوة والمسافة ليتم تسجيلها في جهاز كمبيوتر جديد، الكمبيوتر "تسجيل سريع"، بالإضافة إلى الحصول على البيانات في الكمبيوتر التشغيل. الكمبيوتر تسجيل سريع يقرأ البيانات من خلال بطاقة الحصول على البيانات منفصلة والبرمجيات، والذي يسمح قنوات متعددة بسرعة تصل إلى 1 ميغاهيرتز. لا تتدخل اقتناء الحاسوب والبيانات الجديدة مع تشغيل الأداة، التي تسيطر فقط بواسطة الكمبيوتر التشغيل. في تجربة، يتم تسجيل البيانات في وقت واحد على كلا الجهازين بمعدلات مختلفة. يتم إجراء مزامنة الوقت خلال تحليل البيانات عن طريق مقارنة ملفات البيانات المناظرة.

تسجيل فيديو صورة. يتم تثبيت بطاقة الفيديو وبرامج التصوير على الكمبيوتر تسجيل سريع لالتقاط الصور الحية من رد فعل وتحليل صور الفيديو. هذا التطور يجعل من الممكن لتنفيذ ركان حجم بكسل والمعايرة المسافة المذكورة أعلاه.

القيود والتطبيقات المستقبلية للأسلوب

وقد نوقشت أساليب التلاعب بدقة وقياس التغيرات متعلق بتكوين لجزيء RNA واحد. هذه القدرات تجعل من الممكن لمراقبة إعادة ترتيب الهيكلية لحبلا الحمض النووي الريبي في الوقت الحقيقي. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام القوة للتأثير على هيكل RNA وقابلة للطي مسارات، مما يسمح الهياكل النادرة و / أو أقل من المستوى الأمثل لتكون مطوية.

ومع ذلك، هناك أوجه القصور في النهج الميكانيكي. الأهم من ذلك، التمديد، الذي يستخدم لتفسير التغييرات متعلق بتكوين جزئي، هو إسقاط الأبعاد واحد من الهياكل ثلاثية الأبعاد. فمن الممكن أن بعض التغييرات متعلق بتكوين لا يمكن قياس 49-52، و / أو مخفية الحواجز الحركية من الملاحظة 53. هناك أيضا آثار مفيدة المختلفة والقيود التي يجوز للffect الديناميكا الحرارية وحركية احظ 44،46،47.

طبقت ملاقط بصرية لدراسة عدد محدود من الهياكل RNA، بالمقارنة مع العديد من النصوص التي اقترحتها المسوحات على مستوى الجينوم 54. وسوف تستخدم هذه التقنية لدراسة الدوافع الهيكلي مختلف والرنا كبيرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن طريقة إيجاد تطبيقات جديدة في مجال البحوث RNA. على سبيل المثال، يجند ملزم RNA والبروتينات قد تستقر أو تغيير هيكل RNA، والتي يمكن قياسها باستخدام نهج الميكانيكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minitweezers Steven B. Smith Engineering http://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition card National Instruments USB-6351
Video card National Instruments PCI-1407
Labview programming software National Instruments
NI Vision Builder National Instruments
Laser engraver Epilogue laser systems Zing-16
PCR purification kit Qiagen 28104
MEGAscript T7 kit Life Technologies AM1334
MEGAclear kit Life Technologies AM1908
Biotin-11-UTP Thermo Fisher FERR0081
T4 DNA polymerase New England Labs M0203
Streptavidin coated microsphere Spherotech SVP-20-5
Antidigoxigenin coated microsphere Spherotech DIGP-20-2
Size standard microspheres Spherotech PPS-6K
Kapton tape Kaptontape.com KPPTDE-1
No. 2 cover glass Thermo Fisher 12-543D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4853-4860 (1997).
  2. Maier, B. Using laser tweezers to measure twitching motility in Neisseria. Current opinion in microbiology. 8, 344-349 (2005).
  3. Wang, S., Arellano-Santoyo, H., Combs, P. A., Shaevitz, J. W. Measuring the bending stiffness of bacterial cells using an optical trap. Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).
  4. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA the elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. 271, Science. New York, N.Y. 795-799 (1996).
  5. Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. 271, Science. New York, N.Y. 1835-1837 (1996).
  6. Bryant, Z., et al. Structural transitions and elasticity from torque measurements on DNA. Nature. 424, 338-341 (2003).
  7. Liphardt, J., Onoa, B., Smith, S. B., Tinoco, I., J,, Bustamante, C. Reversible unfolding of single RNA molecules by mechanical force. 292, Science. New York, N.Y. 733-737 (2001).
  8. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA unfolds and refolds. Annu Rev Biochem. 77 (27), 21-24 (2008).
  9. Woodside, M. T., Garcia-Garcia, C., Block, S. M. Folding and unfolding single RNA molecules under tension. Current opinion in chemical biology. 12, 640-646 (2008).
  10. Cecconi, C., Shank, E. A., Bustamante, C., Marqusee, S. Direct observation of the three-state folding of a single protein molecule. 309, Science. New York, N.Y. 2057-2060 (2005).
  11. Shank, E. A., Cecconi, C., Dill, J. W., Marqusee, S., Bustamante, C. The folding cooperativity of a protein is controlled by its chain topology. Nature. 465, 637-640 (2010).
  12. Morin, J. A., et al. Active DNA unwinding dynamics during processive DNA replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 8115-8120 (2012).
  13. Larson, M. H., Landick, R., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase one singular sensation every little step it takes. Molecular cell. 41, 249-262 (2011).
  14. Wen, J. D., et al. Following translation by single ribosomes one codon at a time. Nature. 452, 598-603 (2008).
  15. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
  16. Pease, P. J., et al. Sequence-directed DNA translocation by purified FtsK. 307, Science. New York, N.Y. 586-590 (2005).
  17. Dumont, S., et al. RNA translocation and unwinding mechanism of HCV NS3 helicase and its coordination by ATP. Nature. 439, 105-108 (2006).
  18. Greenleaf, W. J., Woodside, M. T., Block, S. M. High-resolution, single-molecule measurements of biomolecular motion. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 36, 171-190 (2007).
  19. Serganov, A., Nudler, E. A decade of riboswitches. Cell. 152, 17-24 (2013).
  20. Breaker, R. R. Prospects for riboswitch discovery and analysis. Molecular cell. 43, 867-879 (2011).
  21. Wan, Y., et al. Genome-wide measurement of RNA folding energies. Molecular cell. 48, 169-181 (1016).
  22. Dalgarno, P. A., et al. Single-molecule chemical denaturation of riboswitches. Nucleic acids research. 41, 4253-4265 (2013).
  23. Wood, S., Ferre-D'Amare, A. R., Rueda, D. Allosteric tertiary interactions preorganize the c-di-GMP riboswitch and accelerate ligand binding. ACS chemical biology. 7, 920-927 (2012).
  24. Brenner, M. D., Scanlan, M. S., Nahas, M. K., Ha, T., Silverman, S. K. Multivector fluorescence analysis of the xpt guanine riboswitch aptamer domain and the conformational role of guanine. Biochemistry. 49, 1596-1605 (2010).
  25. Greenleaf, W. J., Frieda, K. L., Foster, D. A., Woodside, M. T., Block, S. M. Direct observation of hierarchical folding in single riboswitch aptamers. 319, Science. New York, N.Y. 630-633 (2008).
  26. Frieda, K. L., Block, S. M. Direct observation of cotranscriptional folding in an adenine riboswitch. 338, Science. New York, N.Y. 397-400 (2012).
  27. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39, 7677-7687 (2011).
  28. Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Unusual Mechanical Stability of A Minimal RNA Kissing Complex. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15847-15852 (2006).
  29. Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Real-time control of the energy landscape by force directs the folding of RNA molecules. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 7039-7044 (2007).
  30. Tinoco Jr, I., Li, P. T. X., Bustamante, C. Determination of ther modynamics and kinetics of RNA reactions by force. Q Rev Biophys. 39, 325-360 (2006).
  31. Onoa, B., et al. Identifying kinetic barriers to mechanical unfolding of the T thermophila ribozyme. 299, Science. New York, NY. 1892-1895 (2003).
  32. Li, P. T., Tinoco Jr, I. Mechanical unfolding of two DIS RNA kissing complexes from HIV-1. J Mol Biol. 386, 1343-1356 (2009).
  33. Smith, S., Cui, Y., Bustamante, C. Optical-trap force transducer that operates by direct measurement of light momentum. Methods Enzymol. 361, 134-162 (2003).
  34. Stephenson, W., et al. The essential role of stacking adenines in a two-base-pair RNA kissing complex. J Am Chem Soc. 135, 5602-5611 (2013).
  35. Kaiser, C. M., Goldman, D. H., Chodera, J. D., Tinoco Jr, I., Bustamante, C. The ribosome modulates nascent protein folding. 334, Science. New York, NY. 1723-1727 (2011).
  36. Bizarro, C. V., Alemany, A., Ritort, F. Non-specific binding of Na+ and Mg2+ to RNA determined by force spectroscopy methods. Nucleic acids research. 40, 6922-6935 (2012).
  37. Bosaeus, N., et al. Tension induces a base-paired overstretched DNA conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15179-15184 (2012).
  38. Berg-Sørensen, K., Power Flyvbjerg, H. spectrum analysis for optical tweezers. Rev Sci Instrum. 75, 594-612 (2004).
  39. Stephenson, W., et al. Combining temperature and force to study folding of an RNA hairpin. Phys Chem Chem Phys. 16, 906-917 (2014).
  40. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys J. 72, 1541-1555 (1997).
  41. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic rates and activation free energies from single-molecule pulling experiments. Phys Rev Lett. 96, 108101 (2006).
  42. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proc. Natl Acad Sci USA. 105, 15755-15760 (2008).
  43. Li, P. T. X., Collin, D., Smith, S. B., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Probing the Mechanical Folding Kinetics of TAR RNA by Hopping, Force-Jump and Force-Ramp Methods. Biophys J. 90, 250-260 (2006).
  44. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical journal. 103, 1490-1499 (2012).
  45. Li, P. T. X. Analysis of Diffuse K+ and Mg2+ Ion Binding to a Two-Base-Pair Kissing Complex by Single-Molecule Mechanical Unfolding. Biochemistry. 52, 4991-5001 (2013).
  46. Wen, J. D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophys J. 92, 2996-3009 (2007).
  47. Manosas, M., et al. Force Unfolding Kinetics of RNA using Optical Tweezers II. Modeling Experiments Biophys J. 92, 3010-3021 (2007).
  48. Vilfan, I. D., et al. An RNA toolbox for single-molecule force spectroscopy studies. Nucleic acids research. 35, 6625-6639 (2007).
  49. Li, P. T. X. Formation of a metastable intramolecular RNA kissing complex by nanomanipulation. Soft Matter. 9, 3246-3254 (2013).
  50. Chen, G., Chang, K. Y., Chou, M. Y., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Triplex structures in an RNA pseudoknot enhance mechanical stability and increase efficiency of -1 ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 12706-12711 (2009).
  51. Chen, G., Wen, J. D., Tinoco Jr, I. Single-molecule mechanical unfolding and folding of a pseudoknot in human telomerase RNA. 13, RNA. New York, N.Y. 2175-2188 (2007).
  52. Tinoco, I., Chen, G., Qu, X. RNA reactions one molecule at a time. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2, a003624 (2010).
  53. Dudko, O. K., Graham, T. G., Best, R. B. Locating the barrier for folding of single molecules under an external force. Physical review letters. , 107-208301 (2011).
  54. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489, 101-108 (2012).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 90، RNA للطي، واحد جزيء، ملاقط بصرية، nanomanipulation، RNA هيكل الثانوي، RNA الهيكل العالي
Nanomanipulation من واحدة RNA الجزيئات بواسطة الملقط البصرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum,… More

Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. X. Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers. J. Vis. Exp. (90), e51542, doi:10.3791/51542 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter