Abstract
חלק גדול מהגנום האנושי הוא עיבד אבל לא תורגם. בעידן הגנומי הודעה זו, פונקציות רגולטוריות של RNA הוכחו להיות חשוב יותר ויותר. כפונקציה RNA תלויה לעתים קרובות ביכולתה לאמץ מבנים חלופיים, שקשה לחזות מבנים תלת ממדיים RNA ישירות מרצף. מולקולה בודדת גישות פוטנציאלי מופע כדי לפתור את הבעיה של פולימורפיזם מבני RNA על ידי ניטור מבנים מולקולריים מולקולה אחת בכל פעם. עבודה זו מציגה שיטה כדי לתפעל את הקיפול ומבנה של מולקולות RNA בודדות באמצעות פינצטה אופטית בדיוק. ראשית, שיטות לסנתז מולקולות מתאימות לעבודה מכאנית מולקולה בודדת מתוארות. הנהלים הבא, שונים כיול כדי להבטיח את פעילותו התקינה של פינצטה האופטית הם דנו. בשלב הבא, ניסויים שונים מוסברים. כדי להדגים את התועלת של הטכניקה, קיסין תוצאות של סיכות ראש RNA מכאני התגלגלות וRNA בודדמורכב גרם משמשים כראיה. בדוגמאות אלה, טכניקת nanomanipulation שימשה ללמוד קיפול של כל תחום מבני, ובכלל זה משני ושלישוני, באופן עצמאי. לבסוף, המגבלות ויישומים עתידיים של השיטה הם דנו.
Introduction
הפיתוח של טכניקת פינצטה האופטית כבר מלווה ארוך עם היישום שלה במחקר ביולוגי. כאשר השפעת ההשמנה האופטית התגלתה לראשונה, ארתור Ashkin ציין כי חיידקים במים מזוהמים יכולים להיות לכוד במוקד הלייזר 1. מאז, חיידקי השמנה הפכו ניסוי לא מכוון, כיף לדורות של תלמידי ביופיסיקה, כמו גם כלי מחקר רציניים ללמוד פיזיולוגיה של חיידקים 2,3. טכניקת הלכידה האופטית משתמשת בקרן לייזר ממוקדת כדי לשתק אובייקט מיקרוסקופי 1. למעשה, פונקציות מלכודת לייזר כמעיין אופטי, אשר מודד גם כוח (F) על האובייקט שנלכד על ידי עקירתה ממרכז המלכודת (ΔX). בטווח קצר, F = κ x ΔX, בκ הוא קבוע הקפיץ של המלכודת. המלכודת האופטית יכולה לשמש כדי להפעיל כוח בpicoNewton דיוק (PN) למייקרואובייקט copic ולמדוד את עמדתה עם ננומטר דיוק (ננומטר). בשני העשורים האחרונים, פינצטה אופטית הפכה לאחד טכניקות מולקולה בודדת הנפוצות ביותר בביופיזיקה. הטכניקה כבר מועסק ללמוד מתקפל ומכניקה של DNA 4-6, 7-9 RNA, וחלבוני 10,11. פינצטה אופטית יש גם שימשה להתבונן שכפול הדנ"א 12, שעתוק RNA 13, וסינתזה של חלבון 14,15, כמו גם אירועים אחרים רבים biomolecular 16-18.
גישות מולקולה בודדת מועסקות במחקר מבני RNA בעיקר כדי לחקור את נוף אנרגיית קיפול המחוספס של רנ"א. רצף הרנ"א בדרך כלל יכול לקפל לתוך מבנים יציבים, שוללות מרובים, בשל כללי הרכב כימי וקילוף בסיס הפשוט של רנ"א. זה כבר זמן רב ידוע כי פולימורפיזם מבני RNA, כגון שמתרחש בriboswitches 19,20, ממלא תפקיד חשוב בויסות הגנים. Recenסקר הגנום t גילה כי שינויים בטמפרטורה קטנה כמו כמה מעלות להשפיע סינתזת מבנה וחלבון של חלק גדול מtranscriptome הסלולרי 21 מאוד. דוגמא זו מרמזת כי התפקיד הביולוגי של קיפול RNA החלופי הוא אולי יותר חשוב ונרחב יותר מאשר הניח בעבר. פולימורפיזם מבני, לעומת זאת, מהווה אתגר לגישות ביוכימיות וbiophysical המסורתיים, הבודקות תכונות ממוצעת של מולקולות רבות. לדוגמא, "על" ותצורות "את" של riboswitch אינן יכולות להתקיים. מבנה ממוצע נגזר ממבנים הטרוגנית אינו צפוי להיות דומה גם של conformers הרלוונטי מבחינה ביולוגית. יתר על כן, RNA מתורגם וmRNA בדרך כלל ליצור מבנים. האינטראקציה שלהם עם חלבונים וRNAs הרגולציה נפוצה דורשת התגלגלות של מבנה הקיים, כחלק מהאינטראקציה. לכן, לומד RNA התגלגלות / refolding הופך רלוונטינושא של הביולוגיה RNA. כדי לעמוד באתגר כזה, גישת המולקולה בודדת כבר מועסק לפענח פולימורפיזם מבני RNA על ידי לימוד מולקולה אחת בכל פעם 22-27.
בהשוואה לשיטת הקרינה המולקולה בודדת הפופולרית, פינצטה מבוססת מכאני התגלגלות מציעה יתרון כי תצורות של מולקולות בודדות ניתן להשפיע על ידי כוח ליישם ולמדוד בדייקנות ננומטר. יכולת nanomanipulation זה יכול להיות מנוצל כדי לפקח על התגלגלות / הקיפול של תחומים מבניים אדם כזה שמתקפל ההיררכי של RNA גדול יכול להיות גזור 28. לחלופין, גדיל בודד יכול להיות מופנה אל לקפל לתוך אחד מכמה conformers; או מבנה הקיים יכול להיגרם באופן מכאני ללקפל לתוך קונפורמציה שונה 29. בתנאים ביולוגיים, מבנה RNA ניתן לשנות על שינוי הטמפרטורה או ליגנד מחייב. היכולת של ים מולקולרי ישירות מניפולציהtructure פותח מקום חדש של מחקר המבני RNA. באופן עקרוני, טכניקות מכאניות אחרות, כגון מיקרוסקופ כוח אטומי ופינצטה המגנטית, יכולות לשמש גם כדי ללמוד קיפול של מולקולות RNA בודדות. עם זאת, יישומים אמורים מוגבלים בעיקר בשל הרזולוציה מרחבית הנמוכה יחסית 30.
העסקתו של פינצטה אופטית מאפשרת מבני RNA שפרשו בכוח מכאני.
היתרון של מכאני התגלגלות הוא פי כמה וכמה. כוח יכול לשמש כדי להתפתח מבנים הן משניים ושיישונים, ואילו יונים של מתכות ומתקפלים ליגנד המושרה הם בעיקר מוגבלים למבנים שלישוני. טמפרטורה וdenaturant יכולים להשפיע באופן משמעותי את פעילותם של מים ומומסים. בניגוד לכך, כוח מיושם באופן מקומי כדי להפריע מבנים מולקולריים; ההשפעה של כוח על הסביבה היא זניחה. בנוסף, היתוך תרמי משמש הטוב ביותר ללמוד תרמודינמיקה קיפול של מבני RNA קטנים,ואילו פינצטה אופטית הייתה בשימוש ללמוד מבני RNA בגדלים שונים, הנע בין סיכת ראש tetraloop שבעה בסיס זוג 28 לribozyme 400 נוקלאוטיד 31 ב. יתר על כן, מבני RNA ניתן פרשו באופן מכאני בטמפרטורות מזופיליות. בניגוד לכך, להתפתח RNAs בניסוי היתוך תרמי, הטמפרטורה עולה בדרך כלל הרבה מעל טמפרטורות פיסיולוגיות, אשר מגדילה באופן משמעותי הידרוליזה RNA, במיוחד בנוכחות של יוני Mg 2 +.
חשוב לציין כי ההשפעה המכנית של כוח תלויה איך הוא מוחל למבנה. הכח ליישם מטה נוף האנרגיה מתקפל. לדוגמא, כאשר הכוח מוחל על סיכת ראש, זוגות בסיסיהם ברצף שבורים, אחד בכל פעם (איור 1 א). המזלג קורע מתקדם לאורך ציר הסליל, שהוא ניצב לכח ליישם. בניגוד לכך, כאשר מורכב נשיקות מינימליות הוא תחת מתח, שתי נשיקותזוגות בסיסים, אשר מקבילים לכח המונע, חולקים את כוח העומס (איור 1b). הגיאומטריות השונות של סיכת הראש ויחסית מורכבים לנשק לתוצאת הכוח ליישם בתגובה המכנית השונות שלהם, שיכול להיות מנוצל כדי להבחין קיפול שניוני ושלישונית 28,32. ההיבט התיאורטי של מכאני התגלגלות נבדק בעבר 8,9,30. עבודה זו מתארת את הגישות הבסיסיות להקמה ולבצע assay התגלגלות מכאני מולקולה בודדת.
התקנה ניסיונית. 7 בניסוי מושך המכני שלנו, מדגם RNA לtweezing מורכב מרנ"א של עניין וצדיו שתי ידיות פעמיים תקועים DNA / RNA (איור 2). כל המולקולה יכולה להיות קשורה לשני חרוזים מצופים משטח בגודל מיקרון (Spherotech) באמצעות streptavidin ביוטין ואינטראקציות נוגדן digoxigenin-אנטי digoxigenin, בהתאמה. חרוז אחד מוחזק על ידי TR האופטי למדידת כוחap, ואילו האחרים מוחזק על קצה micropipette. המרחק היחסי בין חרוזים ניתן לשנות על ידי מי מנווט את המלכודת או העברת micropipette. שימוש בגישה זו, מולקולת RNA חד קשירת חרוזים יכולה להיות מתוחה ורגועה.
הכנת דוגמאות. הסינתזה של דגימות RNA לtweezing כוללת כמה צעדים (איור 3). ראשית, רצף DNA המתאים לRNA של עניין הוא משובט ראשון בוקטור פלסמיד. בשלב בא, שלוש תגובות PCR מבוצעות כדי ליצור שתי ידיות ותבנית לשעתוק. תבנית השעתוק מקיפה את אזורי הידית ורצפים שהוכנסו. RNA באורך המלא הוא מסונתז על ידי שעתוק במבחנה. אחרון, RNA וידיות שינוי כימי הם מרותקים יחד כדי ליצור מולקולות למריטות חוזרות ונשנה.
כיול והפעלה של מלקחיים. העיצוב הבסיסי של שימוש Minitweezersד בעבודה זו נובע כי בפינצטה האופטית כפול קורה 33. עם שיפורים רבים, Minitweezers להציג יציבות יוצאת דופן בהשוואה לפינצטה האופטית הדור הראשון. מספר קבוצות מחקר בכמה מדינות להשתמש Minitweezers במחקר המולקולה בודדת שלהם 14,15,34-37. הפרטים של בנייה, כיול, והפעלה של המכשיר, כוללים קטעי וידאו הדרכה, זמינים באתר האינטרנט של "המעבדה מלקטת" (http://tweezerslab.unipr.it). הנה, שיפורים ונהלי כיול שצריך להתבצע על בסיס יומי מתוארים בפירוט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 הכנת RNA המולקולות לtweezing מולקולה בודדת
- שיבוט הרצף של עניין. לשכפל את רצף DNA התואם את מבנה RNA לוקטור.
- סינתזה וטיהור של תבנית השעתוק. לסנתז תבנית שעתוק על ידי PCR. [שולחן מקום 1 כאן] הבא, לטהר מוצרי PCR באמצעות ערכת טיהור PCR, ולרכז את המדגם ל> 200 ng / μl. בגלל DNA המטוהר משמש לשעתוק, יש להשתמש במים RNase ללא בצעדים elution וריכוז.
- בשעתוק במבחנה. לסנתז RNA על ידי שעתוק במבחנה ב 37 מעלות צלזיוס למשך לילה על מנת למקסם את תשואת RNA. [שולחן מקום 2 כאן] לאחר שעתוק, להוסיף DNase μl 1 אני לעכל את תבנית DNA ל15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לטהר RNA באמצעות טור ספין סיליקה.
- סינתזה של א 'ידית biotinylated ראשונה, לייצר את הידית ללא שינוי על ידי PCR באמצעות פריימרים אפ וא וקונצרט כלשהוentrate DNA המוגבר ל> 200 ng / μl. בשלב הבא, לשלב שינויים ביוטין למוצר באמצעות PCR תגובת סיומת פריימר. הערה [מקום 3 בטבלה כאן]: ידית biotinylated (ביוטין-HA) ניתן להשתמש ישירות בחישול ללא טיהור. כביוטין-HA הוא להיות מרותק עם RNA, זה קריטי להשתמש במי RNase ללא בשני השלבים.
- סינתזה של הידית הותאם digoxigenin B. לסנתז digoxigenin הותאם ידית B (DIG-HB) על ידי PCR באמצעות פריימר Bf ואוליגו הותאם digoxigenin Dig-Br (איור 3). בשלב הבא, לטהר את מוצר PCR ולהתרכז המדגם ל> 200 ng / μl.
- RNA חישול לידיות. לחשל RNA עם ידיות. [שולחנות מקום 4 ו -5 כאן]
- לטהר מדגם annealed. הוסף 3 כרכים של אתנול מהמדגם המרותק ומערבבים היטב. אחסן את התערובת ב -70 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1. ספין למטה ב15,800 XG ולהשליך supernatant. ייבש את גלולה באמצעות lyophilizer. ממיסים את גלולה ב100 מים חופשיים μl RNase. הערה: המדגם הוא מוכן לשימוש וניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
.2 כיול והפעלה של מלקחיים אופטיים
- לכייל גודל פיקסל של וידאו צג
- השתמש במלכודת האופטית למלכודת חרוז בקוטר ידוע (סטנדרטי בגודל).
- צלם תמונות של חרוז לכוד באמצעות תוכנת הדמיה (איור 4).
- לקבוע את הקוטר של חרוז באמצעות תוכנת ההדמיה המבוססת על שיטת centroid.
- חזור על הליך זה כדי לקבוע קטרים של חרוזים בגדלים שונים.
- התאם את הקטרים נמדדו וידועים של החרוזים על ידי רגרסיה ליניארית כדי לקבל את הגודל הפיזי של פיקסל.
- ודא מרחק כיול
- השתמש במלכודת האופטית למלכודת חרוז.
- לקבוע את מיקום פיקסל של centroid שלה על ידי התוכנה ללכידה תמונה ולהקליט את עמדתה באמצעות Minitweezers.
- לנווט את חרוז לdiffe לשכור עמדות ולחזור על קביעת העמדה.
- להמיר את עמדות X ו Y של חרוז מפיקסלים ליחידה מ 'שימוש בגודל פיקסל המכויל.
- השווה את X ו Y בין העמדות שנמדדו על ידי וידאו ועל ידי Minitweezers. שני סטים של ערכים צריכים להסכים. כרזולוציית התמונה היא> 0.1 מיקרומטר, להעביר את חרוז על 1 מיקרומטר בין מדידות כדי להבטיח דיוק. אם כיול המרחק הוא לא בר השוואה לזה שמאוחסן בMinitweezers, לכייל מחדש את המכשיר.
- מלכודת נוקשות כיול
- ללכוד חרוז באמצעות המלכודת האופטית ולהחזיק אותו עדיין.
- רשום את הכוח של המלכודת באמצעות רכישת נתונים מהירים עוקפת בקצב> 5 kHz במשך 3 שניות.
- צור כוח ספקטרום מההקלטה של תנועת חרוז באמצעות תוכנה. התאם את ספקטרום הכח של לורנץ (איור 5) 38:
542 51542eq1.jpg "width =" / 200 "/> (EQ. 1)
שבו S (f) הוא הכח בתדירות של f, f c הוא שכיחות הפינה, וS 0 הוא כוח אסימפטוטי. תדירות הפינה, f ג, היא התדר שבו כוחה של תנועה תרמית ירד למחצית מערך אסימפטוטי. כf c משתנה עם כוח הלייזר וגודל חרוז, לכייל כל חרוז לכוד בנפרד. - לחשב את קבוע הקפיץ של המלכודת, κ, מf c:
(משוואה. 2)
בי γ הוא מקדם גרר של חרוז (EQ. 3). השתמש בקבוע הקפיץ כדי לקבוע שינויי הארכת RNA משינוי בכח.
- מבחן החוק 'סטוקס
- ללכוד חרוז באמצעות המלכודת האופטית. הזז את חרוז גב ו-כוח במהירות שונה.
- רשום את התנועה של חרוז ולכפות באמצעות Minitweezers.
- לחשב את הרדיוס של חרוז.
הערה: כוח החיכוך, ד F, שנוצרה על ידי תנועתו של חלקיק כדורי בתוך נוזל יכולה להיות מתוארת על ידי החוק "סטוקס:
(משוואה. 3)
שבו r הוא הרדיוס של הכדור, v הוא המהירות, ושעות היא הצמיגות הדינמית של הנוזל, אשר ניתן למצוא בטבלאות התייחסות. שימוש בכוח נמדד כד F, הרדיוס של חרוז יכול להיות מחושב באמצעות משוואה. 3 (איור 6) וצריך להסכים עם זה שנקבע על ידי תוכנת רכישת תמונה. מבחן החוק 'סטוקס ביעילות בדיקות כיולים וביצועים של המכשיר בכללותה.
(משוואה. 2) 
(משוואה. 3) .3 Nanomanipulation של יחיד RNA מולקולות
- מה שהופך את fluidics.
- לקדוח שישה חורים (קוטר 2 מ"מ כל אחד) על מכסה זכוכית מס '2 (7 א' איור) ולחתוך שלושה חריצים (רוחב 2 מ"מ) לקלטת polyimide דו צדדית (איור 7 ב) באמצעות חרט לייזר.
- הפוך תא זרימה על ידי הרבדה שתי מכסה זכוכית עם שתי שכבות של סרט חד צדדי כפול Kapton. הכנס micropipette ושני צינורות עוקפים בין הקלטת (7 ג איור).
- הר תא הזרימה על מסגרת מתכת על ידי (ד 7 איור) חורי fluidic התאמה.
- חבר את ערוצי fluidic של החדר ל10 מ"ל מזרקים מלאים בחיץ של בחירה באמצעות tubings פוליאתילן (7e איור).
- הר כולו קאמרי על פינצטה האופטית בין שני היעדים. ודא שהצד הקדמי של החדר עם ערוצי fluidic פונה ימינה. לחזור בו מהמטרה הנכונה ולחבר את סיכות פליז של המסגרת (7e איור) לחורים הרכבה על tהוא פינצטה. חזק את הברגים כדי לתקן את מיקום התא.
- ערבוב המדגם וחרוזים המרותקים. מערבבים את מדגם annealed עם חרוזים מצופים אנטי digoxigenin (DIG-חרוזים), ולתת לתערובת להישאר בטמפרטורת חדר למשך 5-10 דק '. בדרך כלל, μl 1 מתוך מדגם מרותק מעורבב עם חפירות-חרוזים 5 μl ב 1 מ"ל של חיץ. הערה: כמות חרוזים להיות טעונה לתוך תא הזרימה צריכה להיבחר על מנת להבטיח כמות סבירה של חרוזים כדי להיות מועברת מצינור המעקף. היחס של המדגם המרותק לחרוזים לא ניתן לכמת בקלות. במקרה אידיאלי, יש לי ביותר חרוזים לא RNA כך שרק חלק קטן של חרוזים עשוי להיות רק מולקולה אחת RNA לחרוז. כדוגמות המרותקות והשעית חרוז שקשה לכמת, את הטוב ביותר ורק דרך כיום הוא לגוון את יחס הערבוב ולבדוק את התערובת על פינצטה.
- לספק חרוזים לאתר התגובה בתא הזרימה (כלומר, מיקרומטרים אחדים על גבי מילטיפ cropipette, 7 ג איור).
- לטעון השעיה של חרוזים streptavidin מצופה (סטרפטוקוקוס-חרוזים) לתוך מזרק 1 מ"ל.
- חבר את המזרק לצינור fluidic המוביל לערוץ התחתון של תא הזרימה (איור א 7).
- לדחוף את המזרק לזרום סטרפטוקוקוס-חרוזים לתוך התא.
- להעביר את כל החדר באמצעות תוכנת שליטה מוטורית למקום המלכודת האופטית ליד הפתח של החלק התחתון העוקף הצינור (7b איור). ואז להפעיל את המלכודת האופטית על ידי העקיבה כדי ללכוד סטרפטוקוקוס-חרוז.
- הזז את חרוז הקרוב לקצה micropipette באמצעות תוכנת השליטה המוטורית.
- משוך את המזרק מחובר לmicropipette למצוץ חרוז על micropipette.
- החל זרימה בעדינות על ידי לחיצה על המזרק לערוץ האמצע כדי לשטוף את זיהום חיידקי חרוזים נוספים.
- באופן דומה, לספק התערובת של מדגם וחפירות-חרוזים (ראה שלב 3.2) לערוצו העליון של התא.
- ללכוד חפירת חרוז ולהביא אותו קרוב לסטרפטוקוקוס-חרוז באמצעות המלכודת האופטית.
- נקה את ערוץ האמצע על ידי יישום זרימה. הערה: strep- ולחפור-חרוזים בוחרים להיות בגדלים שונים, כך שהם יכולים להיות מצוינים מבחינה ויזואלית תחת המבט המיקרוסקופי (איור 4).
- דייג "מולקולה בודדת קשירה בין זוג של חרוזים.
- הנח את חפירת החרוז אנכי על גבי סטרפטוקוקוס-חרוז (איור 4).
- הזז את חפירת החרוז מטה לכיוון סטרפטוקוקוס-חרוז ידי מנווט את המלכודת. פתח חלון עלילת כוח למרחקים במחשב כדי לחזות שינויים בכוח.
- במגע של שני חרוזים, להעביר את חפירות החרוז אנכי מן סטרפטוקוקוס-חרוז.
- אם אין קשר מסוים הוא עשה, הכוח נותר כמעט אפס. אם שני חרוזים מחוברים על ידי מולקולות, עליות הכוח באופן משמעותי, כאשר שני חרוזים להפריד. הליך זה, המכונה גם "דיג", הוא לעתים קרובות Perfמספר פעמים ormed על כל זוג חרוזים למצוא לקשור מולקולה בודדת יעילה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מוגבלת על ידי מרחב, nanomanipulation של מולקולות RNA יחידה באה לידי ביטוי בהצגת דוגמאות רק מכאניות התגלגלות של סיכות ראש RNA וRNA עם מבנה שלישוני.
מניפולציות מולקולות בודדת מכבנה
ברגע שרצועה שנוצרה בין חרוזים, הארכת וכוח ברצועה ניתן להשפיע באמצעות פרוטוקול מוגדר על ידי משתמש. ארבעה פרוטוקולי מניפולציה נפוצים נמצאים בשימוש נפוץ.
ניסוי כוח רמפה. ניסוי אינטואיטיבי והנפוץ ביותר כדי לתפעל RNA בודד הוא למתוח שוב ושוב ולהירגע המולקולה בכיוון של ציר הסליל של הידיות (במאונך כפי שמוצג באיור 4). הכוח, F, ואת מיקום מלכודת, Y, נרשמים כפונקציה של זמן. הסיומת של המולקולה, הדואר, יכולה להיות מחושבת על ידי e = Y - F / κ, שבו הוא קבוע הקפיץ של טרה p. התוצאה מושכת יכולה להיות מוצג כעקומת כוח הרחב (8 א 'איור). המתיחה של ידיות פעמיים תקועים מוצג על ידי העקומה עולה עם שיפוע חיובי. עקומת ההרפיה של הידיות משחזרת זה של מתיחה. המעבר המבני של סיכת ראש פשוטה, שתי מתקפל מדינה מציג "לקרוע" עם שיפוע שלילי, המצביע על מעבר חד, שיתופי התגלגלות 39. Refolding של סיכת הראש מצויינים על ידי "zip" על עקומת כוח הרחבה. חשוב לציין, באותה המולקולה עשויה להיות פרשה וקפלה בכוחות שונים בכל פעם. מגמה זו באה לידי ביטוי בחלוקת כוחות המעבר (איור 8b). בדרך כלל, הכוח משתנה כפונקציה ליניארית של זמן, כלומר, בטעינה קבועה / שיעור פריקה. תחת קצב טעינה / פריקה קבועה, ניתן לחלץ קינטיקה תלויה בכח מההפצות של כוחות המעבר 40-42.
התחת = "jove_content"> ניסוי כוח קבוע. תחת מצב כוח הקבוע, המכשיר מעסיק מנגנון משוב לפצות את סטיות הכוח מערך שנקבע. הסיומת של מולקולת RNA נרשמת כפונקציה של זמן (איור 9). הגדרת הכוח ליד או כוח המעבר של מעבר מולקולת RNA המסוים מאפשרת התצפית וכימות של מדינות אכסטנציונאלית מולקולריות. החיים של המולקולה בכל מדינה ניתן ויקוו יחד כדי לחשב את קינטיקה של מעבר מבני 7. ניסוי הכוח הקבוע משמש כדי לפקח קיפול הפיך, כגון אלה של סיכות ראש 7,28.
ניסוי כוח קפיצה. בניסוי כוח לקפוץ, הכוח משתנה במהירות לערך שונה ונשמר קבוע; חייו של המעבר הראשון הוא פיקוח 43. קפיצת הכוח שימושית במיוחד לאפיין את קינטיקה שלתהליכים בלתי הפיכים, משום שחייהם של קדימה ותגובות הפוכות ניתן למדוד בנפרד ישירות בכוחות שונים. בכל קפיצה / ירידה בכוח, רק אחד לכל החיים הוא ציין. לכן, סבבים רבים של ניסויים כאלה צריכים להתבצע על מנת לאסוף תצפיות מספיק כדי לחלץ קינטיקה.
ניסויים פסיביים. תחת המצב הפסיבי, את עמדותיהם של המלכודת וmicropipette שניהם קבועות (איור 10). סיכת ראש מציגה שתי מדינות מקבילות לRNA המקופל ומקופל בסמוך לכוחות המעבר שלה. בניגוד לניסוי הכוח הקבוע, שניהם הכוח והסיומת של שינוי המולקולה עם המעבר המבני. ביטול בקרת משוב מאפשר מעברים מולקולריים כדי להיות במעקב באופן ישיר ללא התערבות חיצונית. עם זאת, קשה לשמור על כוח קבוע תחת המצב הפסיבי מגלה. כמפוזר חרוז לכוד במלכודת האופטית, שינויי כוח בהתאם. הבמצב פסיבי דואר אינו מתאים למדידת מדינות מולקולריות עם זמן להתעכב ארוך, שבמהלכו לכפות ישתנו באופן משמעותי. היתרונות והחסרונות של הכוח הקבוע ומצבים פסיביים נחקרו רבים ודנו 44.
לפענח מתקפל של מבנים משניים ועל תיכונית
מכאני התגלגלות של RNA מנשק את שני זוגות בסיסים שהוקם על ידי שתי סיכות ראש tetraloop GACG קשורות משמשת כדוגמא כאן (11a איור). שני סיכות ראש גזע 9 בסיס זוג, אם כי רצפי הגזע שונים. דרך התגלגלות המכנית של RNA (11a איור) מאופיינת בשיטות כוח רמפת 34. כאשר הכוח עולה, המורכב מנשק נשבר ראשון, ואחריו עוקב התגלגלות של סיכות הראש. על קיפול מחדש, סיכות הראש לקפל ראשונה, ואחריו אינטראקציה מתנשקת בכוח נמוך. מעברים אלה הם גלויים על עקומת כוח הרחבה (איור11b). כדי לאשר את ההקצאה של מעברי סיכת הראש, כל אחת מסיכות הראש ניתן ללמוד באופן אינדיבידואלי. המשימה של unkissing / המעברים מתנשקים יכולה להיות מאומת על ידי לומד RNA מוטציה, שבי tetraloops הם עברו מוטציה כדי למנוע היווצרות של האינטראקציה מנשקת 28. לחלופין, הכוח הנמוך ביותר ניתן להגדיר ב10 PN, גבוה יותר מאשר כוחות הנשיקות. כצפוי, עקומת כוח ההארכה בתנאים כאלה מציג רק את התגלגלות / refolding של סיכות הראש (11c איור) 34. לכן, זה אפשרי לחקור מתקפל האינטראקציה וכל נשיקות של שתי סיכות הראש באופן עצמאי בכוחות שונים.
ניכר כי הקיפול של שתי סיכות הראש הוא הפיך, ואילו האינטראקציה מתנשקת היא בלתי הפיכה מאוד, כפי שמעיד על ידי unkissing שונה מאוד וכוחות מתנשקים, ועל ידי hysteresis הגדול. directl לכן, ניתן ללמוד קינטיקה הקיפול של סיכות הראשy באמצעות ניסויי כוח קבועים. קינטיקה של האינטראקציה מתנשקת, לעומת זאת, יש למדוד בשיטת הכוח לקפוץ. 12a איור מראה ניסוי קפיצת כוח טיפוסי 28. ב3 PN, כל RNA מקופל. הכוח לאחר מכן במהירות הועלה ל 22 PN ונשמר קבוע. לאחר מספר שניות, כל RNA הוא פרש לגדיל בודד, כפי שמשתקף מעלייה פתאומית של הארכת ~ 30 ננומטר. הכוח לאחר מכן הועלה ל30 PN למתוח RNA נוסף, לפני שמוריד את 13 PN. לאחר הקיפול של סיכות הראש, הכוח הוא ירד במהירות עד 8 PN. ההיווצרות של המתחם מנשק מצויינים על ידי קיצור של ההארכה על ידי ~ 7-8 ננומטר. על ידי איסוף רב של מדידות לכל החיים האלה, unkissing ומנשק את קינטיקה בכוחות קבועים ניתן לחשב.
תחת כל תנאי הניסוי, המורכב מתנשק תמיד פרש ראשון. בכוחות שהסיכות אינן יציבות על ידי עצמם, האינטראקציה הנשיקותהיון מגן על מבני סיכת הראש מההתגלגלות. כגון השפעת שער הגבלה מתגלה גם על ידי ניסויי כוח לקפוץ. כפי שניתן לראות באיור 12b 28, כאשר הכוח הוא קפץ ל16 PN, הרחבה של המולקולה נותרת ללא שינוי במידה רבה לכמה שניות, ואחריו להגדיל את הארכת התגלגלות על ידי ~ 20 ננומטר. השינויים בסיומת מצויינים סיכת ראש שבעה בסיס זוג חלש יותר הוא פרש מייד אחרי לשבש של המתחם מתנשק. -חלקית של סיכת הראש ניכר על ידי החיים. ברגע שהנשיקות היא שבורות, סיכת הראש במעבר במהירות בין מדינות מקפלות ל; החיים הם פחות מ 1 שניות. בעיקרו של דבר, תצפית זו היא ניסוי כוח קבוע להתגלגלות סיכת הראש. בניגוד לכך, זה לוקח מעל 10 שניות כדי לשבור את מורכבות נשיקות יחד עם סיכת הראש. בדומה לכך, הכוח הוא קפץ ל17.7 PN (12c איור), שבו כל RNA הוא פרש לגדיל בודד, כפי שמשתקפים בקמט בהארכת 30 ננומטר ~. Bistability של סיכת הראש הגדול, 11 בסיס זוג ניתן לראות את סיומת הכשות בין שני ערכים. שוב, החיים קצרים של סיכת הראש נמצאים בניגוד חד לכל החיים הארוכים שלה במדינת metastable. באמצעות שילוב של ניסויי רמפת כוח והכח לקפוץ, התרמודינאמיקה וקינטיקה של פרט התגלגלות / צעדים מתקפלים ניתן למדוד 28. תצפיות ישירה של השבירה והיווצרות של המתחם מנשק מאפשרת לנו לנתח את התרומה אנרגטית של איגוף בסיסים למתחם הנשיקות המינימלי 34 ולמדוד את תלות מלח של האינטראקציה מנשקת 45.
איור 1 מבני RNA ביחס לכח ליישם. ) סיכת ראש מתחת למתח. ב) משיכת שתי base-זוג מתנשק מורכב. שתי לולאות סיכת הראש הן בצבע אדום וצהוב.
איור 2 התקנה ניסיונית. מבנה RNA מוקף שתי ידיות DNA / RNA. באמצעות השינויים הכימיים בקצות הידיות, כל המולקולה יכולה להיות מחוברת לזוג חרוזים בגודל מיקרון חלבון מצופה. אחד מהחרוזים מוחזק על ידי מלכודת אופטית ניתנת להיגוי, למדידת כוח. האחרים מושם על micropipette, המונע על ידי שלב flexture פיזואלקטריים. הציור הוא לא בקנה מידה.
איור 3 תכנית כללית לסנתז מולקולות RNA עם ידיות. הידית, להתמודד עם B, ולאתבנית ranscription מופקות על ידי PCR מפלסמיד עם רצף הרנ"א המשובט. הידית הוא שונה על ידי digoxigenins (חפירה) בקצוות "3. ידית B יש שינוי ביוטין ב'5 סוף הגדיל אחד. RNA באורך המלא הוא עיבד מתבנית השעתוק. ידיות RNA והשינוי הנן מעורבות ומרותק. המולקולות כראוי יכולות להיות קשורות לזוג חרוזים המצופים על ידי streptavidin ונוגדן אנטי digoxigenin. הציור הוא לא בקנה מידה.
איור 4 תמונות של דיג מולקולה בודדת בין שני חרוזים שנתפסו על ידי כרטיס המסך. חרוז אחד ממוקם על קצה micropipette על ידי יניקה. האחרים מוחזק ניתבו על ידי מלכודת אופטית למדידת כוח. הכיוונים של תנועות המלכודת מסומנים על ידי חצים. המהלכים הראשונים חרוז לכודבמאונך לכיוון חרוז על micropipette. על אנשי קשר, חרוז לכוד נע מעלה. אם לקשור נוצר בין חרוזים, ההפרדה של חרוזים מושכת בעליות המולקולה וכוח כמולקולה מורחבת. אם שני חרוזים אינם צמודים על ידי כל מולקולה, התנועה לחזור בי לא מייצרת כוח.
איור 5 כוח ספקטרום של התנועה בראונית של חרוז לכוד. העקומה המוצקה היא המשוואה של לורנץ (EQ. 1), שמוצגת בכנס בכושר. קבוע הקפיץ של המלכודת ניתן לחשב מתדר הפינה (משוואה. 2).
איור 6 דוגמא למבחן החוק 'סטוקס.
איור 7 תא זרימה לtweezing. ג) שישה חורים, כל אחד בקוטר של 2 מ"מ, הם קדחו לתוך מכסה זכוכית מס '2 על ידי שימוש בחרט לייזר. ב) שלושה 2 חריצי מ"מ רחב נחתכים לקלטות polyimide דו צדדיות.) מבט קרוב באזור הניסיוני המכיל את micropipette ושני צינורות עוקפים. חרוזים מהערוצים העליונים ותחתונים לעבור דרך הצינורות שלהם בהתאמה העוקפת (הכחולה וירוק) לCEN ערוץ tral בכיוונים מסומנים על ידי חצים. ד) הר קאמרי fluidic על מסגרת מתכת על ידי חורי fluidic התאמה. ה) קאמרי שלושה ערוצים מחוברים לצינורות זרימה. הערוץ המרכזי משמש למשייכת RNA. העליון (הכחול) ובתחתית ערוצים (ירוקים) משמשים להעברת חרוזים. אזור הניסוי מצויינים על ידי ריבוע אדום.
איור 8 רמפת חיל. א) עקומת כוח הארכת מכאנית התגלגלות של סיכה. משיכת מוצגת בכחול והרפיה באדום. התגלגלות / refolding של סיכת הראש מסומן על ידי החיצים. ב) הפצות של התגלגלות (כחול) וקיפול מחדש (כוחות אדומים) של סיכת הראש. הדמות מותאמת כתב יד שהוגשה 39.
לשמור-together.within-page = "תמיד">: 
איור 9 סיכת ראש RNA תחת כוח קבוע. א) תרשים של ניסוי. המיקום של המלכודת הוא שונה באמצעות משוב כדי לשמור על כוח קבוע בסיכת הראש. ב) חיל ומיקום לעומת זמן לבלתי סיכת הראש / מתקפל. ככוח נשמר קבוע, העמדה של המלכודת נעה בין שני ערכים, מראה bistability של סיכת הראש בכח. ההתפלגות הבינומית של הפצת המלכודת מניבה שינוי הסיומת על סיכת ראש התגלגלות של 19.4 ± 0.2 ננומטר. הדמות מותאמת כתב יד שהוגשה 39.
איור 10. מצב פסיבי של סיכת ראש. ) ב) חיל וסיומת לעומת הזמן של סיכת ראש מתחת למצב פסיבי.
איור 11. רמפת חיל של RNA מנשק את שני זוגות הבסיסים. ) קיפול היררכי של RNA מנשק את שני זוגות בסיסים תחת מכאני מתח. ב) עקומת כוח הארכה. מעברים מבניים מסומנים על ידי עקומת כוח הארכה כאשר הכוח הנמוך ביותר מוגדר ב10 PN כדי למנוע האינטראקציה מנשקת את חיצים. ג). Fiתרשים מותאם באישור האגודה הכימית האמריקאי Journal of 34.
איור 12. קפיצת חיל של RNA מנשק את שני זוגות הבסיסים. א) מחזור קפיצה / ירידת כוח למדוד unkissing וחיים מתנשקים בשני כוחות שונים. הפנל העליון מראה שמץ של כוח הזמן. הפנל התחתון מציג את ההארכה היחסית של המולקולה. הכוח הוא קפץ ראשון מ3 PN ל22 PN למדוד את חייו של המתחם מתנשק ב22 PN. Unkissing מצויינים על ידי גידול מהיר ברחבה על ידי ~ 30 ננומטר, המציין את כל RNA הוא פרש לגדיל בודד. על רגיעה, כוח הוא ramped עד 14 PN כדי לאפשר שתי סיכות הראש ללקפל. הכוח אז ירד ל 8 PN. כינונה של האינטראקציה מנשקת מצויינים על ידי ירידה בהארכה ~ ננומטר 7-8 ב.)ככוח הוא קפץ ל16 PN, העקבות בזמן ההארכה מראה שזה לוקח כמה שניות עד שמורכבת הנשיקות וסיכת ראש שבעת בסיס זוג להתפתח, לאחר שסיכת הראש נפרש ומקפל מחדש במהירות. ג) מורכב הנשיקות כולו פרש לגדיל בודד כמה שניות אחרי הכוח היא קפצו ל17.7 PN. העקבות שנותרו מראה את bistability של סיכת ראש 11 בסיס זוג. כל אחד מהמעברים המבניים בהתגלגלות RNA מנשק תערוכות X. ייחודי הדמות מותאמת באישור ההליכים של האקדמיה הלאומית למדעים 28.
| מגיב | μL |
| פלסמיד (10 ננוגרם / מ"ל) | 10 |
| T7f פריימר (100 מ"מ) | 10 |
| Br פריימר (100 מ"מ) | 10 |
| תמהיל dNTP (25 מ"מ כל אחד) | 10 |
| 10xחיץ PCR | 100 |
| H 2 O | 850 |
| פולימראז תקי DNA | 10 |
| סך הכל | 1,000 |
הערה: מחזור תרמית אופייני לסינתזת דנ"א 3 KBP הוא: 95 ° C 45 שניות, 53 דקות ° C 1, C 3 72 ° דקות.
טבלת 1 דוגמא של PCR לסינתזת תבנית שעתוק.
| מגיב | μL |
| תבנית (> 200 ננוגרם / מ"ל) | 8 |
| NTPs | 8 (2 מ"ל כל אחת) |
| מאגר תגובת 10x | 2 |
| RNA פולימראז T7 | 2 |
| סך הכל | 20 |
הערה: דגירה התגובה על 37 מעלות overni Cght.
טבלה 2 בשעתוק במבחנה.
| מגיב | μL |
| ידית (~ 10 מ"ג) | 50 |
| ביוטין-11UTP | 5 |
| מאגר תגובת pol T4 | 5 |
| פתרון BSA | 1 |
| פולימראז T4 DNA | 5 |
| סך הכל | 66 |
הערה: דגירה התגובה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. להשבית את האנזים על ידי חימום ב70 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ואחריו קירור איטי לטמפרטורת חדר.
תגובת סיומת .3 פריימר שולחן.
| מגיב | μL |
| פוראמיד | 800 |
| EDTA (0.5 M, pH 8.0) | 2 |
| צינורות (1 מ ', pH 6.3) | 40 |
| NaCl (5M) | 80 |
| סך הכל | 922 |
מתכון .4 שולחן של החיץ לחשל.
| מגיב | |
| ביוטין-HA | 1,000 ng |
| Dig-HB | 1,000 ng |
| RNA | 1,000 ng |
| חיץ חישול | 80 מ"ל |
הערה: מחזור תרמית אופייני לחישול הוא: 95 ° C 10 דקות, 62 ° 1 שעה C, 52 ° C 1 שעה, ואחריו ramping עד 4 מעלות צלזיוס.
RNA לחשל לוח 5 עם ידיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שינוי ופתרון בעיות בהכנת דוגמאות tweezing
בחירה של שיבוט וקטור. על אף שהתכנית הכללית שתוארה כאן (איור 3) אינה דורש וקטור שיבוט מיוחד, הווקטור הוא העדיף שלא צריך T7 הפנימי או אמרגן T3 עבור קלות השעתוק כזה שאמרגן יכול להיות הציג באמצעות PCR בעמדות רצויים.
רצף ואורכים של הידיות. אין דרישת רצף ספציפית לידיות. עם זאת, GC קרוב ליחס AT עדיף, ואילו יש להימנע רצפי homopolymeric וחזרו מאוד. בעבודות שפורסמו, שתי ידיות נשמרות אורכים דומים כמו באופן שמבנה RNA של העניין ממוקם בערך באמצע. העבודה קודמת מראה כי האורך הכולל של הידיות שונות מ500 ל10,000 זוגות בסיסים בעדינות משפיעה על קינטיקה המדודה 46,47.
ve_content "> בדיקת איכות ולכמת את תערובת מורפה. חוץ RNA המיועד עם ידיות, המוצר הסופי מכיל גם ידיות unannealed DNA וRNAs, כמו גם לאחרים. זה קשה ולא כלכלי לטהר את מולקולות מריטות החוזרות והנשנות. במקום, annealed תערובת ניתן להשתמש ישירות לtweezing, משום שרק חומצות גרעין מרותקות כראוי יכולות להיות קשורה לשני חרוזים מצופים משטח. מוצר מרותק כראוי גם קשה להבחין בין הידיות וRNA על ג'ל אלקטרופורזה agarose. הדרך הטובה ביותר לבדוק האיכות ולכמת את הריכוז של המוצר המרותק היא לנסות אותו בפינצטה. עם זאת, כדאי לבדוק ולכמת את מוצרי שעתוק PCR ובכל שלב תוך שימוש בטכניקות ביולוגיה מולקולריות שונות.גישות אלטרנטיביות ללקשור RNA לחרוזים. ישנן שיטות רבות להעלות על הדעת לקשר מולקולות RNA למשטחי קוולנטית או שאינו קוולנטית 48
חד לעומת מרובה מולקולה לקשור. זוג-חרוזים חפירת strep- ויכול להיות מקושר על ידי מולקולות מרובות. כדי להקניט את האפשרות כזאת של מולקולות מרובות קשירת חרוז, עקומות כוח למרחקים, יש לבחון באופן הדוק. לקשור מולקולה בודדת להציג גמישות תולעת כמו שרשרת 4 שהיא בדרך כלל בלתי נראית ברצועות רבת מולקולה. ניסויי שליטה נוספים ספציפיים לכל מערכת עשויים להידרש לאישור לקשור מולקולה בודדת.
שיפורים של Minitweezers
הקלטת נתונים מהירה ואיטית. יש Minitweezers מובנה רכישת נתונים שרושמת עד 21 פרמטרים אינסטרומנטלי בשיעור של 200 הרץ במחשב, אשר כונה המחשב התפעולי בעבודה זו. עם זאת, כמה applicatiתוספות וכיולים דורשים רכישה בשיעור נתונים מהיר. לשם כך, האותות האלקטרוניים של כוח ומרחק מפוצלים שיירשמו במחשב חדש, המחשב "מהירה הקלטה", בנוסף לרכישת נתונים במחשב ההפעלה. המחשב מהיר ההקלטה קורא נתונים דרך כרטיס נפרד רכישת נתונים ותוכנה, המאפשר למספר רב של ערוצים במהירות של עד 1 MHz. רכישת המחשב ולנתונים החדשה לא תפריע לפעולת המכשיר, הנמצא בשליטה אך ורק על ידי מחשב ההפעלה. בניסוי, הנתונים נרשמים בו זמנית בשני המחשבים בשיעורים שונים. סינכרון הזמן מבוצע במהלך ניתוח נתונים על ידי השוואת קבצי הנתונים המתאימים.
הקלטת תמונת וידאו. כרטיס וידאו ותוכנת הדמיה מותקן במחשב מהיר ההקלטה כדי ללכוד תמונות חיות של התגובה ולנתח תמונות וידאו. פיתוח זה מאפשר ליישם tהוא גודל פיקסל וכיולי מרחק שתוארו לעיל.
מגבלות ויישומים עתידיים של השיטה
שיטות לתמרן בדיוק ולמדוד שינויי קונפורמציה של מולקולת RNA חד נידונו. יכולות כאלה מאפשרות לעקוב אחר התארגנות מבנית של גדיל RNA בזמן אמת. יתר על כן, כוח יכול לשמש כדי להשפיע על מסלולי מבנה RNA ומתקפל, המאפשר מבנים נדירים ו / או פחות מאופטימלי להיות מקופלים.
עם זאת, יש מגבלות של הגישה המכנית. והכי חשוב, את הסיומת, המשמש לפרש שינויי קונפורמציה, היא הקרנה חד ממדית של המבנים תלת ממדיים. יתכן שלא ניתן למדוד כמה שינויי קונפורמציה 49-52, ו / או מחסומים הקינטית מוסתרים מן התצפית 53. ישנן גם תופעות אינסטרומנטלי שונות ומגבלות שעשויותffect תרמודינמיקה וקינטיקה 44,46,47 נצפתה.
פינצטה האופטית יושמה ללמוד מספר מצומצם של מבני RNA, בהשוואה למספר רב של תמלילים שהוצעו על ידי סקרי הגנום 54. הטכניקה תשמש ללמוד מוטיבים מבניים שונים וRNAs הגדול. בנוסף, השיטה תהיה למצוא יישומים חדשים במחקר RNA. לדוגמא, RNA מחייב ליגנד וחלבונים עשויים לייצב או לשנות את מבנה RNA, שניתן למדוד באמצעות הגישה המכנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minitweezers | Steven B. Smith Engineering | http://tweezerslab.unipr.it | |
| Data acquisition card | National Instruments | USB-6351 | |
| Video card | National Instruments | PCI-1407 | |
| Labview programming software | National Instruments | ||
| NI Vision Builder | National Instruments | ||
| Laser engraver | Epilogue laser systems | Zing-16 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MEGAscript T7 kit | Life Technologies | AM1334 | |
| MEGAclear kit | Life Technologies | AM1908 | |
| Biotin-11-UTP | Thermo Fisher | FERR0081 | |
| T4 DNA polymerase | New England Labs | M0203 | |
| Streptavidin coated microsphere | Spherotech | SVP-20-5 | |
| Antidigoxigenin coated microsphere | Spherotech | DIGP-20-2 | |
| Size standard microspheres | Spherotech | PPS-6K | |
| Kapton tape | Kaptontape.com | KPPTDE-1 | |
| No. 2 cover glass | Thermo Fisher | 12-543D |
References
- Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4853-4860 (1997).
- Maier, B. Using laser tweezers to measure twitching motility in Neisseria. Current opinion in microbiology. 8, 344-349 (2005).
- Wang, S., Arellano-Santoyo, H., Combs, P. A., Shaevitz, J. W. Measuring the bending stiffness of bacterial cells using an optical trap. Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).
- Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA the elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. 271, Science. New York, N.Y. 795-799 (1996).
- Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. 271, Science. New York, N.Y. 1835-1837 (1996).
- Bryant, Z., et al. Structural transitions and elasticity from torque measurements on DNA. Nature. 424, 338-341 (2003).
- Liphardt, J., Onoa, B., Smith, S. B., Tinoco, I., J,, Bustamante, C. Reversible unfolding of single RNA molecules by mechanical force. 292, Science. New York, N.Y. 733-737 (2001).
- Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA unfolds and refolds. Annu Rev Biochem. 77 (27), 21-24 (2008).
- Woodside, M. T., Garcia-Garcia, C., Block, S. M. Folding and unfolding single RNA molecules under tension. Current opinion in chemical biology. 12, 640-646 (2008).
- Cecconi, C., Shank, E. A., Bustamante, C., Marqusee, S. Direct observation of the three-state folding of a single protein molecule. 309, Science. New York, N.Y. 2057-2060 (2005).
- Shank, E. A., Cecconi, C., Dill, J. W., Marqusee, S., Bustamante, C. The folding cooperativity of a protein is controlled by its chain topology. Nature. 465, 637-640 (2010).
- Morin, J. A., et al. Active DNA unwinding dynamics during processive DNA replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 8115-8120 (2012).
- Larson, M. H., Landick, R., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase one singular sensation every little step it takes. Molecular cell. 41, 249-262 (2011).
- Wen, J. D., et al. Following translation by single ribosomes one codon at a time. Nature. 452, 598-603 (2008).
- Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
- Pease, P. J., et al. Sequence-directed DNA translocation by purified FtsK. 307, Science. New York, N.Y. 586-590 (2005).
- Dumont, S., et al. RNA translocation and unwinding mechanism of HCV NS3 helicase and its coordination by ATP. Nature. 439, 105-108 (2006).
- Greenleaf, W. J., Woodside, M. T., Block, S. M. High-resolution, single-molecule measurements of biomolecular motion. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 36, 171-190 (2007).
- Serganov, A., Nudler, E.
- Breaker, R. R. Prospects for riboswitch discovery and analysis. Molecular cell. 43, 867-879 (2011).
- Wan, Y., et al. Genome-wide measurement of RNA folding energies. Molecular cell. 48, 169-181 (1016).
- Dalgarno, P. A., et al.
- Wood, S., Ferre-D'Amare, A. R., Rueda, D. Allosteric tertiary interactions preorganize the c-di-GMP riboswitch and accelerate ligand binding. ACS chemical biology. 7, 920-927 (2012).
- Brenner, M. D., Scanlan, M. S., Nahas, M. K., Ha, T., Silverman, S. K. Multivector fluorescence analysis of the xpt guanine riboswitch aptamer domain and the conformational role of guanine. Biochemistry. 49, 1596-1605 (2010).
- Greenleaf, W. J., Frieda, K. L., Foster, D. A., Woodside, M. T., Block, S. M. Direct observation of hierarchical folding in single riboswitch aptamers. 319, Science. New York, N.Y. 630-633 (2008).
- Frieda, K. L., Block, S. M. Direct observation of cotranscriptional folding in an adenine riboswitch. 338, Science. New York, N.Y. 397-400 (2012).
- Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39, 7677-7687 (2011).
- Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Unusual Mechanical Stability of A Minimal RNA Kissing Complex. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15847-15852 (2006).
- Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Real-time control of the energy landscape by force directs the folding of RNA molecules. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 7039-7044 (2007).
- Tinoco Jr, I., Li, P. T. X., Bustamante, C. Determination of ther modynamics and kinetics of RNA reactions by force. Q Rev Biophys. 39, 325-360 (2006).
- Onoa, B., et al. Identifying kinetic barriers to mechanical unfolding of the T thermophila ribozyme. 299, Science. New York, NY. 1892-1895 (2003).
- Li, P. T., Tinoco Jr, I. Mechanical unfolding of two DIS RNA kissing complexes from HIV-1. J Mol Biol. 386, 1343-1356 (2009).
- Smith, S., Cui, Y., Bustamante, C. Optical-trap force transducer that operates by direct measurement of light momentum. Methods Enzymol. 361, 134-162 (2003).
- Stephenson, W., et al. The essential role of stacking adenines in a two-base-pair RNA kissing complex. J Am Chem Soc. 135, 5602-5611 (2013).
- Kaiser, C. M., Goldman, D. H., Chodera, J. D., Tinoco Jr, I., Bustamante, C. The ribosome modulates nascent protein folding. 334, Science. New York, NY. 1723-1727 (2011).
- Bizarro, C. V., Alemany, A., Ritort, F. Non-specific binding of Na+ and Mg2+ to RNA determined by force spectroscopy methods. Nucleic acids research. 40, 6922-6935 (2012).
- Bosaeus, N., et al. Tension induces a base-paired overstretched DNA conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15179-15184 (2012).
- Berg-Sørensen, K., Power Flyvbjerg, H. spectrum analysis for optical tweezers. Rev Sci Instrum. 75, 594-612 (2004).
- Stephenson, W., et al. Combining temperature and force to study folding of an RNA hairpin. Phys Chem Chem Phys. 16, 906-917 (2014).
- Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys J. 72, 1541-1555 (1997).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic rates and activation free energies from single-molecule pulling experiments. Phys Rev Lett. 96, 108101 (2006).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proc. Natl Acad Sci USA. 105, 15755-15760 (2008).
- Li, P. T. X., Collin, D., Smith, S. B., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Probing the Mechanical Folding Kinetics of TAR RNA by Hopping, Force-Jump and Force-Ramp Methods. Biophys J. 90, 250-260 (2006).
- Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S.
- Li, P. T. X. Analysis of Diffuse K+ and Mg2+ Ion Binding to a Two-Base-Pair Kissing Complex by Single-Molecule Mechanical Unfolding. Biochemistry. 52, 4991-5001 (2013).
- Wen, J. D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophys J. 92, 2996-3009 (2007).
- Manosas, M., et al. Force Unfolding Kinetics of RNA using Optical Tweezers II. Modeling Experiments Biophys J. 92, 3010-3021 (2007).
- Vilfan, I. D., et al. An RNA toolbox for single-molecule force spectroscopy studies. Nucleic acids research. 35, 6625-6639 (2007).
- Li, P. T. X. Formation of a metastable intramolecular RNA kissing complex by nanomanipulation. Soft Matter. 9, 3246-3254 (2013).
- Chen, G., Chang, K. Y., Chou, M. Y., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Triplex structures in an RNA pseudoknot enhance mechanical stability and increase efficiency of -1 ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 12706-12711 (2009).
- Chen, G., Wen, J. D., Tinoco Jr, I. Single-molecule mechanical unfolding and folding of a pseudoknot in human telomerase RNA. 13, RNA. New York, N.Y. 2175-2188 (2007).
- Tinoco, I., Chen, G., Qu, X. RNA reactions one molecule at a time. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2, a003624 (2010).
- Dudko, O. K., Graham, T. G., Best, R. B. Locating the barrier for folding of single molecules under an external force. Physical review letters. , 107-208301 (2011).
- Djebali, S., et al.
