Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Realtid avbildning av Single Engineered RNA transkript hos levande celler Använda Propportionell bimolekylär Beacons

Published: August 6, 2014 doi: 10.3791/51544
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania, 2Integrated DNA Technologies, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Ratiometrisk bimolekylära fyrar (RBMBs) kan användas för att avbilda enskilda manipulerade RNA-transkript i levande celler. Här beskriver vi framställning och rening av RBMBs, leverans av RBMBs in i celler genom mikroporation och fluorescerande avbildning av enstaka RNA-transkript i realtid.

Abstract

Den växande insikten att både tidsmässiga och rumsliga reglering av genuttryck kan få betydande konsekvenser på cellfunktionen har lett till utvecklingen av olika tekniker för att visualisera enskilda RNA-transkript i enskilda levande celler. En lovande teknik som nyligen har beskrivits utnyttjar en oligonukleotid-baserad optisk sond, ratiometrisk bimolekylär beacon (RBMB), för att detektera RNA-transkript som var konstruerade för att innehålla åtminstone fyra tandemupprepningar av den RBMB målsekvens i den 3'-otranslaterade regionen. RBMBs är särskilt utformade för att avge ett klart fluorescerande signal vid hybridisering till komplementärt RNA, men annars förblir släcktes. Användningen av en syntetisk sond i detta tillvägagångssätt tillåter fotostabila, rödskiftade och starkt emissiva organiska färgämnen som skall användas för bildframställning. Bindning av flera RBMBs till de manipulerade RNA-transkript ger diskreta fluorescens fläckar när den visas med ett brett fält fluorescerande mikroskop. Följaktligen kan rörelsen hos enskilda RNA-transkripten lätt visualiseras i realtid genom att ta en tidsserie av fluorescerande bilder. Här beskriver vi framställning och rening av RBMBs, leverans i celler genom mikroporation och live-cell imaging av enstaka RNA-transkript.

Introduction

Uttrycket och regleringen av RNA-transkript är en komplex och dynamisk process som är till stor del ansvarig för att kontrollera cellens beteende och öde. Även betydelsen av RNA i diktera cellfunktionen har varit känt under en längre tid är det ofta svårt att dra tydliga kopplingar mellan de två eftersom de flesta RNA analysverktyg saknar rumslig och tidsmässig upplösning som krävs för att fånga viktiga reglerings händelser såsom transkriptions spricker, RNA människohandel, och lokal RNA bearbetning. Detta har lett till tillkomsten av flera tekniker som gör att enskilda RNA-transkript som ska visualiseras i levande celler i realtid 1. Kanske den mest framträdande av dessa tekniker använder en GFP-MS2 fusionsprotein för att rikta RNA som har konstruerats för att innehålla tandemupprepningar av MS2 bindningsställe i 3'-UTR 2,3. Genom att flera GFP molekyler i närheten, enskilda RNA-transkript visas som ljusa fluorescerande fläckarvia fluorescensmikroskopi. GFP-MS2-systemet har gett helt nya kunskaper om RNA beteende, inklusive direkt visualisering och mätningar av transkriptions spricker 4,5, upptäckt av unika under cellulär lokalisering och behandling 6-9, och i realtid avbildning av RNA transport 10. Men trots den enorma potentialen av GFP-MS2-systemet, kan obundna GFP-MS2-fusionsproteiner skapar en hög bakgrund fluorescerande signal som begränsar mångsidigheten och dynamiska området för denna teknik. Flera tillvägagångssätt har utvecklats för att begränsa denna bakgrundssignal, inklusive subcellulära uppdelning av obundna GFP-MS2 10, proteinfragmentkompletterings 11, och alternativa RNA-bindande proteiner och mål 12. Emellertid är alla dessa metoder förblir känsligt för den relativa och totala expressionen av RNA-målet och GFP-MS2-fusionsprotein.

Som ettlternative till de GFP-MS2-system, har molekylfyrar också använts för att detektera manipulerade RNA-transkript med tandemupprepningar av den komplementära bindningsställe i 3'-UTR 13,14. Molecular beacons är hårnålsbildande oligonukleotidsonder som är märkta i ena änden med en quencher och vid den andra änden med en fluorescerande reporter. När den inte skyldig att rikta RNA den fluorescerande reporter och släcknings kvar i närheten, vilket resulterar i en låg fluorescerande tillstånd. Efter hybridisering, är den fluorescerande reporter och utsläckare tvingas isär och fluorescensen är återställd. I likhet med den GFP-MS2-systemet, bindningen av multipla molekylära fyrar på ett enda RNA-transkript resulterar i en klart fluorescerande fläck som kan identifieras genom fluorescensmikroskopi; dock bakgrundsfluorescensen väntas bli mycket lägre, på grund av den kylda konfigurationen av obundna molekylära fyrar. Tyvärr, trots aktiveringsmekanismen smart som är införlivat med molecular fyr design, finns det nu alltfler tecken som ohybridiserad molekylära fyrar inte kvar i hårnålen konforma när den införs i levande celler. Följaktligen genererar de en falskt positiv signal, som väsentligt minskar signal-till-bakgrund. För att övervinna denna brist, nyligen utvecklade vi en ny syntetisk sond för avbildning RNA i levande celler, ratiometrisk bimolekylära fyrar (RBMBs; Figur 1A) 15,16. RBMBs består av två 2'-O-metyl oligonukleotidsträngar som bildar en hybridstruktur med funktioner från både korta hårnål RNA (shRNA) och molekylära fyrar. Slingan och fluorescens aktiveringsmekanismen liknar den molekylära fyr, medan den långa dubbelsträngat domän med en 3'-UU hänget är mer kännetecknande för shRNA. De shRNA funktioner är utformade för att driva kärn export, som vi har funnit ökar intracellulär livstid att> 24 timmar, med minimal observerbar nedbrytning ochförhindrar ospecifik öppning av slingan. Som ett resultat RBMBs uppvisar en signifikant högre signal-till-bakgrund än molekylära fyrar.

Det bör noteras att RBMBs inte kan framställas med användning av DNA-oligonukleotider, eftersom DNA-baserade prober besitter inte samma nukleära exportkapacitet som RNA-baserade prober. Strukturellt är RBMB slingan normalt konstruerade för att vara mellan 15 och 21 baser långa, för att skapa en balans mellan specificitet och selektivitet vid RNA hybridisering. Den kort rör som bildas av de två själv komplementära domäner brukar utformad för att vara fyra baser. Om ett längre skaft väljs hybridiseringshastigheten mellan RBMB slingan och mål-RNA markant avtagit 17,18. Omvänt smälttemperaturen är ofta när en kortare stam sekvens väljs alltför låg för att upprätthålla den stam-slingstruktur vid 37 ° C, vilket leder till en hög bakgrundssignal. Specificiteten av RBMB är också röduced som skaftlängden förkortas. Eftersom sekvensen av den RBMB stam-ögla kan också påverka RBMB prestanda måste den noggrant utvalda 19. I synnerhet bör ideala slingsekvenser har minimal sekundärstruktur, hybridisera till RNA-sekvenser med minimal sekundärstruktur, undvik proteinbindningsställen, och undvika off-target bindande. Förutsägelser av både RBMB och RNA-sekundärstruktur kan erhållas med användning av programvara såsom mfold 20. Kompletterande ej åsyftade platser kan identifieras med hjälp av en nukleotid Basic Local Uppdrag Sökverktyg (BLAST). Men på grund av inkonsekvenser i modellprognoser och svårigheten att identifiera protein bidar platser, specificitet alla RBMBs måste slutligen valideras experimentellt.

Om önskvärt, kan ett odämpat referens färgämne som är okänslig för hybridiseringen tillstånd sättas till RBMB 15. Tillägget av en referensfärg kan prOvide en markör för sond leverans och användas för ratiometrisk avbildning, om mer exakta mätningar av total cellulär fluorescens krävs. Referens färgämnen gör mätningar justeras för skillnader i bakgrunden på grund av cell till cell variationer i leveransen. Men när avbildning individuell RNA-transkriptioner referens färgämnet är inte nödvändigt. Noterbart kan några referens färgämnen störa exporten av RBMBs från kärnan, vilket leder till en något högre bakgrundssignal i kärnan.

När utformade på rätt sätt, kan RBMBs användas för att avbilda enskilda RNA-transkript i enskilda levande celler, om mål-RNA är konstruerad för att innehålla minst fyra RBMB bindningsställen (Figur 1B) 16. RBMBs effektivt kan levereras i en rad olika celltyper via mikroporation, med liten eller ingen effekt på cellviabilitet 21, och kvantitativa mätningar av genuttryck kan varaförvärvats inom 30 min. Dessutom är metoden relativt okänslig för RBMB koncentration och mål-RNA-nivåer, eftersom fluorescens från obundna RBMBs effektivt släckes. Här ger vi en detaljerad beskrivning av den metod som används för att förbereda och rena RBMBs, samt ett allmänt förfarande för leverans av RBMBs in i levande-celler via mikroporation och avbildning av enstaka RNA-transkript i realtid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I detta protokoll var en oligonukleotid (RBMB1) märkt vid dess 5'-ände med en CF640R rapportörfärgämnet och har sekvensen: 5'mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC mumu-3 '. Själv komplementära domäner, vilka driver bildningen av hårnålstrukturen, är i fet stil. Den andra oligonukleotiden (RBMB2) märktes vid 3'-änden med en Iowa Svart RQ-Sp utsläckare och har sekvensen: 5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3 '.

1. Framställning av RBMBs

  1. Utför en snabb dragning av de rör som innehåller de RBMB1 och RBMB2 oligonukleotider, för att säkerställa den torkade oligonukleotiden är i botten av röret och återsuspendera i DNas och RNas-fritt vatten till en slutkoncentration av 100 pM. Till exempel bör en 10 nmol prov av oligonukleotid återsuspenderas i 100 pl vatten.
  2. Measure den exakta koncentrationen av RBMB1 och RBMB2 lagerprover från UV-vis-spektroskopi.
    1. Blanda 3 ul av RBMB provet med 117 | il DPBS (utan kalcium och magnesium) i ett mikrocentrifugrör.
    2. Blank spektrofotometern med DPBS och mät absorbansen 200-800 nm. Obs: Peak absorbanser vid 260 nm och 650 nm bör synas.
    3. Beräkna förrådskoncentration av RBMB prover baserat på absorbansen vid 260 nm (eller 650 nm för RBMB1), med användning av ekvationen:
      Aktie Koncentration (M) = A 260 * utspädningsfaktor / extinktionskoefficient där A 260 är absorbansen vid 260 nm och utspädningsfaktorn är 40.
      Anm: Extinktionskoefficienten för RBMB kan hittas på specifikationsblad tillhandahålls av oligonukleotiden tillverkaren. Extinktionskoefficienten för CF640R vid 650 nm är 103.000.
  3. Blanda 20 pl 100 M RBMB1, 30 ^ 100 ^ M RBMB2, 6 pl 10x; Fosfatbuffert (10x fosfatbuffert: 480 mM K 2 HPO 4, 45 mM KH 2 PO 4, 140 mM NaH 2 PO 4, pH 7,2) och 4 pl DNas och RNas-fritt vatten. Inkubera blandningen vid rumstemperatur under 30 min. Obs: Detta är vanligtvis tillräckligt för cirka 50 studier.
  4. Förbered en flytande kolonnkromatografi med 75 prep grade Superdex att avlägsna eventuella ohybridiserade RBMB2 oligonukleotider. Använd en 8 ml (0,7 x 20 cm) kolonn-vätskekromatografi med en ~ 4 ml bäddvolym för att rena den lilla volymen av blandade prober.
  5. Tvätta och jämvikta Superdex med ~ 50 ml 1x fosfatbuffert med användning av en sprutpump som körs vid ett flöde vid en flödeshastighet av 0,6 ml / min. Innan all fluid kommer in i bäddvolym, stoppa sprutpumpen, lösgöra det, och låta den återstående vätskan gå genom kolonnen genom gravitation.
  6. Fyll på RBMB blandningen (60 | il) på kolonnkromatografi.
    1. Efter RBMB provet har heltinlagt sängen, långsamt lägga till ytterligare 250 ^ il 1x fosfatbuffert till toppen av bädden för att säkerställa att hela provet har fullständigt gått in i kolonnen.
    2. Fyll kolonnen till kanten med 1x fosfatbuffert. Stäng den övre, och börja sprutpumpen - sprutan bör fyllas med ~ 50 ml 1 x PBS och kördes vid en flödeshastighet av 0,6 ml / min.
    3. När RBMB nears botten av kolonnen - den RBMB provet kan typiskt lätt visualiseras på grund av färgen på färgämnet införlivas i sonden - samla genomströmning på 2 droppar per mikrocentrifugrör (1,5 ml). Sluta samla provet när färgen inom mikrocentrifugrör blir klar.
  7. Kombinera rören innehållande den färgade RBMB provet - typiskt 5-6 tuber - och ladda in en centrifugal filteranordning (10.000 MW cutoff). Centrifugera provet vid 10.000 RCF i 20 min eller tills önskad volym. Obs: Dessa hastigheter och tider kommer normalterhållande av en slutvolym av ~ 30 | il.
  8. Mät den exakta koncentrationen av den renade RBMB prov genom UV-Vis-spektroskopi.
    1. Ta 3 il av det koncentrerade RBMB prov och blanda med 117 il DPBS i ett mikrocentrifugrör.
    2. Blank spektrofotometern med DPBS och mät absorbansen 200-800 nm. Obs: Peak absorbanser vid 260 nm och 650 nm bör synas.
    3. Beräkna förrådskoncentration av den hybridiserade RBMB baserat på absorbansen vid 650 nm med användning av ekvationen:
      Aktie Koncentration (M) = A 650 * utspädningsfaktor / utdöda koefficient där A 650 är absorbansen vid 650 nm, är Utspädningsfaktor 40.
      Obs: Extinktionskoefficienten för CF640R vid 650 nm är 103.000 och extinktionskoefficienten för Iowa Black RQ är ~ 20.000. Extinktionskoefficienterna är additiva och är inte känsliga för hybridisering. Därför har de stock RBMB provet en kombinerad extinktionskoefficienten för approximately 123.000 vid 650 nm.
  9. Märk röret på lämpligt sätt med namn och koncentration och förvara vid -20 ° C för framtida användning.

2. Framställning av poly-D-lysin Coated 8-brunnars Chambered coverglass

  1. Bered en 0,2 mg / ml lösning av poly-D-lysin genom att lösa 5 mg poly-D-lysin (lyofiliserat pulver, g-bestrålade) i 25 ml steriliserat vatten i en steril miljö.
  2. Lägg 200 pl av 0,2 mg / ml poly-D-lysin-lösning till varje brunn i en 8-brunnars chambered coverglass, i en steril miljö.
  3. Inkubera vid rumstemperatur under 16 till 18 tim i cellodlings huven.
  4. Aspirera Poly-D-lysin och tvätta brunnen 3 gånger med sterilt destillerat vatten. Anm: De belagda kammare diabilder kan lagras vid 4 ° C.

3. Probe Leverans

Obs: cellsystem som används bör innehålla ett integrerat genkonstruktion som uttrycker RNA med åtminstone 4-sekventiell bindering ställen för RBMB i 3'-otranslaterade regionen (UTR). Målsekvensema bör komplettera slingan av RBMB. Det rekommenderas att som en negativ kontroll, vara samma cellinje för att uttrycka samma gen konstruktion, men utan tandemupprepningar. I detta protokoll, en human fibrosarkom cellinje, HT1080, var konstruerad för att uttrycka GFP-RNA med 96-tandemupprepningar av RBMB målsekvens i 3'-UTR. Styr cellinjen var konstruerad för att uttrycka GFP av vildtyp-RNA.

  1. Plate celler i en T25 kolv vid 40-50% konfluens en dag innan sond leverans. Kultur cellerna med DMEM-medium som kompletterats med 1% pen / strep och 10% fetalt bovint serum (FBS), och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2.
  2. Nästa dag, slå på mikroporator och ställa in Mikroporationsanordningen parametrarna till 950 V, 2 pulser, 25 msek. Obs: Dessa parametrar har optimerats för HT1080 celler, men de är celltyp beroende och kan justerted för andra celltyper, såsom beskrivs i tillverkarens instruktioner.
  3. Fyll mikroporation rör med 4 ml elektrolytisk buffert och placera den på mikroporation stationen.
  4. Ta ut beståndet prov av renat RBMB och frosta det. Späd flera mikroliter till en slutlig koncentration av 12 | iM med 1x fosfatbuffert. 1 l behövs för varje mikroporation.
  5. Pipettera 1 ml odlingsmedium med FBS men utan antibiotika till ett mikrocentrifugrör. OBS: Detta kommer att användas för att suspendera cellerna omedelbart efter mikroporation och kan avsättas, nära mikroporationsanordningen, för tillfället. Införandet av antibiotika i odlingsmedia minskar cellviabiliteten efter mikroporation.
  6. Avlägsna cellodlingsmedia från de manipulerade HT1080-celler (60-80% konfluenta), tvätta cellerna med 1 ml Ca2 + och Mg2 + -fria DPBS en gång, och inkubera med 1 ml trypsin under 1-2 min.
  7. Stoppa trypsinization genom att tillsätta 1 ml DMEM medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum, utan antibiotika och fenolrött, och överföra celler i två 1,5 ml mikrorör.
  8. Centrifugera ner cellerna i mikrocentrifugrör vid 200 xg under 5 min. Avlägsna supernatanten, återsuspendera och kombinera de cellpelletar i en slutlig volym av 1 ml DPBS.
  9. Ta 10 | j, l från den välblandade cellsuspensionen och räkna cellerna.
  10. Pipet cellerna upp och ner flera gånger för att se till att de är väl spridda och överföra 300.000 celler med DPBS till en ny 1,5 ml mikrocentrifugrör och spinn ner vid 200 xg under 5 minuter.
  11. Avlägsna supernatanten, försiktigt så att inte störa cellpelleten. Resuspendera pelleten i 11 pl resuspensionsbuffert och pipett upp och ned flera gånger för att säkerställa att cellerna är väl dispergerade. Glöm inte att generera några luftbubblor. Observera: Luftbubblor kommer att orsaka en gnista under mikroporation och resultera i dålig RBMB leverans och celldöd.
  12. Lägg ett pl av det utspädda RBMB (12 pM) och blanda väl genom att pipettera upp och ned flera gånger. Återigen var noga med att inte generera några luftbubblor.
  13. Aspirera 10 pl av RBMB-cellblandningen, med hjälp av mikroporation pipett och sätt pipetten i mikroporation röret. Tryck på startknappen för att starta mikroporation. Obs: Det bör inte finnas några synliga luftbubblor i spetsen.
  14. När skärmen för mikroporator visar fullbordan, ut pipetten ur stationen, utvisa 10 il blandningen i mikrocentrifugrör som var beredd tidigare, med 1 ml odlingsmedium med FBS men utan antibiotika. Blanda försiktigt genom att gunga röret sida till sida flera gånger.
  15. Snurra cellerna vid 200 xg under 5 min och tvätta cellerna två gånger, i en ml fenolrött-fritt odlingsmedium med FBS men utan antibiotika, för att avlägsna eventuella RBMBs som inte har levererats in i cellerna. Återsuspendera med 400 | il fenol rött fritt odlingsmedium med FBS men utanantibiotika.
  16. Plansch de microporated celler i poly-D-lysin belagda 8-brunnars chambered coverglass vid 200 ul per brunn eller på önskad konfluens.
  17. Valfritt: Om det är önskvärt att bilden kärnan, lägg Hoescht 33.342 till cellerna vid en slutlig koncentration av 0,01 mg / ml.
  18. Placera chambered coverglass i en cellodling inkubator. Inkubera cellerna under 1-2 timmar före avbildning, så att cellerna få tillräcklig tid att slå sig ner på coverglass ytan. Obs: Imaging kan utföras så snart som 30 minuter efter mikroporation.

4. Image Acquisition

  1. Slå på levande cellstadiet topp inkubationssystemet och jämvikta den tills den når 37 ° C, 5% CO2 och 75% fuktighet.
  2. Slå på mikroskop och fluorescerande ljuskälla och öppna Metamorph programvaran. Obs: Andra liknande programvaror för mikroskopkontroll och bildtagning kan också användas.
  3. Applicera Immersol olja tillmål.
  4. Överför chambered coverglass med microporated celler till levande cellstadiet topp inkubationssystemet. Inkubera scenen topp system tills temperaturen och CO2-nivåer stabiliserats.
  5. Öppna fliken Hämta, i metamorfa programvara. Klicka på Show Live knappen för att hitta det område, justera fokus under vitt ljus och klicka på knappen Stoppa Live.
  6. Under fliken Hämta, klicka och öppna strömmen förvärvs popup-knappen och ställa in de önskade film ackvisitionsparametrar. Förvärva 150 ramar med Cy5 / CF640R filter och spara bilderna på hårddisken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Strax efter mikroporation av HT1080 celler i närvaro av RBMBs, enskilda RNA-transkript som manipulerade innehålla flera RBMB bindningsställen i sin 3'-UTR visas som ljusa fluorescerande fläckar när avbildas av brett fält fluorescensmikroskopi (Figur 2). Medan enskilda RNA-transkript med så få som fyra RBMB bindningsställen kan avbildas i levande-celler, desto mer RBMB bindningsställen i 3'-UTR, desto starkare fluorescerande signal. Dessutom, ju fler RBMBs som är bundna till varje transkript på längre RNA kan visualiseras innan signalen går förlorad på grund av fotoblekning. I detta protokoll var RNA konstruerad för att innehålla 96-tandemupprepningar av den RBMB målsekvensen i 3'-UTR. Förvärvet av strömmande bilder kan enskilda RNA-transkript som ska avbildas i realtid (film 1). Individuella RNA-transkript kan lätt ses röra sig i cytoplasman och kärnan of cellerna. Medan de flesta av de fläckar genomgå Brownsk eller under diffusa rörelser, i sällsynta fall en RNA genomgår riktad transporter kommer att observeras (film 2). Avhandlingar RNA-transkript röra vanligtvis snabbt längs en ​​rak bana (figur 3); Men vissa RNA följa krökta banor eller göra plötsliga riktningsförändringar. Dessa rörelser är i skarp kontrast till Brownsk rörelse, som är slumpmässigt i naturen och uppvisar små bygg förskjutningar inom de korta tidsfrister som förvärvats här (dvs <1 min). De riktade RNA rörelser överensstämmer med transport av RNA längs mikrotubuli och mikrofilament. Dessa experiment visar att RBMBs ger en mångsidig och robust verktyg för att avbilda enskilda RNA-transkript i levande celler.

Figur 1
Figur1 Schematisk bild av RBMBs och den metod som används bild enskilda RNA-transkript i levande celler. A) RBMBs i närvaro och frånvaro av komplementära mål-RNA. I avsaknad eller mål-RNA är RBMB fluorescens släckes. I närvaro av mål-RNA är RBMB fluorescens återställd. B) Flera RBMBs binder varje RNA-transkript skapar en ljus fluorescerande fläck som kan detekteras med brett fält fluorescensmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2 Representant bild av HT1080 celler som stabilt uttrycker RNA med A) 96-tandemupprepningar eller B) 4-tandemupprepningar av RBMB bindningsstället i3'-UTR, efter intracellulär leverans av RBMBs. Närvaron av 96-tandemupprepningar kan enskilda RNA-transkript för att synas som ljusa fluorescerande fläckar. RNA som endast innehåller 4-tandemupprepningar kan också visualiseras, men intensiteten av de fluorescerande fläckarna är mycket mörk och ofta endast detekteras i områden med exceptionellt låg bakgrund. Det lilla antal särskilt ljuspunkter motsvarar RNA som inte rör sig. Skala bar:. 10 mikrometer klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3 Montage av en RNA-transkript som genomgår riktad transporter. Banan för transkriptet visas i den vänstra panelen. Banan överdras över en enda fRame av tidsserierna. Skala bar:. 2,5 pm klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Film 1 Representant filmen HT1080 celler som stabilt uttrycker RNA med 96-tandemupprepningar av RBMB bindningsställe i 3'-UTR, efter den intracellulära leverans av RBMBs. Individuella RNA-transkript visas som ljusa fluorescerande fläckar. Skala bar:. 10 mikrometer Klicka här för att se video.

Film 2 Representant film av en RNA-transkript som genomgår riktad transporter. Skala bar:. 10 mikrometer Klicka här för att se video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Förmågan att bildenkel manipulerade RNA-transkript i levande celler med användning av en konventionell brett fält mikroskop kräver en ljus och fotostabil fluorescerande signal som skall associeras med varje RNA-transkript och en låg fluorescerande bakgrund som härrör från obundna fluorescerande prober. I denna metod, är en ljus fluorescerande signal uppnås genom hybridisering av multipla (upp till 96) oligo-baserade fluorescerande prober, dvs RBMBs, på varje RNA-transkript. Emellertid så få som fyra bindningar platser är tillräcklig 16. De kollektiva signaler resulterar i en ljus fluorescerande fläck som kan spåras i realtid. Närvaron av multipla prober möjliggör också för längre bildhanteringstider, eftersom en väsentlig fraktion av de fluorescerande färgämnena måste photobleached innan den kollektiva signalen går förlorad. Det är tänkt att denna teknik kommer att ge en unik inblick i RNA biologi och göra det möjligt att studera ett brett spektrum av RNA beteenden som sträcker sig från mätning the respons av RNA människohandel för olika yttre stimuli, observera unika subcellulära lokaliseringsmönster mål-RNA, som studerar öde och livslängd RNA, och ger insikt i RNA reglering. Dessutom kan det vara möjligt att spåra ändringar (dvs upp-och nedreglering) i RNA uttryck. Även om denna möjlighet har ännu inte validerats, har vi tidigare visat att RNA antal kopior kan ganska exakt kvantifieras i upp till 24 timmar i levande celler 22. Dessutom behöver RBMBs förefaller inte påverka nivån av genuttryck. Tillsammans är dessa resultat ger inledande bevis att förändringar i genuttryck under denna tidsperiod var exakt spåras, på cell-till-cellbasis, och att RBMBs inte ledde till en ökning av RNA-stabilitet eller saktade RNA nedbrytning. Det är dock oklart i vilken utsträckning genuttryck verkligen förändrats under denna tid, om alls.

I allmänhet är detförväntas att varje ökning av genuttryck skulle lätt identifieras; på grund av överflödet av obunden RBMB i cellen som är fri att binda nybildade transkripten. Men vad som är mindre klart är hur RBMBs avstånd från RNA under översättning och nedbrytning och om det finns en viss eftersläpning mellan RNA uttryck / nedbrytning och avbildning av dessa transkript. Ytterligare studier behövs fortfarande för att bättre förstå RBMB prestanda i dessa scenarier.

Flera alternativa metoder till undersökningen enstaka RNA-transkript har tidigare rapporterats. De tidigaste studierna involverade fluorescerande märkning isolerade RNA-transkript och återinförsel av dessa transkript i celler, vanligen genom mikroinjektion 23,24. Signalen till bakgrund av detta synsätt är mycket hög, på grund av möjligheten att ta bort eventuella obundna fluorescerande färger, men det finns oro över huruvida den observerade RNA beteende exakt representerar true RNA-bearbetning. Den vanligaste lösningen på denna brist har involverat ingenjörstransgener med tandemupprepningar i 3'-UTR som kan vara bundna av ett fluorescerande reporter, analoga med det tillvägagångssätt RBMB presenteras här. Tidigare fluorescerande reportrar har inkluderat små molekyler som bara fluorescerar vid bindning RNA aptamers, som vanligtvis kallas spenat 25, och GFP. Spenat har ännu inte använts för att avbilda enskilda RNA-transkript, men har använts för att bilden global uttryck. Däremot har GFP använts för att framgångsrikt bild enstaka RNA-transkript. I detta tillvägagångssätt är en GFP reporter fuserad till höljeproteinet av bakteriellt fag MS2 (GFP-MS2) och binder till en konstruerad RNA-konstruktion med tandemupprepningar av MS2-bindningsställe i 3'-UTR 2,10. Även om detta tillvägagångssätt är mycket lik den metod som beskrivs här, RBMBs erbjuder flera fördelar. Exempelvis RBMBs tillåta organiska fluoroforer som skall användas för bildframställning, vilket ger en bredare diversity val med överlägsen fotostabilitet och överlägsen ljusstyrka jämfört med fluorescerande proteiner. Vidare finns många kommersiellt tillgängliga organiska fluoroforer som emitterar i den bortre till nära infrarött. Fördelen med att välja färger med röda-skiftat emissionsspektra härrör från den nedre cell autofluorescens observerades vid dessa våglängder. Eftersom höga halter av autofluorescens lätt kan överrösta alla fluorescerande signaler i samband med RNA hybridisering, ger möjlighet att dramatiskt minska autofluorescens en viktig skjuts i signal-bakgrund. En annan viktig fördel med att använda RBMBs är att signalen från obundna prober är signifikant utsläckt. Även har olika metoder tagits för att reducera bakgrundsfluorescens obundet GFP i GFP-MS2 tillvägagångssätt, till exempel användning av kärnlokaliseringssignaler, kontrollerar GFP uttryck nivåer, och delad GFP komplemente 1,10,11,26,27, den närvaron av en verklig härdning Moiety inom RBMB designen ger användarna mycket större experimentell flexibilitet. Till exempel är det RBMB tillvägagångssätt relativt okänslig för både den relativa och totala nivån av RNA-expression och probkoncentration. I själva verket kan enskilda avskrifter avbildas med RBMB koncentrationer som spänner en storleksordning. De kombinerade fördelarna med högre fotostabilitet, ljusare signal och lägre bakgrund gör realtid RNA imaging experiment med RBMBs mer lättillgängligt för mikroskopi användare med begränsad kompetens.

Kanske det mest anmärkningsvärda nackdelen med att använda exogena prober såsom RBMBs, i motsats till ett molekylärt reporter såsom GFP, är behovet av intracellulär leverans. Lyckligtvis finns ett antal alternativ, till exempel, mikroinjektion 28 transfektionsmedel 29, cellpenetrerande peptider 30 och streptolysin O (SLO) 31. Personligen har vi funnit att mikroporation ärden mest användarvänliga och mångsidiga alternativ, oftast resulterar i> 95% livskraft och leveranseffektivitet 21. Detta är sannolikt på grund av att mikroliter volym elektroprocessen uppvisar en minskning av de många skadliga händelser som ofta förknippas med elektroporering, inklusive värme, metalljon upplösning, pH variation och oxidbildning. Viktigt är mikroporation också mottaglig för hög genomströmning studier, eftersom RBMBs kan levereras till> 100.000 celler i ett enda experiment.

Trots de många fördelarna med att använda RBMBs till bild RNA lokalisering och rörelse i levande celler, ett antal begränsningar och utmaningar kvarstår fortfarande. Kanske är den största utmaningen oförmågan att spåra RNA i mer än några minuter under kontinuerlig exponering. Detta är en följd av både fotoblekning och förmåga RNA att flytta ut ur brännbildplanet. Ljusare och mer fotostabila färgämnen kan hjälpa alleviate båda dessa brister, genom att öka antalet gånger varje färgämne kan vara glada och låta de diskreta fluorescerande fläckarna som ska avbildas på längre avstånd från fokalplanet. En lovande metod för att öka fotostabilitet innebär användning av självläkande färgämnen, som använder triplett-tillstånd släckare i närheten av den organiska fluoroforen att förlänga deras livslängd 32. Ett annat alternativ kan vara att använda fluorescenta förstärknings konjugerade polymerer, som är sammansatta av ett stort antal anslutna fluoroforer som inte gör det själv-utsläckning. Dessa polymerer kan vara flera gånger starkare än enstaka organiska fluoroforer och ändå effektivt stoppades genom en enda härd del 33,34; Men fortfarande krävs ytterligare arbete på detta område. Det bör noteras att intermittent avbildning, med en bildhastighet> 1 bild per sekund, kan inte genomföras på bilden en enda RNA-transkript under långa tidsperioder, eftersom det är svårt att se till att det är than samma RNA-transkript som spåras från ram till ram. Naturligtvis är kvantitativ utvärdering av genuttryck på enskild cellnivå fortfarande möjligt över långa tidsramar, genom räkning av enskilda fluorescerande fläckar på en per cell basis 16,35,36. I detta fall är det inte nödvändigt att hålla reda på enskilda transkript. Sammanfattningsvis förmodas det att RBMBs kan tillhandahålla viktiga insikter om RNA funktion och gör det möjligt för avbildning av enstaka manipulerade RNA-transkript med konventionell mikroskopi utrustning och begränsad kompetens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr Mark Behlke och Dr Ling Huang är anställda av IDT som erbjuder oligonukleotider till salu liknar vissa av de föreningar som beskrivs i manuskriptet. IDT är dock inte ett publikt bolag och de personligen inte äger några aktier / eget kapital i IDT.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Science Foundation KARRIÄR Award (0953583) och National Institute of Health NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nuclease-free water Life Technologies AM9932 no DEPC-treated
DPBS Life Technologies 14190-144 No Ca2+ and Mg2+
Cary 100 UV-Vis spectrophotometer Agilent Technologies
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific P284-500
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific S381-500
Microcentrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 ml
Chromatography column Kimble Chase Life Science 420400-0720 0.7 x 20 cm
Superdex 75 prep grade GE healthcare 17-1044-01
Syringe pump Braintree Scientific BS-300
Syringe BD 301035 60 ml, Luer-lok tip
Centrifugal filter units Millipore UFC501096 MW 10,000 cutoff
Centrifuge 5418 Eppendorf
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P7280-5MG lyophilized powder, g-irradiated
8-well chambered coverglass Fisher Scientific 155409 Working volume 0.2-0.5 ml
HT1080 ATCC CCL-121 Human Fibrosarcoma cell line
Cell culture flask Corning 430639 25 cm2
DMEM Life Technologies 11965084 High glucose
DMEM without phenol red Life Technologies 21063029 High glucose
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F2442-500ML
Penecillin/streptomycin Life Technologies 15140122
Trypsin Life Technologies 25300054 0.05% Trypsin-EDTA
Neon transfection system Life Technologies MPK5000
Neon transfection system kit Life Technologies MPK1096
Hemacytometer Fisher Scientific 02-671-10
Hoescht 33342 Life Technologies H1399
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus
SOLA light engine Lumencor
Metamorph Molecular Devices Software controlling microscope
Immersol oil 518F Fisher Scientific 12-624-66B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
  2. Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  3. Dictenberg, J. Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics. Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).
  4. Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Transcriptional pulsing of a developmental gene. Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).
  5. Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).
  6. Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).
  7. Forrest, K. M., Gavis, E. R. Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila. Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).
  8. Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport. Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).
  9. Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell. Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).
  10. Fusco, D., et al. Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).
  11. Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).
  12. Daigle, N., Ellenberg, J. LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging. Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).
  13. Bogaard, P. T., Tyagi, S. Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus. Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).
  14. Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Mechanism of mRNA transport in the nucleus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (47), 17008-17013 (2005).
  15. Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells. Nucleic Acids Res. 38 (14), e148 (2010).
  16. Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. , (2013).
  17. Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons. Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).
  18. Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).
  19. Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).
  20. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  21. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Res. 36 (12), e69 (2008).
  22. Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. 41 (15), e152 (2013).
  23. Ainger, K., et al. Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes. J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).
  24. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).
  25. Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
  26. Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).
  27. Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation. Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).
  28. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Res. 35 (16), e105 (2007).
  29. Chen, A. K., Tsourkas, A. Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315 (2009).
  30. Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e58 (2004).
  31. Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e57 (2004).
  32. Altman, R. B., et al. Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability. Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).
  33. Kumaraswamy, S., et al. Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).
  34. Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).
  35. Lu, J., Tsourkas, A. Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ. Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).
  36. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).

Tags

Genetik RNA imaging enda molekyl fluorescens levande cell
Realtid avbildning av Single Engineered RNA transkript hos levande celler Använda Propportionell bimolekylär Beacons
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Song, Y., Zhang, X., Huang, L.,… More

Song, Y., Zhang, X., Huang, L., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons. J. Vis. Exp. (90), e51544, doi:10.3791/51544 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter