Abstract
Une grande partie du génome humain est transcrit mais non traduit. Dans cette ère de la génomique de poste, les fonctions de réglementation de l'ARN a été démontré que de plus en plus importante. En fonction de l'ARN est souvent fonction de sa capacité à adopter des structures alternatives, il est difficile de prédire l'ARN structures tridimensionnelles directement à partir de la séquence. Seule molécule approches montrent potentiels pour résoudre le problème de l'ARN polymorphisme structural par le suivi des structures moléculaires d'une molécule à la fois. Ce produit présente une méthode pour manipuler précisément le pliage et la structure de molécules d'ARN simple à l'aide de pinces optiques. Tout d'abord, les méthodes pour synthétiser des molécules convenant à une seule molécule travail mécanique sont décrits. , Diverses procédures d'étalonnage Suivant pour assurer les opérations propres des pinces optiques sont discutées. Ensuite, diverses expériences sont expliquées. Pour démontrer l'utilité de la technique, les résultats d'déroulent mécaniquement épingles à cheveux d'ARN et un ARN simple Kissincomplexe de g sont utilisés comme éléments de preuve. Dans ces exemples, la technique de nano-manipulation a été utilisé pour étudier le pliage de chaque domaine structural, secondaire et tertiaire, y compris, de façon indépendante. Enfin, les limitations et les futures applications du procédé sont discutées.
Introduction
Le développement de la technique des pinces optiques, a longtemps été accompagné de son application dans la recherche biologique. Lorsque l'effet de piégeage optique a été découvert, Arthur Ashkin observé que les bactéries dans l'eau contaminée pourraient être piégés au foyer laser 1. Depuis lors, les bactéries de piégeage est devenu, une expérience amusante involontaire pour des générations d'étudiants de biophysique ainsi que d'un outil de recherche sérieuse pour étudier la physiologie microbienne 2,3. La technique de piégeage optique utilise faisceau laser focalisé à immobiliser un objet microscopique 1. En pratique, le fonctionnement d'un piège à laser comme un ressort optique, qui mesure également la force (F) sur l'objet emprisonné par son déplacement à partir du centre du piège (AX). Dans un court intervalle, F = κ x AX, dans κ est la constante du ressort du piège. Le piège optique peut être utilisé pour exercer une force dans picoNewton (PN) de précision à un microsobjet endoscopique et de mesurer sa position nanomètre (nm) exactitude. Dans les deux dernières décennies, les pinces optiques sont devenus l'une des techniques unique de molécules les plus utilisées en biophysique. La technique a été utilisée pour étudier le pliage et la mécanique de l'ADN 4-6, 7-9 ARN, protéines et 10,11. Pinces optiques ont également été utilisés pour observer la replication de l'ADN 12, 13 transcription de l'ARN, et la synthèse des protéines 14,15, ainsi que de nombreux autres événements biomoléculaires 16-18.
Approches molécule unique sont utilisés dans la recherche de l'ARN structurel principalement à explorer le robuste paysage énergétique de pliage de l'ARN. Une séquence d'ARN peut souvent se replier en plusieurs structures stables et mutuellement exclusifs, en raison des règles simples de composition chimique et à éplucher de base d'ARN. Il est connu depuis longtemps que l'ARN polymorphisme structural, comme cela se produit dans riboswitchs 19,20, joue un rôle important dans la régulation des gènes. A en Eurt sondage de l'ensemble du génome a révélé que les variations de température d'à peine quelques degrés influencent grandement la structure et la synthèse des protéines d'une grande partie du transcriptome cellulaire 21. Cet exemple laisse entendre que le rôle biologique de remplacement pliage de l'ARN est peut-être plus importante et omniprésente que prévu précédemment. Polymorphisme structural, pose cependant un défi pour les approches biochimiques et biophysiques traditionnelles, qui examinent les propriétés moyennes de nombreuses molécules. Par exemple, la "marche" et conformations "off" d'un riboswitch sont mutuellement exclusifs. Une structure moyenne dérivée de structures hétérogènes n'est pas susceptible de ressembler à l'une des conformations biologiquement pertinentes. En outre, l'ARN non traduite de l'ARNm et forment généralement des structures. Leur interaction avec les protéines et les ARN régulateurs nécessite souvent déroulement de la structure existante dans le cadre de l'interaction. Par conséquent, l'étude de l'ARN dépliage / repliage devient pertinentequestion de l'ARN biologie. Pour répondre à un tel défi, l'approche unique molécule a été utilisée pour démêler l'ARN polymorphisme structural par l'étude d'une molécule à la fois 22-27.
Par rapport à la méthode populaire de fluorescence de molécules uniques, pinces base mécanique déroulement offre un avantage que les conformations de molécules individuelles peuvent être manipulés par la force appliquée et être mesurées avec une précision nanométrique. Cette capacité de nanomanipulation peut être utilisé pour surveiller le déploiement / repliement des domaines structuraux individuels tels que le pliage d'un grand hiérarchique ARN peut être 28 disséqué. En variante, un seul brin peut être dirigé pour se plier dans une de plusieurs conformères; ou une structure existante peut être induite mécaniquement à se replier en une conformation différente 29. Dans les conditions biologiques, une structure d'ARN peut être modifié lors d'un changement de température ou la liaison du ligand. La capacité de manipulation directement s moléculairestructure ouvre un nouveau lieu d'ARN étude structurale. En principe, d'autres techniques mécaniques, telles que la microscopie à force atomique et des pinces magnétiques, peuvent également être utilisées pour étudier le pliage de molécules d'ARN simple. Cependant, ces applications sont limitées en grande partie en raison de la relativement faible résolution spatiale 30.
L'emploi de pinces optiques permet structures d'ARN à être déployés par la force mécanique.
L'avantage de mécanique déroulement est plusieurs fois. La force peut être utilisée pour déployer la fois des structures secondaires et tertiaires, alors que les ions métalliques et ligand induit pliage se limitent principalement à des structures tertiaires. Température et dénaturant peuvent affecter de manière significative les activités de l'eau et de solutés. En revanche, force est appliquée localement pour perturber des structures moléculaires; l'effet de la force sur l'environnement est négligeable. En outre, la fusion thermique est le mieux d'étudier la thermodynamique de pliage de petites structures d'ARN,tandis que les pinces optiques ont été utilisées pour étudier les structures d'ARN avec différentes tailles, allant de un à sept paires de bases tétraboucle épingle à cheveux 28 à un ribozyme 31 400 nucleotides. En outre, les structures d'ARN peuvent être dépliés mécaniquement à des températures mésophiles. En revanche, les ARN de se dérouler dans une expérience de fusion thermique, la température est généralement élevée bien au-dessus des températures physiologiques, ce qui augmente considérablement l'hydrolyse de l'ARN, en particulier en présence d'ions Mg 2 +.
Il est important de noter que l'effet mécanique de la force dépend de la façon dont elle est appliquée sur une structure. La force appliquée bascule le paysage énergétique de pliage. Par exemple, lorsqu'une force est appliquée sur une épingle à cheveux, les paires de bases sont brisées de façon séquentielle, un à la fois (figure 1a). La fourche de déchirure progresse en hélice le long de l'axe, qui est perpendiculaire à la force appliquée. En revanche, quand un complexe kissing minimal est sous tension, les deux n'embrassepaires de bases, qui sont parallèles à la force appliquée, la part de la force de charge (figure 1b). Les différentes géométries de l'épingle à cheveux et embrassant complexe par rapport au résultat de la force appliquée à la réponse mécanique différente, qui peut être utilisé pour distinguer pliage secondaire et tertiaire 28,32. L'aspect théorique de la mécanique qui se déroule a déjà été examinée 8,9,30. Ce travail décrit les approches de base pour mettre en place et exécuter un test déroulement mécanique seule molécule.
Configuration expérimentale. Dans notre expérience de traction mécanique, l'échantillon d'ARN est constituée de pinçage de l'ARN d'intérêt flanquée par deux poignées doubles brins d'ADN / ARN (figure 2) 7. L'ensemble de la molécule peut être attaché à deux bourrelets micron de taille à revêtement de surface (Spherotech) via la streptavidine-biotine et les interactions anticorps anti-digoxigénine-digoxigénine, respectivement. Une bille est maintenue par un tr optique de mesure de forceap, tandis que l'autre se tient sur la pointe d'une micropipette. La distance relative entre les billes peut être modifiée soit par le piège de direction ou de déplacement de la micropipette. En utilisant cette approche, une molécule d'ARN simple attacher les billes peut être étiré et relâché.
Préparation des échantillons. La synthèse des échantillons d'ARN pour épilation comprend plusieurs étapes (Figure 3). Tout d'abord, la séquence d'ADN correspondant à l'ARN d'intérêt est d'abord clone dans un vecteur plasmidique. Ensuite, trois réactions de PCR sont réalisées pour produire les deux poignées et une matrice pour la transcription. Le modèle de transcription comprend les régions de la poignée et les séquences insérées. L'ARN de pleine longueur est synthétisé par transcription in vitro. Enfin, l'ARN et les poignées modifiés chimiquement sont recuites ensemble pour produire les molécules pour l'épilation.
Calibrage et le fonctionnement des pincettes. La conception de base de l'utilisation Minitweezersd dans ce travail suit celle des double faisceau pinces optiques 33. Avec de nombreuses améliorations, les Minitweezers affichent une stabilité extraordinaire par rapport aux pinces optiques de première génération. Un certain nombre de groupes de recherche dans plusieurs pays utilisent les Minitweezers dans leur recherche de molécule unique 14,15,34-37. Les détails de la construction, de l'étalonnage et le fonctionnement de l'appareil, y compris des vidéos d'instruction, sont disponibles sur le site Web "pincettes Lab" (http://tweezerslab.unipr.it). Ici, des améliorations et des procédures d'étalonnage qui doivent être effectuées sur des bases quotidiennes sont décrites en détail.
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Protocol
1 Préparation de molécules d'ARN pour une seule molécule Tweezing
- Clonage de la séquence d'intérêt. Clonage de la séquence d'ADN correspondant à la structure de l'ARN dans un vecteur.
- Synthèse et purification de la matrice de transcription. Synthétiser un modèle de transcription par PCR. [Lieu le tableau 1 ici] Ensuite, purifier les produits de PCR en utilisant un kit de purification PCR, et concentrer l'échantillon à> 200 ng / ul. Étant donné que l'ADN purifié est utilisé pour la transcription, la RNase eau libre doit être utilisé dans l'élution et concentration.
- La transcription in vitro. La synthèse d'ARN par transcription in vitro à 37 ° C pendant une nuit afin de maximiser le rendement en ARN. [Lieu le tableau 2 ici] Après transcription, ajouter 1 pl DNase I à digérer la matrice d'ADN pendant 15 min à 37 ° C. On purifie l'ARN en utilisant une colonne de centrifugation de silice.
- Synthèse de la poignée biotinylé A. Tout d'abord, produire la poignée non modifié par PCR utilisant des amorces Af et Ar et concEntrate l'ADN amplifié à> 200 ng / ul. Ensuite, incorporer des modifications de la biotine dans le produit de PCR en utilisant une réaction d'extension d'amorce. [Lieu tableau 3 ici] REMARQUE: La poignée biotinylé A (biotine-HA) peut être utilisé directement dans le recuit sans purification. Comme la biotine-HA doit être recuite à ARN, il est essentiel d'utiliser la RNase eau libre dans les deux étapes.
- Synthèse de la poignée de la digoxigénine-modifié B. Synthétiser digoxigénine modifié poignée B (dig-HB) par PCR en utilisant une amorce oligo Bf et la digoxigénine modifié Dig-Br (figure 3). Ensuite, purifier le produit de PCR et concentrer l'échantillon à> 200 ng / ul.
- ARN de recuit sur les poignées. Recuit de l'ARN avec des poignées. [lieu tableaux 4 et 5 ici]
- Purifier l'échantillon recuit. Ajouter 3 volumes d'éthanol de l'échantillon recuit et bien mélanger. Stocker le mélange à -70 ° C pendant au moins 1 h. Isoler à 15 800 xg et éliminer le surnageant. Sécher les granulés à l'aide d'un lyophilisateur. Dissoudre le culot dans100 de l'eau sans RNase ul. NOTE: L'échantillon est prêt à être utilisé et peut être conservé à -20 ° C.
2. étalonnage et le fonctionnement des pinces optiques
- Calibrer Pixel Taille de moniteur vidéo
- Utilisez le piège optique pour piéger un cordon de diamètre connu (de taille standard).
- Capture d'images d'un cordon piégé en utilisant un logiciel d'imagerie (figure 4).
- Déterminer le diamètre de la bille à l'aide du logiciel de formation d'image sur la base de la méthode centroïde.
- Répétez cette procédure pour déterminer le diamètre de perles de différentes tailles.
- Monter les diamètres mesurés et connus des billes par une régression linéaire pour obtenir la taille physique d'un pixel.
- Vérifiez Calibration de distance
- Utilisez le piège optique pour piéger un cordon.
- Déterminer la position de pixel de son centre de gravité par le logiciel de capture d'image et enregistrer sa position en utilisant les Minitweezers.
- Dirigez le bourrelet à DIFFE louer positions et répéter la détermination de la position.
- Autre les positions X et Y de la bille à partir de pixels à l'unité de m en utilisant la taille de pixel calibré.
- Comparer les X et Y entre les positions mesurées par vidéo et par les Minitweezers. Les deux ensembles de valeurs devraient convenir. Comme la résolution de l'image est> 0,1 um, déplacer le bourrelet par-dessus 1 um entre les mesures pour assurer l'exactitude. Si l'étalonnage à distance n'est pas comparable à celui enregistré dans les Minitweezers, réglage de l'instrument.
- Piège rigidité étalonnage
- Capturez un cordon à l'aide du piège optique et maintenez-le encore.
- Enregistrer la force de la machine en utilisant une acquisition rapide de données de dérivation à un taux> 5 kHz pendant 3 sec.
- Générer un spectre de puissance à partir de l'enregistrement du mouvement des billes en utilisant un logiciel. Monter le spectre de puissance à une lorentzienne (Figure 5) 38:
542 / 51542eq1.jpg "width =" 200 "/> (Eq. 1)
où S (f) est la puissance à la fréquence de f, f c est la fréquence de coupure, et S 0 est la puissance asymptotique. La fréquence de coupure f c est la fréquence à laquelle la puissance de l'agitation thermique a diminué à la moitié de la valeur asymptotique. Comme f c varie avec la puissance du laser et la taille des billes, calibrer chaque bille piégée individuellement. - Calculer la constante du ressort du piège, κ, de f c:
(Équation 2.)
où γ est le coefficient de traînée du bourrelet (Eq. 3). Utilisez la constante de rappel pour déterminer les changements d'extension d'un ARN de changement de force.
- Droit d'essai de Stokes
- Capturez un cordon à l'aide du piège optique. Déplacez la bille va-et-vigueur à des vitesses différentes.
- Enregistrer le mouvement de la bille et le forcer à l'aide des Minitweezers.
- Calculer le rayon de la bille.
NOTE: La force de frottement, F d, généré par le mouvement d'une particule sphérique dans un fluide peut être décrit par la loi de Stokes:
(Équation 3.)
dans laquelle r est le rayon de la sphère, v est la vitesse, et h est la viscosité dynamique du fluide, qui peut être trouvée dans les tables de référence. Utilisation de la force F mesurée comme d, le rayon de la bille peut être calculée en utilisant l'équation. 3 (Figure 6) et doit concorder avec celle déterminée par le logiciel d'acquisition d'image. Le test de la loi de Stokes teste efficacement les étalonnages et les performances de l'instrument global.
(Équation 2.) 
(Équation 3.) 3. Nanomanipulation de molécules d'ARN simple
- Faire fluidique.
- Percez six trous (mm de diamètre 2 chacun) sur un couvercle de verre n ° 2 (figure 7a) et couper trois fentes (largeur 2 mm) dans du ruban adhésif double-face polyimide (figure 7b) à l'aide d'un graveur laser.
- Faire une chambre d'écoulement en prenant en sandwich deux couvercle en verre avec deux couches de ruban adhésif double face Kapton. Insérez une micropipette et deux tubes de dérivation entre la bande (figure 7c).
- Montez la chambre de flux sur un cadre métallique en faisant correspondre les trous fluidiques (figure 7d).
- Connectez les canaux fluidiques de la chambre à 10 ml seringues remplies avec le tampon de choix par les tuyaux de polyéthylène (figure 7e).
- Montez la totalité de la chambre sur les pinces optiques entre les deux objectifs. Assurez-vous que la face avant de la chambre avec les canaux fluidiques face à la droite. Rétracter le droit objectif et branchez les broches en laiton du cadre (figure 7e) à trous de montage sur til pincettes. Serrez les vis pour fixer la position de la chambre.
- Mélanger l'échantillon et perles recuit. Mélanger l'échantillon recuit avec des perles anti-digoxigénine-enduits (DIG-perles), et laissez le mélange de rester à la température ambiante pendant 5-10 min. Typiquement, 1 ul de l'échantillon recuit est mélangé avec 5 ul DIG-billes dans 1 ml de tampon. REMARQUE: La quantité de billes à être chargée dans la chambre d'écoulement doit être choisi pour assurer une quantité suffisante de billes à être délivré à partir du tube de dérivation. Le rapport entre l'échantillon recuit à billes ne peut pas être facilement quantifiée. Dans un cas idéal, la plupart des billes n'ont pas d'ARN de telle sorte que seule une petite fraction de billes peut avoir seulement une molécule d'ARN par bille. Comme les échantillons recuits et la suspension de billes sont difficiles à quantifier, et la meilleure manière actuellement est seulement de faire varier le rapport de mélange et le mélange tester sur la pince à épiler.
- Fournir des billes vers le site de réaction dans la chambre d'écoulement (par exemple, de quelques micromètres au-dessus de la mipointe de cropipette, figure 7c).
- Chargez une suspension de billes revêtues de streptavidine (streptocoque-billes) dans une seringue de 1 ml.
- Raccorder la seringue au tube de fluide conduisant à la voie inférieure de la chambre d'écoulement (figure 7a).
- Poussez la seringue à couler les streptocoques-billes dans la chambre.
- Déplacer l'ensemble de la chambre en utilisant un logiciel de commande des moteurs afin de placer le piège optique à proximité de l'ouverture du tube de dérivation inférieur (Figure 7b). Actionnez ensuite le piège optique par un trackball pour capturer une angine de billes.
- Déplacer la bille à proximité de la pointe de la micropipette à l'aide du logiciel de commande du moteur.
- Tirer la seringue reliée à la micropipette à sucer la perle sur la micropipette.
- Appliquer flux doucement en appuyant sur la seringue pour le canal central pour débusquer streptocoque-perles supplémentaires.
- De même, fournir le mélange de l'échantillon et les fouilles-perles (voir l'étape 3.2) à la chaîne haut de la chambre.
- Capturer une fouille-perle et l'amener près de la strep perle utilisant le piège optique.
- Nettoyer le canal du milieu en appliquant flux. NOTE: La streptomycine et Dig-perles sont choisis pour être de tailles différentes afin qu'ils puissent être distingués visuellement sous la vue microscopique (Figure 4).
- Pêche "une seule molécule d'attacher entre une paire de talons.
- Placez le dig-perle verticalement au-dessus de l'angine de billes (figure 4).
- Déplacez le dig-talon descendant vers le streptocoque de billes en orientant le piège. Ouvrez une fenêtre de tracé vigueur distance sur l'ordinateur pour visualiser les changements de force.
- Au contact des deux perles, déplacez le dig-perle verticalement loin de l'angine de billes.
- Si aucun contact spécifique est faite, la force reste presque nulle. Si les deux bourrelets sont reliés par des molécules, la force augmente de façon significative lorsque les deux billes se séparent. Ce procédé, communément appelé "pêche", est souvent perfORMED plusieurs fois sur chaque paire de talons pour trouver une attache seule molécule efficace.
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Representative Results
Limité par l'espace, nanomanipulation de molécules d'ARN simple est attesté par des seuls exemples qui se déroulent mécaniques des épingles à cheveux d'ARN et un ARN avec une structure tertiaire.
Manipuler simple épingle à cheveux molécules
Une fois qu'une attache est établie entre les billes, et l'extension de la force sur l'attache peuvent être manipulées en utilisant un protocole défini par l'utilisateur. Quatre protocoles de manipulation communes sont couramment utilisés.
Force-rampe expérience. L'expérience la plus intuitive et commun à manipuler d'une seule ARN est d'étirer et détendre plusieurs fois la molécule dans la direction de l'axe d'hélice de la poignée (verticalement comme représenté sur la figure 4). La force, F, et la position de piège, Y, sont comptabilisés en fonction du temps. L'extension de la molécule, e, peut être calculée par e = Y - F / κ, où est la constante de rappel du trap. Le résultat de traction peut être affiché sous la forme de la courbe force-extension (figure 8a). L'étirement des poignées double brin est représenté par la courbe ascendante avec une pente positive. La courbe de relaxation des poignées qui retrace l'étirement de la. La transition de la structure d'une épingle à cheveux simple, deux Etats-pliage affiche une "arnaque" avec une pente négative, indiquant une seule coopérative transition se déroule 39. Le repliement de l'épingle à cheveux est indiqué par un "éclair" sur la courbe force-extension. Surtout, la même molécule peut être dépliée et repliée à différentes forces à chaque fois. Une telle tendance est évidente sur les distributions des forces de transition (Figure 8b). Généralement, la force est modifiée en fonction linéaire du temps, c'est à dire, à un / déchargement taux de chargement fixe. Avec un taux de chargement / déchargement constante, la cinétique dépendant de la force peuvent être extraites de distributions des forces de transition 40-42.
Expérience Constant Force. Dans le mode à force constante, l'appareil utilise un mécanisme de rétroaction afin de compenser les déviations de la force à partir d'une valeur de consigne. L'extension d'une molécule d'ARN est enregistrée en fonction du temps (figure 9). Réglage de la vigueur à ou près de la force de transition de la transition de molécule d'ARN permet notamment pour l'observation et la quantification des états d'extension moléculaires. Les durées de vie de la molécule à chaque Etat peuvent être mis en commun pour calculer la cinétique de la transition structurelle 7. L'expérience à force constante est utilisé pour surveiller le pliage réversible, tels que ceux d'épingles à cheveux 7,28.
Expérience de travail Jump. Dans une expérience force de saut, la force est rapidement transformé en une valeur différente et maintenue constante; la durée de vie de la première transition est contrôlée 43. La force de saut est particulièrement utile pour caractériser les cinétiques d'processus irréversibles, car la durée de vie de la marche avant et arrière réactions peuvent être directement mesurées séparément à différentes forces. À chaque force saut / chute, une seule vie est observée. Par conséquent, plusieurs séries de telles expériences doivent être réalisées afin de recueillir des observations suffisant pour extraire cinétique.
Les expériences passives. En mode passif, les positions de la trappe et de la micropipette sont tous deux fixés (figure 10). Une épingle à cheveux présente deux états correspondant à l'ARN dépliée et repliée à proximité de ses forces de transition. Contrairement à l'expérience de la force constante, à la fois la force et l'extension de la molécule sur le changement structurel transition. L'élimination de contrôle de rétroaction permet des transitions moléculaires pour être directement contrôlé sans ingérence extérieure. Cependant, il est difficile de maintenir une force constante dans le cadre du mode passif révèle. Comme le diffuse de perles piégé dans le piège optique, les changements de force en conséquence. Thmode passif e est impropre à la mesure des états moléculaires avec de longs temps d'arrêt, au cours de laquelle la force est considérablement modifié. Les avantages et les inconvénients de la force constante et modes passif ont été largement étudié et discuté 44.
Révélez pliant de structures secondaires et tertiaires
Déroulement mécanique d'un ARN baiser de deux paires de bases formées par deux épingles à cheveux liés tétraboucle GACG est utilisé comme un exemple ici (figure 11a). Les deux épingles à cheveux une tige 9 paires de bases, mais les séquences de souches sont différentes. Le chemin déroulement mécanique de l'ARN (figure 11a) a été caractérisé par des méthodes vigueur de la rampe 34. Quand la force est élevée, le complexe baiser est d'abord brisé, suivie déroulement séquentiel des épingles à cheveux. Le repliement, les épingles à cheveux se plient en premier, suivi par une interaction baiser à faible force. Ces transitions sont visibles sur la courbe force-extension (Figure11b). Pour confirmer l'affectation des transitions en épingle à cheveux, chacun des épingles à cheveux peut être étudié individuellement. L'affectation des unkissing / transitions baiser peut être vérifiée par l'étude d'un ARN mutant, dans lequel les tetraloops sont mutés pour empêcher la formation de l'interaction baiser 28. Alternativement, la force la plus faible peut être fixé à 10 pN, plus élevés que les forces de baisers. Comme prévu, la courbe force-extension dans de telles conditions affiche uniquement le déploiement / repliement des épingles à cheveux (Figure 11c) 34. Par conséquent, il est possible d'étudier l'interaction de pliage et embrassant chacune des deux épingles à cheveux de façon indépendante à différentes forces.
Il est à noter que le pliage des deux épingles à cheveux est réversible, alors que l'interaction baiser est très irréversible, comme en témoigne unkissing très différente et les forces de baisers, et par grande hystérésis. Directl Par conséquent, la cinétique de pliage des épingles à cheveux peuvent être étudiéesy en utilisant les expériences à force constante. La cinétique de l'interaction baisers, cependant, doivent être évalués selon la méthode force de saut. La figure 12a montre une expérience de saut en vigueur typique 28. A 3 PN, l'ensemble de l'ARN est plié. La force est ensuite rapidement augmentée à 22 pN et maintenue constante. Après quelques secondes, la totalité de l'ARN est déplié en un seul brin, comme le montre par une augmentation soudaine de l'extension de ~ 30 nm. La force est ensuite portée à 30 pN pour étirer en outre l'ARN, avant qu'il ne soit abaissé à 13 pN. Après avoir plié des épingles à cheveux, la force est rapidement tombé à 8 pN. La formation du complexe baiser est indiquée par le raccourcissement de l'extension par ~ 7-8 nm. En recueillant un grand nombre de ces mesures de durée de vie, unkissing et embrasser cinétique à forces constantes peuvent être calculées.
Dans toutes les conditions expérimentales, le complexe baiser est toujours déroulé en premier. Au forces que les épingles à cheveux sont instables par eux-mêmes, l'interaction de baisersion protège les structures en épingle à cheveux de se déplier. Un tel effet de limitation de vitesse est également révélé par des expériences vigueur de saut. Comme représenté sur la Figure 28 12b, lorsque la force est passé à 16 pN, l'extension de la molécule reste pratiquement inchangée pendant quelques secondes, suivie d'une augmentation de dépliage par l'extension ~ 20 nm. Les changements dans l'extension indiqué le plus faible de sept paires de bases en épingle à cheveux est déplié juste après perturber le complexe embrassant. La métastabilité de l'épingle est évident d'après la vie. Une fois le baiser est cassé, l'épingle transite rapidement entre les Etats pliée et dépliée; la durée de vie est inférieure à 1 s. Essentiellement, cette observation est une expérience à force constante pour déplier l'épingle. En revanche, il faut plus de 10 secondes pour briser le complexe de baiser avec l'épingle à cheveux. De même, la force est grimpé à 17,7 pN (Figure 12c), à laquelle l'ensemble de l'ARN est déplié en un seul brin, comme en témoigne l'enpli dans le prolongement de ~ 30 nm. La bistabilité de la grande, de 11 paires de bases en épingle à cheveux peut être considéré comme le prolongement de houblon entre les deux valeurs. Encore une fois, les courtes durées de vie de l'épingle sont en contraste frappant avec sa longue durée de vie dans l'état métastable. En utilisant une combinaison de la force et vigueur rampe saut expériences, la thermodynamique et la cinétique de la personne qui se déroulent / étapes de pliage peut être mesurée 28. Les observations directes de la rupture et de la formation du complexe embrassant nous permet d'analyser les contributions énergétiques des bases flanquant au complexe de baisers minimum 34 et de mesurer la dépendance de sel de l'interaction baiser 45.
Figure 1: structure par rapport à la force appliquée à ARN. a) Une épingle à cheveux sous tension. b) Tirer un deux-base-paire kissing complex. Les deux boucles en épingle à cheveux sont colorés en rouge et jaune.
Figure 2: Dispositif expérimental. La structure de l'ARN est flanquée de deux anses ADN / ARN. Grâce à des modifications chimiques sur les extrémités des poignées, l'ensemble de la molécule peut être connecté à une paire de billes de protéine revêtue de taille micronique. Une des perles est détenu par un piège optique de mesure de force orientable. L'autre est placée sur une micropipette, qui est entraîné par un étage de flexture piézoélectrique. Le dessin n'est pas à l'échelle.
Figure 3 Un schéma général pour la synthèse de molécules d'ARN avec des poignées. Poignée A, B manipuler, et tmodèle de ranscription sont générés par PCR à partir d'un plasmide avec la séquence d'ARN clone. La poignée A est modifié par digoxigenins (DIG) aux extrémités 3 '. La poignée B a une modification de la biotine à l'extrémité 5 'd'un brin. L'ARN de pleine longueur est transcrit à partir du modèle de la transcription. Les poignées d'ARN et modifiés sont mélangés et recuit. Les molécules peuvent être correctement attaché à une paire de billes revêtues par de la streptavidine et un anticorps anti-digoxigénine. Le dessin n'est pas à l'échelle.
Figure 4 Images de la pêche une seule molécule entre deux billes capturées par la carte vidéo. Un cordon est placé sur la pointe d'une micropipette par aspiration. L'autre est maintenu et dirigé par un piège optique de mesure de force. Les directions des mouvements d'interruption sont indiqués par des flèches. Les perles piégé premiers mouvementsverticalement vers le talon de la micropipette. Lors des contacts, la perle piégée monte. Si un câble d'attache est établie entre les perles, la séparation des perles tire sur les molécules et de la force augmente lorsque la molécule est prolongée. Si deux perles ne sont pas liés par une molécule, le mouvement de rétraction génère pas de force.
Figure 5 A du spectre du mouvement brownien d'une bille piégée de puissance. Solide La courbe est un ajustement de l'équation de Lorentz (Eq. 1), représenté sur l'insert. La constante de ressort du piège peut être calculée à partir de la fréquence de coupure (Eq. 2).
Figure 6 Un exemple de test de la loi de Stokes.
Figure 7 A de la chambre d'écoulement pour l'épilation. a) Six trous, chacun d'un diamètre de 2 mm, sont percés dans une enveloppe en verre n ° 2 à l'aide d'un graveur laser. b) Trois deux fentes mm de large sont découpés dans des bandes de polyimide double face. c) Un examen attentif à la région expérimentale contenant la micropipette et deux tubes de dérivation. Les perles des canaux supérieur et inférieur traversent par leurs tubes de dérivation respectives (bleu et vert) à la cencanal trale dans les directions indiquées par les flèches. d) Monter la chambre fluidique sur un cadre métallique en faisant correspondre les trous fluidiques. e) Une chambre à trois canaux reliés à l'écoulement des tuyaux. Le canal central est utilisé pour extraire l'ARN. Le sommet (bleu) et en bas (vert) canaux sont utilisés pour fournir des perles. La région expérimentale est indiqué par un carré rouge.
Figure 8 rampe de travail. a) Une courbe force-extension de déroulement mécanique d'une épingle à cheveux. Tirer est représenté en bleu et en rouge relaxation. Le déploiement / repliement de l'épingle à cheveux sont indiquées par les flèches. B) Les distributions de déroulement (bleu) et le repliement (rouge) les forces de l'épingle. Le chiffre est adapté d'un manuscrit soumis 39.
Figure 9 Une épingle à cheveux d'ARN sous force constante. a) Schéma de l'expérience. La position de la trappe est modifié par la rétroaction de façon à maintenir une force constante sur l'épingle. B) et la position de travail en fonction du temps pour en épingle à cheveux non / pliage. Comme la force est maintenue constante, la position de la trappe oscille entre deux valeurs, montrant la bistabilité de l'épingle à la force. La distribution binomiale de la distribution de piège donne la variation de l'extension sur l'épingle de déroulement de 19,4 ± 0,2 nm. Le chiffre est adapté d'un manuscrit soumis 39.
Figure 10 Mode passif d'une épingle à cheveux. a) B) la force en fonction du temps et l'extension d'une épingle à cheveux dans le mode passif.
Figure 11. Force rampe de l'ARN baiser de deux paires de bases. a) pliage hiérarchique d'un ARN baiser de deux paires de bases sous tension mécanique. b) Courbe force-extension. Transitions structurelles sont indiquées par des flèches. C) de la courbe force-extension lorsque la force la plus basse est fixée à 10 pN pour empêcher l'interaction embrasser. Le fichiffre est adapté avec la permission du Journal of American Chemical Society 34.
Figure 12. Force saut de l'ARN baiser de deux paires de bases. a) Une force cycle de saut / chute de mesurer unkissing et la durée de vie de baisers à deux forces différentes. Le panneau supérieur montre la trace temporelle de la force. Le panel du bas montre l'extension relative de la molécule. La force est d'abord bondi de 3 pN à 22 pN pour mesurer la durée de vie du complexe embrassant à 22 pN. Le unkissing est indiqué par une augmentation rapide de l'extension de ~ 30 nm, ce qui indique l'ensemble de l'ARN se déploie en un seul brin. Sur la relaxation, la force vers le bas est une rampe de 14 pN pour permettre aux deux épingles à cheveux de se replier. La force est ensuite tombé à 8 pN. Formation de l'interaction baiser est indiqué par une diminution de l'extension de ~ 7-8 nm b.)En vigueur est passé à 16 pN, la trace du temps l'extension montre qu'il faut plusieurs secondes pour que le complexe baisers et les sept paires de bases en épingle à cheveux à se dérouler, après quoi l'épingle à cheveux se déplie et se replie rapidement. C) L'ensemble du complexe de baiser est déplié en un seul brin quelques secondes après la force est grimpé à 17,7 pN. Le vestige montre la bistabilité de 11 paires de bases en épingle à cheveux. Chacune des transitions structurelles de déroulement de l'ARN embrasser montre X. distinctif Le chiffre est adapté avec la permission de Actes de l'Académie nationale des sciences 28.
| Réactif | ul |
| Le plasmide (10 ng / ml) | 10 |
| Primer T7F (100 mM) | 10 |
| Primer Br (100 mM) | 10 |
| dNTP mix (25 mM chacun) | 10 |
| 10xUn tampon de PCR | 100 |
| H 2 O | 850 |
| Taq ADN polymérase | 10 |
| Total | 1000 |
Note: Un cycle thermique typique pour la synthèse de l'ADN de 3 kb est la suivante: 95 ° C 45 secondes, 53 ° C 1 minute, 72 ° C 3 minutes.
Tableau 1 Exemple de synthèse de modèle pour la PCR de la transcription.
| Réactif | ul |
| modèle (> 200 ng / ml) | 8 |
| PNT | 8 (2 mL chacune) |
| Un tampon de réaction 10X | 2 |
| L'ARN polymérase T7 | 2 |
| Total | 20 |
Remarque: incuber la réaction à 37 ° C overnight.
Tableau 2 La transcription in vitro.
| Réactif | ul |
| Poignée A (~ 10 mg) | 50 |
| Biotine-11UTP | 5 |
| un tampon de réaction pol T4 | 5 |
| Solution de BSA | 1 |
| L'ADN polymerase T4 | 5 |
| Total | 66 |
Remarque: incuber la réaction à la température ambiante pendant 20 minutes. Inactiver l'enzyme par chauffage à 70 ° C pendant 20 minutes, suivi par un refroidissement lent à température ambiante.
Tableau 3 Primer réaction d'extension.
| Réactif | ul |
| Formamide | 800 |
| EDTA (0,5 M, pH 8,0) | 2 |
| TUBES (1 M, pH 6,3) | 40 |
| NaCl (5M) | 80 |
| Total | 922 |
Tableau 4 Recette de la mémoire tampon de recuit.
| Réactif | |
| Biotine-HA | 1000 ng |
| Dig-HB | 1000 ng |
| ARN | 1000 ng |
| tampon de recuit | 80 ml |
Note: Un cycle thermique de recuit typique est la suivante: 95 ° C 10 minutes, 62 ° C 1 heure, 52 ° C 1 heure, puis la rampe de 4 ° C.
Tableau 5 ARN de recuit avec poignées.
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Discussion
Modification et dépannage dans la préparation des échantillons à la pince
Choix du vecteur de clonage. Bien que le schéma général décrit ici (figure 3) ne nécessite pas un vecteur de clonage particulier, le vecteur est préférable de ne pas avoir intrinsèque T7 ou le promoteur T3 pour la facilité de la transcription tel qu'un promoteur peut être introduit par PCR dans des positions souhaitées.
Séquence et longueurs des poignées. Il n'est pas nécessaire de séquence spécifique pour les poignées. Toutefois, un rapport proche de GC AT est préféré, tandis que des séquences homopolymères et hautement répétées doivent être évitées. Dans des travaux publiés, les deux poignées sont maintenues comme des longueurs similaires de telle sorte que la structure de l'ARN d'intérêt est placé à peu près au milieu. Des travaux antérieurs montrent que la longueur totale de la poignée a varié de 500 à 10 000 paires de base affecte la cinétique subtile 46,47 mesurées.
ve_content "> Contrôle de la qualité et de dosage du mélange recuit. Outre l'ARN prévue avec des poignées, le produit final contient également des poignées non recuites d'ADN et d'ARN, ainsi que d'autres. Il est difficile et peu économique pour purifier les molécules épiler. Au lieu de cela, le recuit mélange peut être utilisé directement pour l'épilation, parce que seuls les acides nucléiques convenablement recuits peut être attaché à deux bourrelets de la surface revêtue. produit convenablement recuit est également difficile à distinguer de la poignée et de l'ARN par électrophorèse sur gel d'agarose. La meilleure façon de tester la qualité et de quantifier la concentration du produit recuit est de le tester sur la pince à épiler. Cependant, il est utile de vérifier et de quantifier les produits de PCR et de transcription dans chaque étape en utilisant diverses techniques de biologie moléculaire.Différentes approches à l'attache ARN à Perles. Il existe de nombreuses méthodes envisageables pour lier des molécules d'ARN à des surfaces de manière covalente ou non covalente 48
Simple ou en plusieurs molécules d'attache. Une paire de Streptomyces et Dig-billes peut être relié par plusieurs molécules. Pour démêler cette possibilité de multiples molécules attacher le cordon, les courbes force-distance doivent être examinées de près. Seule molécule attache afficher une élasticité ver-chaîne 4 qui est généralement invisible à attaches multiples molécules. Expériences témoins supplémentaires spécifiques à chaque système peuvent être nécessaires pour confirmer l'élément d'attache seule molécule.
Améliorations des Minitweezers
Enregistrement des données rapide et lent. Le Minitweezers a un haut-acquisition de données qui enregistre jusqu'à 21 paramètres instrumentaux à une vitesse de 200 Hz dans un ordinateur, qui sera désignée comme l'ordinateur de commande dans ce travail. Cependant, certaines applications et des étalonnages nécessitent un taux d'acquisition de données rapide. A cette fin, les signaux électroniques de force et la distance sont divisées à enregistrer dans un autre ordinateur, l'ordinateur "enregistrement rapide", en plus de l'acquisition de données dans l'ordinateur de commande. L'ordinateur rapide d'enregistrement lit les données à travers une carte et le logiciel d'acquisition de données séparé, ce qui permet à plusieurs canaux jusqu'à 1 MHz. La nouvelle acquisition des données de l'ordinateur et ne pas interférer avec le fonctionnement de l'instrument, qui est uniquement contrôlé par l'ordinateur de commande. Dans une expérience, les données sont enregistrées simultanément sur les deux ordinateurs à des taux différents. synchronisation de l'heure est effectuée au cours de l'analyse des données en comparant les fichiers de données correspondants.
Enregistrement vidéo de l'image. Une carte vidéo et de logiciels d'imagerie sont installés sur l'ordinateur rapide d'enregistrement pour capturer des images en direct de la réaction et d'analyser les images vidéo. Cette évolution permet de mettre en œuvre des til taille des pixels et des étalonnages de distance décrites ci-dessus.
Limitations et futures applications de la méthode
Les méthodes de manipulation et de mesurer avec précision les changements de conformation d'une molécule d'ARN unique ont été examinées. Ces capacités permettent de surveiller réarrangement structural d'un brin d'ARN en temps réel. En outre, la force peut être utilisée pour influer sur la structure de l'ARN et des voies de pliage, ce qui permet des structures rares et / ou moins d'être optimale pour être pliées.
Cependant, il ya des limites de l'approche mécanique. Plus important encore, l'extension, qui est utilisée pour interpréter les changements de conformation, est une projection unidimensionnelle de la structure en trois dimensions. Il est possible que certains changements conformationnels ne peuvent pas être mesurés 49-52, et / ou des barrières cinétiques sont cachés de l'observation 53. Il existe également divers effets et les limites instrumentales qui peut unffet la thermodynamique et cinétique 44,46,47 observés.
Les pinces optiques ont été appliquées à l'étude d'un nombre limité de structures d'ARN, par rapport à de nombreuses transcriptions proposées par les enquêtes de l'ensemble du génome 54. La technique sera utilisée pour étudier différents motifs structurels et grands ARN. En outre, la méthode de trouver de nouvelles applications dans la recherche de l'ARN. Par exemple, le ligand de liaison à l'ARN et des protéines peut stabiliser ou modifier la structure de l'ARN, qui peut être mesurée en utilisant l'approche mécanique.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minitweezers | Steven B. Smith Engineering | http://tweezerslab.unipr.it | |
| Data acquisition card | National Instruments | USB-6351 | |
| Video card | National Instruments | PCI-1407 | |
| Labview programming software | National Instruments | ||
| NI Vision Builder | National Instruments | ||
| Laser engraver | Epilogue laser systems | Zing-16 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MEGAscript T7 kit | Life Technologies | AM1334 | |
| MEGAclear kit | Life Technologies | AM1908 | |
| Biotin-11-UTP | Thermo Fisher | FERR0081 | |
| T4 DNA polymerase | New England Labs | M0203 | |
| Streptavidin coated microsphere | Spherotech | SVP-20-5 | |
| Antidigoxigenin coated microsphere | Spherotech | DIGP-20-2 | |
| Size standard microspheres | Spherotech | PPS-6K | |
| Kapton tape | Kaptontape.com | KPPTDE-1 | |
| No. 2 cover glass | Thermo Fisher | 12-543D |
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