Een muismodel voor pathogenen geïnduceerde Chronische ontsteking op lokale en systemische sites

Summary

Diermodellen hebben bewezen waardevolle instrumenten definiëren gastheer en pathogeen specifieke mechanismen die bijdragen aan de ontwikkeling van chronische ontsteking. Hier beschrijven we een muismodel van orale infectie met het humaan pathogeen Porphyromonas gingivalis en detail methoden om de progressie van inflammatie lokale en systemische plaatsen.

Abstract

Een chronische ontsteking is een belangrijke motor van pathologische weefselschade en een verenigende kenmerk van veel chronische ziekten bij de mens, waaronder neoplastische, auto-immuun en chronische inflammatoire ziekten. Recente inzichten impliceert pathogenen geïnduceerde chronische ontsteking in de ontwikkeling en progressie van chronische ziekten met vele klinische uitingen. Vanwege de complexe en multifactoriële etiologie van chronische ziekten, het ontwerpen van experimenten voor het bewijs van causaliteit en de oprichting van mechanistische schakels is bijna onmogelijk bij mensen. Een voordeel van het gebruik van dierlijke modellen is dat zowel genetische en omgevingsfactoren die de loop van een bepaalde ziekte kan beïnvloeden kan worden gecontroleerd. Aldus ontwerpen relevante diermodellen van infectie is een belangrijke stap bij het vaststellen gastheer en pathogeen specifieke mechanismen die bijdragen tot chronische ontsteking.

Hier beschrijven we een muismodel van pathogenen geïnduceerde chronische inflammation op lokale en systemische plaatsen na infectie met de orale pathogenen Porphyromonas gingivalis, een bacterie nauw verbonden met de menselijke parodontitis. Orale infectie van specifieke pathogenen vrije muizen veroorzaakt een plaatselijke ontstekingsreactie leidt tot vernietiging van tand ondersteunende alveolaire bot, een kenmerk van parodontitis. In een gevestigd muismodel van atherosclerose, infectie met P. gingivalis versnelt inflammatoire plaque afzetting in de aortische sinus en innominate slagader, vergezeld door activering van het vasculaire endotheel, een verhoogde immune cel infiltraat en verhoogde expressie van inflammatoire mediatoren in laesies. We detail methoden voor de beoordeling van de ontsteking op lokale en systemische sites. Het gebruik van transgene muizen en gedefinieerde bacteriemutanten maakt dit model bijzonder geschikt voor het identificeren van zowel de gastheer en microbiële factoren betrokken bij de initiatie, progressie en uitkomst van de ziekte. Additionally, kan het model worden gebruikt om te screenen voor nieuwe therapeutische strategieën, zoals vaccinatie en farmacologische interventie.

Introduction

Een chronische ontsteking is een belangrijke motor van pathologische weefselschade en een verenigende kenmerk van veel chronische ziekten bij de mens. Deze ziekten omvatten neoplastische, autoimmune en chronische ontstekingsziekten ^1. De etiologie van veel chronische ziekten nog onduidelijk maar begrepen complex en multifactorieel, waarbij zowel erfelijke aanleg en de invoering van milieufactoren. Terwijl de perpetuators van ontsteking blijven ongrijpbaar, de cellulaire en moleculaire profielen van immuunactivering overlappen sterk met die patronen waargenomen in gastheer reacties op ziekteverwekkers ^2.

Montage bewijs impliceert infectie met microbiële pathogenen in de ontwikkeling en progressie van chronische ontsteking en zijn diverse klinische manifestaties ^2,3. Ziekteverwekkers kunnen veroorzaken en in stand houden van chronische ontstekingen die rechtstreeks door het ondermijnen van de gastheer immuunsysteem en zij hardnekkige infecties 3. Zo is een gedetailleerd inzicht in de mechanismen die specifieke pathogenen veroorzaken chronische ontsteking kan grote gevolgen hebben voor de volksgezondheid, maar ook de behandeling en preventie van veel chronische ziekten hebben.

Hoewel de gastheer en pathogeen specifieke mechanismen bijdragen tot de inductie en instandhouding van chronische ontstekingslecht begrepen, vooruitgang in de modellering van pathogenen geïnduceerde chronische ontsteking zijn begonnen aan ons begrip van deze processen te bevorderen. De P. gingivalis orale infectie model is een uniek, goed gekarakteriseerde muismodel van pathogenen geïnduceerde chronische ontsteking die de analyse van de gastheer en pathogeen specifieke mechanismen die bijdragen tot chronische ontsteking op lokaal (orale botverlies) en systemische plaatsen (atherosclerose) ^5,6 toelaat.

P. gingivalis is een Gram-negatieve anaërobe orale pathogenen betrokken bij menselijke periodontale ziekte, een infectie aangedreven chronische ontstekingsziekte gekenmerkt door de vernietiging van tand steunweefsel ^7. Naast pathologie aan de oorspronkelijke plaats van infectie, de opslag indicaties dat P. gingivalis geïnduceerde chronische ontsteking in de ontwikkeling en progressie van systemische ziekten zoals atherosclerose ^5, een ziekte gekenmerkt door chronische inflammation van de wand van slagaders. Orale infectie van specifieke pathogenen vrije muizen met P. gingivalis induceert een lokale ontstekingsreactie die met aantasting van tandondersteunende alveolaire bot ^8. P. gingivalis kunnen worden verhaald op de monden van geïnfecteerde muizen tot 42 dagen na de infectie ⁸ en muizen ontwikkelen een hoog pathogeen-specifieke serum antilichaam titers ^9. In een gevestigd muismodel van atherosclerose middels apolipoproteïne-E ^{- / -} muizen (ApoE ^{- / -),} orale infectie met P. gingivalis induceert chronische ontsteking die inflammatoire plakafzetting drijft binnen de aorta sinus ¹⁰ en de onbenoemde slagader ^11. Progressieve ontsteking in de onbenoemde slagader van P. gingivalis geïnfecteerde muizen kunnen worden gecontroleerd in levende dieren met behulp van in vivo MRI. Histologisch arteriële laesies P. gingivalis geïnfecteerde muizen vertonen een verhoogde accumulatie van lipiden BEGELEIDEgaan van activering van het vasculaire endotheel, een verhoogde immune cel infiltraat en verhoogde expressie van inflammatoire mediatoren ^12. Gebruik van dit model in knockout muizen de rol van gastheer signaleringscomponenten en ontstekingsmediatoren, alsmede de celspecifieke interacties P. rijden toegelicht gingivalis -geïnduceerde immunopathology ^12-14. Bovendien hebben experimenten gebruikmaking gedefinieerd bacteriemutanten kritische P. geïdentificeerd gingivalis virulentie factoren die bijdragen tot chronische ontsteking op lokale en systemische plaatsen ^15.

Dit artikel beschrijft methoden voor de beoordeling van P. gingivalis geïnduceerde chronische ontsteking op lokale en systemische sites. We geven een gedetailleerd protocol voor de analyse van alveolair botverlies met microCT gebruikt Amira software. Daarnaast definiëren we het nut van seriële in vivo levend dier MRI voor de beoordeling van de progressieve inflammation binnen de onbenoemde slagader. Wij zijn onder andere methodologieën voor de visualisatie en kwantificatie van inflammatoire plaque in de arteriële laesies, en beschrijven hun histologische karakterisering. Het gebruik van transgene muizen en gedefinieerde bacteriemutanten maakt dit model bijzonder geschikt voor het identificeren van zowel de gastheer en microbiële factoren betrokken bij de initiatie, progressie en uitkomst van de ziekte. Bovendien kan het model worden gebruikt om te screenen voor nieuwe therapeutische strategieën, zoals vaccinatie en farmacologische interventie.

Protocol

1 Groei en Teelt van Bacteriën

1. Streak bevroren voorraden van P. gingivalis 381 op anaërobe bloed agar platen en incubeer gedurende 3 - 5 dagen in een anaerobe kamer (10% _H2 / 10% _CO2 / 80% _N2) bij 37 ° C.
2. Gebruik de plaat gekweekt organismen 5 ml enten vloeibare kweken van hersenen hart infusie bouillon (BHI) aangevuld met gistextract (0,5%), hemine (10 ug / ml), en menadion (1 ug / ml). Na O / N groei, overdracht van de 5 ml culturen tot 45 ml BHI.
3. Incubeer de 50 ml vloeibare culturen anaëroob voor een additional18 - 24 uur en de oogst op midden tot late log-fase. NB De zuiverheid van de cultuur moet altijd worden gecontroleerd door Gram kleuring vóór de invoering van bacteriën in dieren.
4. Oogst de bacteriën door centrifugeren bij 7000 xg gedurende 10 minuten. Zuig het supernatant en resuspendeer de grondig bacteriële celpellet in 5 ml PBS met behulp van een serologische pipet. Voeg een extra45 ml PBS en centrifugeer bij 7000 xg gedurende 10 minuten. Herhaal deze stap tweemaal voor een totaal van drie wassingen.
5. Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de celpellet in PBS zodanig dat een 1:10 verdunning van de kweek een optische dichtheid van 1,0 bij 660 nm (een OD ₆₆₀ van 1 equivalent tot 10 ⁹ CFU / ml). Weeg voldoende carboxymethylcellulose (gemiddeld viscociteit) een 2% w / v oplossing te komen (bijvoorbeeld 0,1 g per 5 ml kweek). Voeg langzaam carboxymethylcellulose met bacteriële suspensie terwijl vortexen om klonteren te voorkomen.

2 Orale infectie

OPMERKING: Zoals weergegeven in figuur 1, met de juiste muismodel en orale infectie regime, P. gingivalis induceert chronische ontsteking en immunopathology op lokaal (mondholte) en systemische plaatsen (slagaders).

1. Dien sulfamethoxazol (0,87 mg / ml) en trimethoprim (0,17 mg / ml) (Sulfatrim) tot zes 8-week-old mannelijke muizen ad libitum in het drinkwater gedurende 2 weken tot de normale flora verminderen. Houd het antibioticum oplossing in amberkleurige glazen flessen en het te beschermen tegen licht om degradatie te voorkomen.
2. Om sedimentatie van de antibioticumoplossing voorkomen, schud de flessen maal per dag (dat wil zeggen, in de ochtend en late namiddag). Vervangen door een vers bereide oplossing elke 3-5 dagen.
3. Na twee weken wordt vervangen antibioticumoplossing conventionele drinkwater. Zorg voor een 2-daagse antibiotica rustperiode voorafgaand aan orale infectie.
4. Laad de P. gingivalis / voertuig ophanging in een 1 ml tuberculine spuit met een aangesloten voeding naald. Handmatig te bedwingen met de muis door grijpen de nekvel op de achterkant van hun nek. Zorg ervoor dat de grip is stevig genoeg is om de mobiliteit van het hoofd van de muis te beperken.
5. Besmetten muizen door lokale toediening van P. gingivalis het buccale oppervlak van de maxillae. Plaats de voeding naald zoals that is uitgelijnd met de buccale oppervlak van de rechter bovenkaak kiezen en uitwerpen 50 pi bacteriesuspensie. De verspreiding van de oplossing voorzichtig langs het tandvlees gedurende 1 minuut met de bal van de voeding naald.
6. Laat de muis rusten gedurende 30 sec tot 1 min voor het herhalen van de procedure aan de linkerkant maxilla. Controlemuizen kregen antibioticum voorbehandeling en orale gavage met vehikel alleen (2% carboxy methylcellulose in PBS).
7. Om pathogenen geïnduceerde chronische ontsteking op lokale sites geïnduceerde alveolaire botverlies onderzoeken door het infecteren van muizen 3 keer met 2-daagse intervallen. Offeren muizen 6 weken later voor de evaluatie van botverlies door microCT.
8. Om pathogenen geïnduceerde chronische ontsteking op lokale en systemische websites na te gaan, infecteren atherosclerose-gevoelige ApoE ^{- / -} muizen 5 keer per week gedurende 3 weken.
   OPMERKING: Progressie van de ziekte in de onbenoemde slagader wordt bewaakt door seriële in vivo MRI. Afbeelding muizen op verschillende tijdstippen en op te offeren 6-16 wkn laatr. Op het moment van het offer, beoordeelt wereldwijde atherosclerotische last van en face-analyse en bepalen alveolaire botverlies door microCT. Karakteriseren atherosclerotische laesies door histologie en immunohistochemie.

3 Micro-computertomografie (microCT)

1. Specimen Voorbereiding
   1. Offer muizen op het gewenste tijdstip na infectie. Euthanaseren muizen door CO ₂ asphyxation of door een andere door dier faciliteit van de instelling goedgekeurde methode.
      OPMERKING: Verzamel bloed door hartpunctie, afzonderlijk serum en bewaar bij -80 ° C voor analyse van anti P.gingivalis IgG zoals elders ⁹ beschreven.
   2. Gebruik een grote paar van onthoofding schaar om ernstig de muis hoofd bij de basis van de schedel. Verwijder het vlees met een pincet en plaats de schedel in een 50 ml conische buis met 30 ml 4% gebufferde paraformaldehyde. Fix het model voor 24 - 48 uur bij 4 ° C.
   3. Na fixatie, rinse het model grondig met PBS.
   4. Maak maxillaire blok biopten.
   5. Bewaar de hemi-bovenkaak in histologische graad 70% EtOH bij 4 ° C totdat evaluatie door microCT.
2. Image Acquisition
   1. Voeren afbeelding overnames gebruik van een desktop microCT scanner. Stel de röntgenbron een stroom van 114 uA en een spanning van 70 kV. Laad individuele hemi-maxillae in de beeldvorming vat en scannen met een resolutie van 12 micrometer in alle drie ruimtelijke dimensies.
      OPMERKING: Plaats meerdere hemi-maxillae tegelijkertijd binnen de beeldvorming vat.
   2. Voer een eerste lage resolutie scan waarmee de gebruiker om de grenzen af ​​te bakenen voor beeldacquisitie en scannen beperken tot het gebied van belang (ROI) van het toestel.
      OPMERKING: De intensiteit van glazuur maakt de kroon van maxillaire kiezen gemakkelijk te onderscheiden. Met behulp van de kiezen als leidraad losjes zet de beeldvorming grenzen aan de drie molaren en de omringende alveolaire bon omvattene. Deze functie wordt ook gebruikt om onderscheid te maken tussen individuele hemi-maxillae bij het scannen van meerdere monsters in hetzelfde vat.
   3. Wanneer het scannen is voltooid, zet de Raw-afbeeldingsbestanden (.ISQ) tot hoogwaardige dicoms (.dcm).
3. Beeldanalyse
   In dit protocol wordt beeldanalyse uitgevoerd met een data visualisatie, verwerking en analyse software. Gebruik eerst morfologische oriëntatiepunten om een ​​vliegtuig van de beste pasvorm voor de cementoenamel splitsing (CEJ). Maak dan gebruik van de aan de hemi-bovenkaak te zetten in een standaard oriëntatie voor de volgende meting van de alveolaire bot volume.
   1. Open de software en klik op het icoon "Open Data" in de linker bovenhoek van de Pool. U kunt ook Bestand> Open Data.
   2. Selecteer de DICOM afbeelding stack en klik op Laden. Het venster DICOM Loader verschijnt. Klik op OK.
   3. Let op de set als een groen pictogram in het zwembad van gegevens. Merk op dat op de data object veroorzaakt extra maarton worden getoond in de aan de bovenkant van de Pool. Selecteren van het icoon veroorzaakt ook wat informatie over de dataset moeten worden weergegeven in het gebied Eigenschappen.
   4. Elk pictogram in het zwembad zorgt voor een popup-menu van waaruit verschillende modules kunnen worden geselecteerd. Activeer het contextmenu door op de witte pijl in de rechter bovenhoek van het icoon van gegevens. Selecteer isosurface (Weergave> isosurface) onder het display module. De isosurface icoon verschijnt in het zwembad. Indien geselecteerd, worden extra instellingen weergegeven in het gebied Eigenschappen.
   5. Stel de Draw Style transparante en de drempel tot 2.000. Zorg ervoor dat de compactify en downsample knoppen worden geselecteerd onder opties. Onder Gemiddeld zorgen x, zijn y en z al ingesteld op 2 Klik op Toepassen om de isosurface genereren.
      OPMERKING: Neem een ​​transparante 3D-reconstructie van de hemi-bovenkaak in de 3D-viewer. Het voordeel van een transparante tekenen stijlelementen voor beeldreconstructie is dat de wortels van de molaren kangemakkelijk worden geïdentificeerd. Dit zal belangrijk zijn bij het opzetten van het model in standaard oriëntatie.
   6. Selecteer de groene data-pictogram en in het gebied Eigenschappen selecteert u het pictogram gewas. Neem een ​​venster met de afmetingen en de coördinaten van de gegevens. Zet deze even opzij. Merk op dat een selectiekader weergegeven in de 3D-viewer met groene lipjes aan elke hoek.
   7. Selecteer de knop Interact in de werkbalk van de viewer. Wijzig de grootte van het selectiekader door te klikken en te slepen op de groene hoeken. Controleer de box omvat het gebied van belang (ROI) en filtert tot dode ruimte en vuil mogelijk. Dit zal de rekenkundige vraag op de computer te verminderen.
   8. Gebruik de Trackball knop in de werkbalk van de viewer om het object in de 3D-viewer het waarborgen van de ROI wordt volledig omsloten door het selectiekader te draaien. Wanneer u tevreden bent, klikt u op OK in het gewas venster opzij gezet in stap 8.
   9. Selecteer het pictogram van de gegevens en onder de display module selecteren Oblique Slice (OBS). (Weergave> OBS)
   10. Selecteer het OBS. In de eigenschappen omgeving, stelt u het in kaart brengen op lineair, de gegevens venster variëren van -200 tot 10.000, en bemonstering te best. Selecteer nu draaien onder opties. Observeer een roteren toggle in het centrum van de OBS.
   11. Selecteer de interactie knop in de werkbalk van de viewer en gebruik de handgrepen van de cursorknop om het snijvlak van de slice te passen. Een sagittale vlak dat evenwijdig aan de wortels van de tanden en loodrecht op het occlusale oppervlak van de tanden loopt. Het vlak moet bisect de drie molaren (M1-M3), zoals geïllustreerd in figuur 2.
   12. Schakel draaien en dupliceren de OBS (object> duplicate object). Een nieuwe OBS verschijnt de naam OBS 2 Schakel draaien op voor OBS 2.
   13. Gebruik rotatiegreep OBS 2 heroriënteren zodat deze loodrecht OBS 1 (zie figuur 2).
   14. Draai draai af voor OBS 2 en maak 3 dubbele plakjes. Deze worden naam OBS 3, 4 en 5.
4. Plukken Punten voor het Vliegtuig van Best Fit
   OPMERKING: Stappen 3.4.1-3.4.5 de locatie van 8 punten te beschrijven langs de CEJ creëert een vliegtuig van de beste pasvorm. Kies vier de punten sagittale plakken en de andere vier van coronale plakken (zie figuur 3). Bij het kiezen van punten op sagittale plakjes in 3.4.6, kan het nodig zijn om OBS 1 aan te passen.
   1. Lijn OBS 1 met het midden van de mesiale wortel van M1 in het sagittale vlak. Lijn OBS 2 met het midden van de mesiale wortel van M1 in het frontale vlak.
   2. Lijn OBS 3 met het midden van de bucco-distale wortel van M1 in het frontale vlak. Indien nodig, aan te passen OBS 1, zodat het ongeveer in het midden met de bucco-distale wortel van M1 in het sagittale vlak bij het selecteren van punten in stap 20.
   3. Lijn OBS 4 met de furcatie van de buccale wortels van M2. OBS 4 moet in het midden tussen de bucco-mesiale en bucco-distale wortels van M2. Indien nodig, aan te passen OBS 1 zodanig dat deze ongeveer gecentreerd with de bucco-distale wortel van M2 in het sagittale vlak bij het selecteren van punten in stap 20
   4. Pas OBS 5, zodat het loopt door het midden van M3 in het frontale vlak. Indien nodig, aan te passen OBS 1, zodat het ongeveer in het midden met de meest distale wortel van M3 in het sagittale vlak bij het selecteren van punten in stap 20.
   5. Dupliceren een van de OBSS (OBS 6) en selecteer fit om punten in het eigenschappenvenster. De pasvorm om punten te schakelen kan de onderzoeker naar 3 of meer punten halen op 2D-of 3D-objecten in de kijker en berekent dan een vliegtuig van de beste pasvorm. In dit geval, de in het voorgaande beschreven stappen 2D OBSS wordt gebruikt om 8 punten langs de CEJ selecteren.
   6. Verbergen OBS 6 van de 3D-viewer door te klikken op de oranje doos in de rechterbovenhoek van het pictogram van gegevens. Verberg de isosurface van de 3D-viewer het CEJ zichtbaar op alle 2D-schijfjes te maken. Shift-klik en selecteer de 8 punten langs de CEJ zoals hierboven beschreven.
      OPMERKING: Als de Shift-toets niet wordt ingedrukt bij het selecteren vanpunten, zal een vlak automatisch berekend na de eerste drie punten.
   7. Na het selecteren van alle 8 punten, maken OBS 6 zichtbaar. Merk op dat dit een axiale slice die ongeveer parallel loopt aan het occlusale vlak.
5. Transformatie en Heroriëntatie OPMERKING: Het vlak van de beste passing wordt gebruikt om de gegevens om te zetten in een standaard oriëntatie voor daaropvolgende volumetrische metingen.
   1. Klik op Gegevens Icoon> Compute> ApplyTransform. Het pictogram ApplyTransform verschijnt in het zwembad. Klik op het witte vierkantje in de hoek van de ApplyTransform icoon, selecteer referentie, en klik op OBS 6.
   2. In het gebied Eigenschappen de optie standaard voor de interpolatie methode en verlengd voor mode. Breng de transformatie.
   3. Maak een isosurface en een coronale OBS voor het nieuwe bestand. Draai de OBS in de axiale richting zodanig dat deze ongeveer loodrecht M1 (getoond in figuur 2). Gebruik de knobbels van de kies en de occlusale curvatures als een gids.
   4. Met dit vliegtuig om de gegevens te transformeren zoals in de stappen 3.5.1 en 3.5.2. Sla de getransformeerde gegevens bestand.
6. Segmentatie en Bone Volume Meting
   OPMERKING: De onderstaande stappen beschrijven de segmentatie en de meting van de alveolaire bot. De slice overeenkomt met het vlak van beste past bij de CEJ is geïdentificeerd en een referentievlak gekozen. Alveolaire bot tussen de CEJ en het referentievlak op de buccale zijde van de molaren is gesegmenteerd en gemeten. De meest mesiale wortel van M1 en de meest distale wortel van M3 dienen als eindpunt oriëntatiepunten. Het referentievlak 15-20 plakjes onder de CEJ instellen levert een optimaal resultaat. Opneming van verdere plakjes introduceert variabiliteit die maskers verschillen in het bot volume tussen de behandelingsgroepen.
   1. Open de Segmentatie Editor en maak een nieuw label voor de getransformeerde gegevens.
   2. Maak een nieuw materiaal en noem het alveolaire bot.
   3. Onder Zoom en Data Window, zet de data variëren from -200 tot 10.000.
   4. Onder Display en Masking selecteer de 2D crosshair, 3D MPR en 3D volume rendering iconen. Zet de data variëren van 2.500 tot 8.000. Enable data masking.
   5. Selecteer de Vier kijkers weergave-instellingen van de werkbalk van de viewer. Het display is verdeeld in vier kwadranten waarbij de gelijktijdige controle van sagittale, coronale en beeld axiale stacks, alsmede het 3D volume.
   6. Gebruik alle vier kwadranten het laatste segment waar glazuur zichtbaar op de buccale oppervlakken van M1 en M3 identificeren. Deze locatie overeenkomt met het vlak van de beste pasvorm voor de CEJ. Noteer de axiale slice nummer.
   7. In het axiale vlak, blijven 15-20 plakjes naar de alveolaire bot kuif. Dit is de referentie vlak.
   8. Gebruik van een combinatie van segmentatie tools waarmee alveolaire bot selecteren op de buccale zijde van de molaren tussen CEJ en het referentievlak. Gebruik de meest mesiale wortel van M1 en de meest distale wortel van M3 als eindpunt oriëntatiepunten.
   9. Keer terug naar het object zwembad. Een nieuw pictogram met de extensie ".Labels" moet worden toegevoegd aan het pictogram van beeldgegevens. Selecteer het pictogram Labels en in het drop-menu te selecteren Materialen> MaterialStatistics.
   10. In het gebied Eigenschappen, selecteert Materiaal en raakte van toepassing. Er verschijnt een tabel weergeven van verschillende parameters voor elk materiaal op de lijst materialen. Noteer het volume van alveolaire bot.

4 Beoordeling van Atherosclerose

1. Aortadissectie
   1. Offer de muis door CO ₂ stikken op het gewenste tijdstip na infectie.
   2. Plaats de muis op de dorsale zijde, band naar beneden en veeg muis met 70% EtOH. Snijd de huid aan de ventrale zijde van het midden van de buik tot net boven de xyphoid werkwijze.
   3. Snijd de buikhuid totdat de xyphoid proces zichtbaar is. Til de xyphoid proces met een kleine pair tang, bezuinigen aan weerszijden van de ribbenkast en snijd de membraan. Maak dan twee ruimde weerszijden van de ribbenkast naar het hart bloot te leggen.
   4. Exsanguinate de muis met een 27 G insulinespuit geplaatst in de top van het rechterventrikel. Tijdens bloedafname periodiek roteren de naald blokkering van de opening door de ventriculaire wand voorkomen. Typisch, 0,8 - kan 1 ml bloed worden verkregen met deze methode.
   5. sup> OPMERKING: Aparte serum en bewaar bij -80 ° C voor de analyse van anti P.gingivalis IgG zoals elders beschreven ⁹
   6. Gebruik een schaar om de rechterboezem verwijderen.
   7. Zoek de linker ventrikel aan de achterste zijde van het hart. Breng een 21 G naald in de apex van de linker ventrikel, de afschuining van de naald naar het midden van de kamer en langzaam spoel de bloedsomloop met 3 - 5 ml weefsel fixeermiddel.
   8. Trim vet en thymus rondom het hart.
   9. Verwijder de lungs.
   10. Zoek de aortaboog met de drie takken en duidelijk omringende vetlagen weg voor een betere belichting.
   11. Verder dissectie van de aorta van de boog aan de onderkant van het membraan.
   12. Verwijder de lever en verplaatsen darmweefsel de neergaande aorta bloot. Ontleden de distale aorta naar de nierslagader takken.
   13. Snijd de nierslagaders en blijven de dissectie tot in de ileal bifurcatie.
   14. Als de aorta is vrij van de meeste bindweefsel, naar het begin van de aorta en knip het bovengedeelte van de drie onderdelen van de aorta boven het hart.
   15. Peel hart omhoog, knippen onderliggende vetweefsel om hart te scheiden van het lichaam.
   16. Houd het hart met een pincet en trek naar boven, het snijden van het bindweefsel die nog kunnen worden verbonden, en verder naar beneden naar de nieren en volg tot aan de benen en knip bij de laagst mogelijke punt.
   17. Fix aorta in 10% formaline gedurende 1 uur met een vervolgpaginagende PBS wassen voor 1 uur. Alternatief opslag aorta in 10% formaline O / N, spoel in PBS en de volgende dag verder met dissectie.
   18. Plaats aorta in een 10 cm petrischaaltje met PBS.
   19. Met behulp van een dissectie scope, verwijder voorzichtig adventitia weefsel van de aorta.
   20. Wanneer aorta is gratis van overtollig vet en weefsel, afgesneden onderste twee derden van het hart. Beginnen peeling hartspier uiteindelijk weg van het hart tegenover de aortaboog. De bol van de aorta moet langzaam verschijnen, die wit in kleur zal zijn.
   21. Blijven zorgvuldige dissectie met behulp van twee tang totdat aorta bollen vrij zijn van hart-en spierweefsel.
   22. Plaats gereinigd aorta in een zwart dissectie dienblad en bedek met PBS.
2. Pinning van Aorta
   1. Houd aorta behandeld in PBS gedurende pinning.
   2. Leg aorta in anatomische positie met bollen van de aorta op links.
   3. Plaats tijdelijke minutien pinnen op 5 locaties beginnend bij 1) de top van de aorta, 2) onder de derdetak van de boog, 3) het midden van dalende aorta 4) in de buurt onderkant van dalende aorta 5) boven de tak van de arteria femoralis.
   4. Met behulp van extra fijne lente schaar, doorsnijden linkerkant van aorta, beginnend bij links tak van dijbeenslagader helemaal tot aan aorta tot onder de laagste tak van de aorta ascendens.
   5. Gesneden uit naar links kant van laagste aorta lamp bij de spleet en blijven snijden tot kruising van de snede te bereiken langs verticale snede van de aorta.
   6. Dwars door aorta horizontaal punt van de laagste tak van de aorta ascendens bereiken
   7. Snijd boven aan de rechterzijde tot boven de hoogste tak van de aorta.
   8. Snijd elke tak aan zijn binnenste oppervlak bloot te leggen.
   9. Verwijder een deel van de tijdelijke pinnen en te vervangen door permanente pinnen met doel van beetgepakt alle aorta in anatomische locatie, zonder vouwen, strekken van de aorta. Doel is om de binnenkant van de aorta bloot.
   10. Ga pinning totdat alle binnenoppervlak van aorta wordt blootgelegd en duidelijk zichtbaar van boven en zonder visuele interference van pinnen.
3. Lipid kleuring en laesie kwantificering
   1. Bereid Sudan IV kleuring oplossing (5 mg / ml in 70% isopropanol). Meng goed en filteren om ervoor te zorgen geen kristallen aanwezig zijn.
   2. Cover gespeld aorta in Soedan IV oplossing voor 50 min.
   3. Wassen met 70% isopropanol voor 1-5 minuten. Voorzichtig afspoelen aorta met ddH20 totdat het water dat uit de aorta is niet meer rood.
   4. Bedek aorta met PBS. Maak foto's van de aorta met een hoge-resolutie camera bevestigd aan een dissectiemicroscoop en opslaan als digitale beeldbestanden (.TIFF). Leg een liniaal naast elke afbeelding om te helpen bij de kalibratie.
   5. Gebruik ImageJ software om het gebied van de intima en de oppervlakte van laesies bepalen. Handmatig traceren van de intima oppervlak om gebied te bepalen. Laesie kan worden berekend met behulp van geautomatiseerde kleur drempelwaarden. Dit vereist het instellen van een drempel om een ​​kleurintensiteit die laesies discrimineert uit normale gebieden te definiëren.
   6. Bereken het percentage van deintimale oppervlak met atherosclerotische laesies.

5 Histologische evaluatie van atherosclerose

1. Oogsten aortaboog met hartweefsel en onder te dompelen in oktober in een wegwerp basis mal.
2. Verzamel 5 micrometer seriële cryocoupes elke 50 micrometer in de aorta sinus en onbenoemde slagader met behulp van een cryostaat ingesteld op -17 ° C en monteer het weefsel secties prepareren. WINKEL glijdt bij -20 ° C tot verder gebruik.
3. Voor histologische beoordeling, vlek met hematoxyline & eosine behulp van de juiste procedures.

6 Immunohistochemisch Karakterisering van atherosclerotische laesies.

De onderstaande stappen een algemene antilichamen gebaseerde protocol routinematig gebruikt om atherosclerotische laesies in P. beoordelen gingivalis geïnfecteerde muizen. Dit protocol vereist optimalisatie voor elk antilichaam of reagens.

1. Verwijder de dia's uit diepvries en bevestiggedurende 2 min in ijskoude fixatief (aceton of andere fixeermiddel).
2. Laat dia's om RT te komen en te labelen met een oplosmiddel bestendig pen.
3. Rinse schuift 3x in PBS om de weefsel bevriezen matrix verwijderen
4. Blokkeer endogene peroxidase activiteit door incubatie de slides in 0,3% H ₂ O ₂ opgelost in PBS gedurende 10 minuten.
5. Rinse schuift 3x in PBS gedurende 2 minuten per keer.
6. Blokkeer niet-specifieke binding door incubatie in blokkerende buffer (10% konijnenserum in PBS) gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
7. Verdun het primaire antilichaam 1:50 in 10% konijnenserum.
8. Breng het verdunde antilichaam aan het weefselcoupes op de dia.
9. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
10. Rinse schuift 3x in PBS gedurende 2 minuten elk.
11. Verdun anti-rat gebiotinyleerd secundair antilichaam 1: 100 in 10% konijnenserum.
12. Breng de weefselcoupes op de dia en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
13. Rinse schuift 3x in PBS gedurende 2 minuten elk.
14. Bereid DAB substraat door toevoeging1 druppel DAB chromogeen elk 1 ml DAB buffer.
15. Tap PBS van de dia's en de DAB-substraat-oplossing toe te passen. Laat dia incuberen gedurende 5 minuten of totdat de gewenste kleurintensiteit wordt bereikt.
16. Was 3x in water gedurende 2 min elk.
17. Teller vlek met hematoxyline.
18. Dehydrateer door 4 veranderingen van alcohol (95% 1 min, 95% 1 min, 1 min 100% en 100% 5 min).
19. Duidelijk in 3 veranderingen van xyleen.
20. Dekglaasje met montage-oplossing en kwalitatief te analyseren met behulp van microscopie. Voor kwantitatieve analyse verwerven afbeeldingen en bereken kleuring met ImageJ middels een geautomatiseerde drempel.

7 MRI

1. Animal Voorbereiding voor MRI
   1. Verdoven van de muizen voor MRI-experimenten. Voer de eerste inductie van de anesthesie met behulp van 4% verdampte isofluorane voor 2-3 min in een inductie kamer. Onderhouden anesthesie tijdens de beeldvorming periode met behulp van een continue stroom van 0,5-2% verdampt isofluorane delivered door middel van een neuskegel setup of masker.
   2. Na het bereiken van de chirurgische vlak van anesthesie (dwz geen teen knijpen respons), plaatst de muis in een dier houder met de neus ingebracht in een neuskegel. Er zijn verschillende soorten commercieel verkrijgbare dierlijke houders die kunnen worden gebruikt om mogelijke bewegingen tijdens beeldvorming minimaliseren. We maken gebruik van een speciaal ontworpen houder met een hapje bar.
   3. Monitor ademhaling en hartcyclus en synchroniseren met beeldopname met een ademhaling kussen (geplaatst op de buik van de muis) met een kleine controle en gating voor dieren.
   4. Zet de muis en het monitoring systeem op het dier houder met laboratorium film.
2. MRI data acquisitie
   1. Plaats het dier houder met de muis hoofd eerst in liggende positie naar een 30 mm verticaal probe (Micro 2,5) gehandhaafd op 23 ° C en in de verticale boring 11,7 T MRI scanner.
   2. Lijn de houder met het centrum van tHij RF spoel.
   3. Voer een shimming proces met behulp van een enkele puls reeks.
   4. Met behulp van een RARE sequence, verwerven scout beelden langs de drie orthogonale richtingen te axiale, coronale en sagittale beelden te creëren.
   5. Voer een lage resolutie magnetische resonantie angiografie (MRA) met een ungated 3D gradiënt echo sequentie met de volgende parameters: plaatdikte = 1,5 cm; flip hoek = 45 °; herhaling tijd = 20 ms; echo tijd = 2,2 ms; gezichtsveld = 1,5 x 1,5 x 1,5 cm; matrix = 64 × 64 × 64; aantal gemiddelde = 1 Totale scantijd: 2~3 min. Het doel van deze scan is dat beelden worden verworven het doelgebied (de innominate slagader).
   6. Voer een hoge resolutie MRA van de innominate slagader met een ungated 3D gradiënt echo sequentie met de volgende parameters: plaatdikte = 1,5 cm; flip hoek = 45 °; herhaling tijd = 20 ms; echo tijd = 2,2 ms; gezichtsveld = 1,5 x 1,5 x 1,5 cm; matrix = 128 &# 215; 128 × 128; aantal gemiddelde = 4 Totale scantijd was -25 min.
   7. Verkrijgen continue axiale beelden van de onbenoemde slagader 0.5mm onder de subclavia bifurcatie.
3. MRI gegevensanalyse
   1. Voeren afbeelding reconstructie en analyse met behulp van beeldbewerkingssoftware in verband met de scanner. Het bereiken van de 3D-reconstructie van de MRA beelden door Maximum Intensity Projection.
   2. Gebruik subclavia bifurcatie als anatomische marker gegevens verkregen van verschillende muizen of dezelfde muis op verschillende tijdstippen uitlijnen. Kies het onderdeel doel kruis van de onbenoemde slagader bij 0.3- tot 0,5-mm afstand onder de subclavianbifurcation.
   3. Definiëren en te berekenen luminale gebied van de gekozen doorsnede met ImageJ. De metingen moeten op een blinde manier worden uitgevoerd door twee onafhankelijke waarnemers. Controleer meting reproduceerbaarheid door het berekenen interclass correlatiecoëfficiënten.
   4. Voor longitudinale studies met seriële IMAGing, normaliseren luminale gebied naar het gebied van de lumen in de uitgangssituatie (de eerste bus in de studie) voor elke muis. Het resultaat wordt uitgedrukt als verandering in de luminale omgeving na verloop van tijd.
   5. Voer de geschikte statistische analyses (dwz student t test) significante verschillen tussen de experimentele groepen bepalen.

Representative Results

Met behulp van de juiste muis-model en orale infectie regime, P. gingivalis induceert chronische ontsteking en immunopathologie lokale (mondholte) en systemische plaatsen (slagaders) (figuur 1).

Bij muizen, orale infectie met P. gingivalis induceert een lokale ontstekingsreactie die de vernietiging van tandondersteunende alveolaire bot ⁸ aandrijft. P. gingivalis geïnfecteerde muizen serum antilichaamrespons tegen dit organisme die voornamelijk van het IgG isotype ⁹ te ontwikkelen. Resultaten getoond in figuur 4 zijn representatief voor een experiment waarin C57BL / 6 op twee dagen via geïnfecteerd met P.gingivalis driemaal opgeofferd en 6 weken later voor de beoordeling van alveolair botverlies door microCT. Volumetrische analyse met Amira software blijkt dat P. gingivalis geïnfecteerde muizen vertonen significant botverlies in vergelijking met niet-geïnfecteerde controles (Figuur 4A). Visuele inspectie van gereconstrueerde hemi-maxillae illustreert een toename blootgestelde oppervlak van de molaire wortels in geïnfecteerde muizen in vergelijking met controles (Figuur 4B en Figuur 4C).

In atherosclerose-gevoelige ApoE ^{- / -} muizen, P. gingivalis induceert chronische ontsteking die alveolair botverlies ¹² en inflammatoire plaque depositie binnen de aorta sinus ¹⁵ en innominate slagader ¹¹ aandrijft. P. gingivalis geïnduceerde atherosclerose komt al 24 uur na de laatste besmetting en kunnen voorkomen door immunisatie voorafgaand aan infectie ^16. Progressive ontsteking in de innominate slagader van P. gingivalis geïnfecteerde muizen kunnen in levende muizen worden gevolgd door seriële in vivo MRI op verschillende tijdstippen na infectie (Figuur 5). En face metingen van Sudan IV gekleurde aorta's aantoont dat P. gingivalisinfectie verhoogt lipideafzetting en aangedane gebied op het intimale oppervlak (figuur 6). Op het moment van opoffering, histologie en immunohistochemie kan worden om kwalitatief of kwantitatief karakteriseren atherosclerotische laesies in de context van cellulaire samenstelling de expressie van verschillende antigenen, en vetten. Immunohistochemische analyse van de aorta sinus laesies onthult verhoogde infiltratie van macrofagen en verhoogde expressie van het aangeboren immuunsysteem receptor Toll-like receptor 2 (TLR2) in P. gingivalis geïnfecteerde muizen (Figuur 7).

Figuur 1 P. gingivalis geïnduceerde chronische ontsteking op lokale en systemische sites. Voorafgaand aan infectie met P. gingivalis muizen zijn administe rode antibiotica ad libitum in hun drinkwater gedurende 10-14 dagen, gevolgd door een twee-daagse antibiotica rustperiode. Antibiotische behandeling onderdrukt de inheemse orale flora en faciliteert kolonisatie. Voor de inductie van alveolaire schade worden muizen geïnfecteerd drie keer op twee dagen intervallen en alveolaire bot volume wordt gemeten op 6 weken na infectie. Bij de beoordeling van atherosclerose, atherosclerose-gevoelige ApoE ^{- / -} muizen zijn meestal besmet 5 keer per week gedurende 3 weken en opgeofferd 16-24 weken na de infectie. Progressive ontsteking in de innominate slagader van levende muizen kan worden gemeten door seriële in vivo MRI op verschillende tijdstippen na infectie. Histologie en immunohistochemie kan worden gebruikt om vlekken voor lipiden en inflammatoire cellen bij beëindiging van het experiment om beeldgegevens te valideren. Op het moment van opoffering, wordt alveolair botverlies gemeten microCT en wereldwijde atherosclerotische last wordt bepaald door en face kleuring van hele aorta. https://www.jove.com/files/ftp_upload/51556/51556fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2 Mouse hemi-bovenkaak de positionering van OBS 1 en 2 OBS De drie kiezen zijn gelabeld (M1-M3) en relevante anatomische terminologie wordt aangegeven illustreren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3 Mouse hemi-maxilla de ligging van OBS 1 tot 5 illustreren.1556 / 51556fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4 alveolair botverlies gemeten met microCT. Mannelijke C57BL / 6 werden oraal geïnfecteerd met P. gingivalis of voertuig alleen (niet-geïnfecteerde) en alveolaire bot volume werd geëvalueerd door microCT 6 weken later met behulp van Amira. (A) Alveolair volume bot in hemi-maxillae van niet-geïnfecteerde en P. gingivalis geïnfecteerde C57BL / 6. De resultaten vormen bot volume boven het referentievlak (120 micron uit de CEJ). Gegevens worden uitgedrukt botvolume SD van n = 8 muizen per groep. *** P <0,001, in vergelijking met niet-geïnfecteerde controles. (B) en (C) Representatieve 3D-reconstructies van hemi-maxillae van geïnfecteerde (B)en P. gingivalis geïnfecteerde (C) muizen. Een significante afname van alveolair bot volume kan worden gezien in P. gingivalis geïnfecteerde muizen in vergelijking met niet-geïnfecteerde controles. Pijlpunten geven aan gebieden waar zichtbare botverlies optreedt in P. gingivalis geïnfecteerde muizen (let op de toename van het blootgestelde oppervlak van de molaire wortels). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5 progressieve ontsteking in de innominate slagader volgende P. gingivalis infectie zoals gemeten door middel van MRI (A) Vertegenwoordiger magnetische resonantie (MR) angiogram van de aortaboog en de grote bloedvaten van een ApoE. ^-/ -. Muis (B) Axiale MR afbeelding van de gele lijn in een van de onbenoemde slagader van een muis, 0.3mm onder de bifurcatie. Onbenoemde slagaders werden afgebeeld door MRA bij aanvang en op 12 en 16 week na de infectie. (C) De tijdelijke verandering in de luminale omgeving (mm ²⁾ werd berekend voor individuele muizen (n = 10-12 / groep). Geïnfecteerde ApoE ^{- / -} (blauw); P. gingivalis geïnfecteerde ApoE ^{- / -.} (rood) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6 En face bepaling van aangedane gebied de gehele aorta. (A) Sudan IV kleuring van aorta <em> en face laesies 16 wk na de infectie met P. gingivalis. (B) Kwantificering van vetgehalte in de totale aorta van niet-geïnfecteerde (witte symbolen) en P. gingivalis geïnfecteerde muizen (zwarte symbolen) (n = 10-13 / groep). Percentage van de aorta bezet door lipiden werd berekend met behulp van ImageJ. * P <0,05. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7 immunohistochemische analyse van de aorta sinus laesies Man ApoE ^{-. / -} Muizen gevoed een normale chow dieet waren geïnfecteerd met P. gingivalis of niet-geïnfecteerde en opgeofferd 16 weken na de infectie. Vriescoupes verkregen uit de aorta sinus werden gekleurd met anti-muis F4 / 80 en TLR2. Schaal bar, 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

De P. gingivalis orale infectie model een waardevol hulpmiddel voor de studie van pathogenen geïnduceerde chronische ontsteking lokale en systemische plaatsen. Dit unieke model maakt de karakterisering van zowel gastheer en pathogeen specifieke mechanismen tot chronische ontsteking en immunopathologie. Bovendien kan het model worden gebruikt om te screenen voor nieuwe therapeutische strategieën, waaronder immunisatie en farmacologische interventie. De stappen in dit protocol beschrijven het succesvolle gebruik van dit model en detail methoden om de initiatie, progressie, en de uitkomst van P. beoordelen gingivalis geïnduceerde chronische ontsteking.

Er zijn een aantal kritische aspecten in gedachten te houden bij het gebruik van dit protocol om inflammatoire botverlies te onderzoeken. Allereerst moet worden opgemerkt dat de oplossing van infectie met P. gingivalis wordt bepaald door drie belangrijke factoren: 1) de genetische gevoeligheid van de gastheer tegen infecties 2) pathogeenvirulentie (genetica van het pathogeen) en 3) de resulterende gastheer-pathogeen interacties (interactie tussen de twee genomen). Gevoeligheid voor P. gingivalis -geïnduceerde alveolaire botverlies is genetisch bepaald bij muizen, dus zorg moet worden genomen bij het ​​selecteren van de stam van muizen voor onderzoek ^17. Differentiële gastheer reacties onder inteelt stammen van muizen kan worden aangegrepen om verder genetische screens uit te voeren en karakteriseren van genen die betrokken zijn bij gevoelige en resistentie tegen pathogenen geïnduceerde chronische ontsteking. Daarnaast aanzienlijke heterogeniteit bestaat in het vermogen van verschillende P. gingivalis stammen alveolair botverlies in muizen ¹⁸ induceren. Dit protocol maakt gebruik van muizen op de C57BL / 6 achtergrond vanwege de beschikbaarheid van transgene muizen en hun gevoeligheid voor atherosclerose. P. gingivalis stam 381 induceert alveolair botverlies en atherosclerose in muizen op de C57BL / 6 achtergrond, en verscheidene bacteriële mutanten geconstrueerd middels this stam.

Muizen zijn bijzonder resistent tegen atherosclerose en de ontwikkeling van openlijke arteriële lesies vereist het gebruik van genetisch gemodificeerde muizenmodellen van atherosclerose. Wij gebruiken de ApoE ^{- / -} muismodel omdat het gevestigde muismodel van atherosclerose, ofwel het voeden van vetrijke dieet voor laesievorming vereisen en recapituleert vele aspecten van menselijke ziekten ^19. Het type dieet dat de dieren gevoerd in de loop van het experiment is een belangrijke variabele. Voor de meerderheid van ons werk, voeden we muizen een normale chow dieet om de bijdrage van exogene lipiden in de interpretatie van onze resultaten te vermijden. In preliminaire studies, vonden we dat het voeren muizen een hoog vet dieet maskers verschillen en face laesie tussen geïnfecteerde en P. gingivalis geïnfecteerde muizen binnen de aorta sinus. Echter, hoog vet dieet en P. gingivalis infectie werken synergistisch bij de progressie van Inflammatie wordt toezicht gehouden in de onbenoemde door MRI of histologie ^11. In muizen, de innominate slagader een hoge laesie progressie en letsels in deze slagader express kenmerken vertonen van klinische ziekte bij de mens inclusief verblijf vernauwing, atrofische media, perivasculaire ontsteking en plaque verstoring. Verschillen in de cellulaire samenstelling van laesies zichtbaar op verschillende anatomische plaatsen. Macrofagen zijn de primaire immuuncellen infiltrerende aortische sinus laesies, terwijl innominate slagader laesies bestaan ​​uit zowel macrofagen en T-cellen.

Experimentele duur en het tijdstip waarop inflammatoire eindpunten worden geëvalueerd zijn bijkomende factoren te overwegen bij de beoordeling van initiatie, progressie, en de uitkomst van P. gingivalis geïnduceerde atherosclerose. We hebben eerder aangetoond dat P. gingivalis geïnfecteerde ApoE ^{- / -} muizen vertonen infiltratie van macrofagen, verhoogde expressie van het aangeboren immuunsysteem markers, eennd verhoogde afzetting van inflammatoire plaque al 24 uur na de laatste infectie in de aortische sinus en dit kan worden voorkomen door immunisatie ^16. In onze handen, ontsteking en immunopathologie toename met de leeftijd en zijn duidelijk tot 24 weken na de infectie. Echter, beslissingen met betrekking tot de duur van de studie uiteindelijk vertrouwen op de onderliggende hypothese wordt onderzocht, de wijze van analyse en de voorkennis van de mate van atherosclerose onder specifieke omstandigheden.

Het gebruik van niet-invasieve beeldvormingstechnieken progressieve ontsteking in de innominate slagader monitor kan worden gebruikt voor experimentele duur leiden. Seriële MRI maakt gedetailleerde studies van progressie van atherosclerose in hetzelfde dier dat de vernauwing van het arteriële lumen en kleine vaatwand gebieden ²⁰ kunnen afbeelden. In tegenstelling tot traditionele methoden, zoals lipide kleuring van ontleed vaartuigen, ofwel MRI niet vereist euthanasieen zorgt voor een longitudinaal onderzoek naar de initiatie en progressie van atherosclerose te beoordelen. In combinatie met transgene muizen, bacteriële mutanten of experimentele behandelingen, kan de temporele informatie van MRI gebruikt om het effect van gastheer genetica, pathogeen virulentiefactoren en therapeutische interventie evalueren. Als extra voordeel histologie en immunohistochemie kan worden gebruikt om vlekken voor lipiden en inflammatoire cellen bij beëindiging van het experiment om beeldgegevens te valideren. We hebben onlangs gebruikt deze methoden dat orale infectie met P. tonen gingivalis versnelt atherosclerose in de innominate arterties of ApoE ^{- / -} muizen, dat immunisatie beschermt tegen plaque progressie en correleert met dalingen in de accumulatie van lipiden en ontstekingscellen ^11.

Kortom, dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om een ​​robuust model van pathogenen geïnduceerde chronische ontsteking te produceren, maar ookals het gebruikt om ontstekingen te beoordelen op lokale en systemische plaatsen methoden. Afgezien van het gebruik van dit model gastheer en pathogeen specifieke mechanismen betrokken bij inflammatoire botverlies en atherosclerose onderzocht kan worden aangepast aan de bijdrage van pathogenen geïnduceerde chronische ontsteking extra ziektemodellen bestuderen. Dit kan worden bewerkstelligd gebruikmakend van transgene muismodellen van ziekten zoals reumatoïde artritis, diabetes en kanker. Opkomende bewijs geeft aan dat een aantal chronische ziekten van onbekende etiologie besmettelijke oorsprong kunnen hebben. Deze ziekten omvatten neoplastische, autoimmune en inflammatoire ziekten, en samen compromis de belangrijkste oorzaken van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Zo is het gebruik van diermodellen om de rol van pathogenen bij ziekten veroorzaakt door chronische ontsteking onderzocht het vermogen tot brede therapeutische effect en verbeterde diagnostiek.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amira analysis software	Visualization Sciences Group
Anaerobic chamber DW Scientific Model MG500	Microbiology International
BHI	Becton-Dickinson	211059
Hemin	Sigma-Aldrich	51280-5G
Menadione (Vitamin K)	Sigma-Aldrich	M5625-25G
Yeast Extract	Becton-Dickinson	212750
Carboxymethyl cellulose (medium viscocity)	Sigma-Aldrich	C-4888
Sulfamethoxazole and trimethoprim oral suspension 200 mg/40 mg per 5 ml	Hi-Tech Pharmacal	NDC 50383-823-16
μCT 40	Scanco
HistoChoice Tissue Fixative	Sigma-Aldrich	H2904
Sudan IV	Sigma-Aldrich	S4261-25G
Vertical-bore 11.7T Avance spectrometer	Bruker
Paravision	Paravision
ImageJ	NIH
Rat anti-mouse F4/80	Serotec	MCA497R
Rat anti-mouse TLR2	eBioscience	13-9021-80
Leica S4 dissecting scope	Leica
Microm HM 550 cryostat	Microm