Summary
पशु मॉडलों जीर्ण सूजन के विकास में योगदान है कि मेजबान और रोगज़नक़ विशिष्ट तंत्र को परिभाषित करने में अमूल्य उपकरण साबित किया है. यहाँ हम स्थानीय और प्रणालीगत स्थलों पर सूजन की प्रगति का आकलन करने के लिए मानव रोगाणु Porphyromonas gingivalis और विस्तार के तरीके के साथ मौखिक संक्रमण के एक माउस मॉडल का वर्णन.
Abstract
जीर्ण सूजन रोग ऊतकों को नुकसान और नियोप्लास्टिक, autoimmune, और जीर्ण सूजन रोगों सहित मानव में कई पुराने रोगों के एक एकीकृत विशेषता का एक प्रमुख ड्राइवर है. सबूत उभरते नैदानिक अभिव्यक्तियाँ की एक विस्तृत विविधता के साथ विकास और पुराने रोगों की प्रगति में रोगज़नक़ प्रेरित जीर्ण सूजन implicates. कारण पुरानी बीमारी के जटिल और multifactorial एटियलजि के लिए, करणीय का सबूत और यंत्रवत लिंक की स्थापना के लिए प्रयोगों को डिजाइन करने के लिए मानव में लगभग असंभव है. पशु मॉडल का उपयोग करने का एक लाभ यह एक विशेष रोग के पाठ्यक्रम को प्रभावित कर सकते हैं कि दोनों आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों को नियंत्रित किया जा सकता है. इस प्रकार, संक्रमण के प्रासंगिक पशु मॉडल के डिजाइन जीर्ण सूजन के लिए योगदान है कि मेजबान और रोगज़नक़ विशिष्ट तंत्र की पहचान करने में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है.
यहाँ हम रोगज़नक़ प्रेरित पुरानी infla के एक माउस मॉडल का वर्णनमौखिक रोगज़नक़ Porphyromonas gingivalis, निकट मानव periodontal रोग के साथ जुड़े एक जीवाणु से संक्रमण के बाद स्थानीय और प्रणालीगत स्थलों पर mmation. विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त चूहों के मौखिक संक्रमण वायुकोशीय हड्डी, periodontal रोग की एक बानगी समर्थन दांत के विनाश में जिसके परिणामस्वरूप एक स्थानीय भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है. पी के साथ एक स्थापित माउस atherosclerosis के मॉडल, संक्रमण में gingivalis संवहनी endothelium की सक्रियता, एक वृद्धि की प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ, और घावों के भीतर भड़काऊ मध्यस्थों का ऊंचा अभिव्यक्ति के साथ महाधमनी साइनस और अनामी धमनी के भीतर भड़काऊ पट्टिका बयान, accelerates. हम स्थानीय और प्रणालीगत स्थलों पर सूजन के आकलन के लिए विस्तार के तरीके. ट्रांसजेनिक चूहों और परिभाषित बैक्टीरियल म्यूटेंट का उपयोग मेजबान और रोग की दीक्षा, प्रगति, और परिणाम में शामिल माइक्रोबियल कारकों दोनों की पहचान करने के लिए इस मॉडल को विशेष रूप से उपयुक्त बनाता है. Additionallवाई, मॉडल टीकाकरण और औषधीय हस्तक्षेप सहित उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों, के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
जीर्ण सूजन रोग ऊतकों को नुकसान और मनुष्यों में कई पुराने रोगों के एक एकीकृत विशेषता का एक प्रमुख ड्राइवर है. इन रोगों नियोप्लास्टिक, autoimmune, और जीर्ण सूजन रोगों 1 शामिल हैं. कई पुराने रोगों के एटियलजि अस्पष्ट बनी हुई है लेकिन आनुवंशिक गड़बड़ी और पर्यावरणीय कारकों की शुरूआत दोनों शामिल, जटिल और multifactorial हो समझा जाता है. सूजन की perpetuators मायावी रहते हैं, प्रतिरक्षा सक्रियण के सेलुलर और आणविक प्रोफाइल के रोगजनकों 2 के लिए मेजबान प्रतिक्रियाओं में मनाया उन पैटर्न के साथ काफी ओवरलैप.
बढ़ते सबूत माइक्रोबियल विकास में रोगजनकों और जीर्ण सूजन की प्रगति और इसके विविध नैदानिक अभिव्यक्तियाँ 2,3 साथ संक्रमण implicates. रोगजनकों प्रेरित और लगातार संक्रमण मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली अशांति फैलाने और स्थापना से जीर्ण सूजन सीधे बनाए रख सकते हैं
जीर्ण सूजन की प्रेरण और रखरखाव के लिए योगदान मेजबान और रोगज़नक़ विशिष्ट तंत्र यद्यपिखराब रोगज़नक़ प्रेरित जीर्ण सूजन की मॉडलिंग के क्षेत्र में प्रगति इन प्रक्रियाओं के बारे में हमारी समझ को आगे करने के लिए शुरू कर दिया है, समझ में आया. पी gingivalis मौखिक संक्रमण मॉडल मेजबान और रोगज़नक़ स्थानीय (मौखिक हड्डी हानि) में जीर्ण सूजन के लिए योगदान दे विशिष्ट तंत्र और प्रणालीगत साइटों (atherosclerosis) 5,6 का विश्लेषण है कि परमिट रोगज़नक़ प्रेरित जीर्ण सूजन की एक अद्वितीय, अच्छी तरह से विशेषता माउस मॉडल है.
पी gingivalis मानव periodontal रोग, ऊतक 7 समर्थन दांत के विनाश की विशेषता संक्रमण संचालित जीर्ण सूजन की बीमारी में फंसा एक ग्राम नकारात्मक, अवायवीय मौखिक रोगजनक है. संक्रमण के प्रारंभिक स्थल पर पैथोलॉजी के अलावा, जमते सबूत पी implicates gingivalis विकास और atherosclerosis 5 सहित प्रणालीगत रोगों की प्रगति में जीर्ण सूजन -induced, एक बीमारी पुरानी inflammatio द्वारा विशेषताधमनी पोत दीवार के एन. पी के साथ विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त चूहों के मौखिक संक्रमण gingivalis वायुकोशीय हड्डी 8 समर्थन दांत के विनाश में परिणाम है कि एक स्थानीय भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है. पी gingivalis 42 दिनों के बाद संक्रमण 8 और चूहों रोगाणु विशेष सीरम एंटीबॉडी titers 9 के उच्च स्तर को विकसित करने के लिए संक्रमित चूहों के मुंह से बरामद किया जा सकता है. - / - अपोलीपोप्रोटीन ई का उपयोग atherosclerosis के एक स्थापित माउस मॉडल में चूहों (ApoE - / -), पी के साथ मौखिक संक्रमण gingivalis महाधमनी साइनस 10 और अनामी धमनी 11 के भीतर भड़काऊ पट्टिका बयान कि ड्राइव जीर्ण सूजन लाती है. पी के अनामी धमनी के भीतर प्रगतिशील सूजन gingivalis चूहों विवो एमआरआई में उपयोग कर जीवित पशुओं में नजर रखी जा सकती -infected. पी से histologically, धमनी घावों gingivalis चूहों लिपिड accompa की वृद्धि संचय प्रदर्शन -infectedनाड़ी अन्तःचूचुक की सक्रियता, एक वृद्धि की प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ, और सूजन मध्यस्थों 12 की बुलंद अभिव्यक्ति द्वारा nied. पीटा चूहों में इस मॉडल का उपयोग मेजबान सिगनल उपकरणों और सूजन मध्यस्थों की भूमिका, साथ ही सेल पी ड्राइव कि विशेष बातचीत elucidated किया गया है 14 - gingivalis इम्युनोपैथोलोजी 12 -induced. इसके अलावा, परिभाषित बैक्टीरियल म्यूटेंट उपयोग प्रयोगों महत्वपूर्ण पी की पहचान की है gingivalis स्थानीय और प्रणालीगत साइटों 15 पर जीर्ण सूजन के लिए योगदान कारकों डाह.
यह लेख पी के आकलन के लिए तरीके का विवरण gingivalis स्थानीय और प्रणालीगत स्थलों पर जीर्ण सूजन -induced. हम Amira सॉफ्टवेयर का उपयोग कर microCT से वायुकोशीय हड्डी हानि के विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इसके अलावा, हम प्रगतिशील के आकलन में लिए विवो लाइव पशु एमआरआई में धारावाहिक की उपयोगिता को परिभाषितअनामी धमनी के भीतर flammation. हम दृश्य और धमनी घावों में भड़काऊ पट्टिका की मात्रा का ठहराव के लिए तरीके शामिल हैं, और उनकी ऊतकीय लक्षण वर्णन का वर्णन. ट्रांसजेनिक चूहों और परिभाषित बैक्टीरियल म्यूटेंट का उपयोग मेजबान और रोग की दीक्षा, प्रगति, और परिणाम में शामिल माइक्रोबियल कारकों दोनों की पहचान करने के लिए इस मॉडल को विशेष रूप से उपयुक्त बनाता है. इसके अतिरिक्त, मॉडल टीकाकरण और औषधीय हस्तक्षेप सहित उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों, के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Protocol
1 ग्रोथ और बैक्टीरिया की खेती
- पी की लकीर जमी शेयरों अवायवीय रक्त अगर प्लेटों पर gingivalis 381 और 3 के लिए सेते हैं - 37 डिग्री सेल्सियस पर एक anaerobic कक्ष (10% एच 2/10% सीओ 2/80% एन 2) में 5 दिन.
- 5 मिलीलीटर मस्तिष्क दिल अर्क शोरबा खमीर निकालने (0.5%), hemin (10 माइक्रोग्राम / एमएल), और menadione (1 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पूरक (भी) के तरल संस्कृतियों टीका लगाना थाली देसी जीवों का प्रयोग करें. ओ / एन वृद्धि के बाद, BHI की 45 मिलीलीटर में 5 मिलीलीटर संस्कृतियों हस्तांतरण.
- एक additional18 लिए anaerobically 50 मिलीलीटर तरल संस्कृतियों सेते हैं - देर लॉग चरण के मध्य में 24 घंटे और फसल. संस्कृति को ध्यान में पवित्रता हमेशा जानवरों में बैक्टीरिया शुरू करने से पहले ग्राम दाग द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए.
- 10 मिनट के लिए 7000 XG पर centrifugation द्वारा बैक्टीरिया हार्वेस्ट. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और अच्छी तरह से एक सीरम वैज्ञानिक pipet का उपयोग 5 मिलीलीटर पीबीएस में बैक्टीरियल सेल गोली resuspend. एक अतिरिक्त जोड़ें10 मिनट के लिए 7000 XG पर पीबीएस और अपकेंद्रित्र के 45 मिलीलीटर. तीन washes के एक कुल के लिए दो बार इस चरण को दोहराएँ.
- पिछले धोने के बाद, संस्कृति का एक 1:10 कमजोर पड़ने 660 एनएम (1 से 660 10 9 CFU / मिलीलीटर के बराबर है एक ओवर ड्राफ्ट) में 1.0 की एक ऑप्टिकल घनत्व है कि इस तरह के पीबीएस में सेल गोली resuspend. एक 2% w / वी समाधान प्राप्त करने के लिए पर्याप्त Carboxymethyl सेलूलोज़ (मध्यम viscocity) वजन (जैसे, संस्कृति के 5 मिलीलीटर प्रति 0.1 ग्राम). Clumping से बचने के लिए vortexing जबकि धीरे जीवाणु निलंबन को Carboxymethyl सेलूलोज़ जोड़ें.
2 मौखिक संक्रमण
नोट: चित्रा 1 में सचित्र के रूप में, उचित माउस मॉडल और मौखिक संक्रमण आहार, पी का उपयोग gingivalis जीर्ण सूजन और इम्युनोपैथोलोजी स्थानीय (मौखिक गुहा) में और प्रणालीगत साइटों (धमनियों) को प्रेरित करता है.
- Sulfamethoxazole प्रशासन (0.87 मिलीग्राम / एमएल) और trimethoprim (0.17 मिलीग्राम / एमएल) (Sulfatrim) 8 सप्ताह-O के लिए छह को2 सप्ताह के लिए उनके पीने के पानी में यथेच्छ एलडी पुरुष चूहों सामान्य वनस्पति को कम करने के लिए. एम्बर कांच की बोतलों में एंटीबायोटिक समाधान रखें और गिरावट को रोकने के लिए प्रकाश से बचाने के.
- एंटीबायोटिक समाधान की अवसादन से बचने के लिए, (सुबह और देर से दोपहर में, यानी) एक बार या दो बार दैनिक बोतलें हिला. 5 दिन - हर 3 एक हौसले से तैयार समाधान के साथ बदलें.
- दो सप्ताह के बाद, पारंपरिक पीने के पानी के साथ एंटीबायोटिक समाधान स्थानापन्न. पूर्व मौखिक संक्रमण से 2 दिन एंटीबायोटिक बाकी अवधि की अनुमति दें.
- पी लोड एक संलग्न खिला सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर टुबरकुलीन सिरिंज में gingivalis / वाहन निलंबन. मैन्युअल उनकी गर्दन के पीछे कूड़ा हथियाने द्वारा माउस को नियंत्रित. पकड़ माउस के सिर की गतिशीलता को प्रतिबंधित करने के लिए पर्याप्त फर्म है सुनिश्चित करें.
- पी के सामयिक आवेदन के द्वारा चूहों को संक्रमित maxillae के मुख सतह पर gingivalis. खिला सुई ऐसे था स्थितिटी सही दाढ़ की दाढ़ के मुख सतह के साथ गठबंधन और बैक्टीरिया निलंबन की 50 उल बेदखल कर रहा है. खिला सुई की गेंद का उपयोग कर 1 मिनट के लिए मसूड़ा साथ धीरे समाधान फैलाने.
- माउस छोड़ दिया मैक्सिला पर प्रक्रिया को दोहराने से पहले 30 सेकंड मिनट 1 के लिए की अवधि के लिए आराम करने के लिए अनुमति दें. नियंत्रण चूहों एंटीबायोटिक pretreatment और मौखिक gavage वाहन के साथ अकेले (पीबीएस में 2% carboxy मिथाइल सेलुलोज) प्राप्त होता है.
- 2 दिन के अंतराल पर चूहों 3 बार संक्रमण से वायुकोशीय हड्डी हानि प्रेरित स्थानीय स्थलों पर रोगज़नक़ प्रेरित जीर्ण सूजन की जांच करने के लिए. MicroCT द्वारा हड्डी नुकसान के मूल्यांकन के लिए 6 हफ्ते बाद चूहों बलिदान.
- 3 सप्ताह के लिए चूहों 5 बार एक सप्ताह - / - स्थानीय और प्रणालीगत स्थलों पर रोगज़नक़ प्रेरित जीर्ण सूजन की जांच करने के लिए, atherosclerosis की आशंका ApoE को संक्रमित.
नोट: अनामी धमनी में रोग की प्रगति को विवो में धारावाहिक एमआरआई द्वारा नजर रखी है. छवि विभिन्न समय बिंदुओं पर चूहों और 6-16 देर WKS बलिदानआर. बलिदान के समय, अंकित विश्लेषण एन से वैश्विक atherosclerotic बोझ का आकलन और microCT से वायुकोशीय हड्डी हानि का निर्धारण. ऊतक विज्ञान और immunohistochemistry द्वारा atherosclerotic घावों की विशेषताएँ.
3 टोमोग्राफी (microCT) माइक्रो अभिकलन
- नमूना तैयार करना
- वांछित समय बिंदु के बाद संक्रमण में चूहों बलिदान. सीओ 2 asphyxation द्वारा या संस्था के पशु सुविधा द्वारा अनुमोदित किसी अन्य विधि द्वारा चूहों euthanize.
नोट: कहीं 9 वर्णित के रूप में विरोधी P.gingivalis आईजीजी के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर हृदय पंचर, अलग सीरम, और दुकान से रक्त ले लीजिए. - खोपड़ी के आधार पर गंभीर माउस सिर को कत्ल कैंची की एक बड़ी जोड़ी का उपयोग करें. संदंश की एक जोड़ी के साथ मांस निकालें और 4% बफर paraformaldehyde के 30 मिलीग्राम से युक्त एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में खोपड़ी जगह है. 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटा - 24 के लिए नमूना ठीक करें.
- निर्धारण, rins बादअच्छी तरह से पीबीएस के साथ नमूना ई.
- दाढ़ की हड्डी ब्लॉक बायोप्सी बनाएँ.
- MicroCT द्वारा मूल्यांकन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊतकीय ग्रेड 70% EtOH में Hemi-मैक्सिला स्टोर.
- वांछित समय बिंदु के बाद संक्रमण में चूहों बलिदान. सीओ 2 asphyxation द्वारा या संस्था के पशु सुविधा द्वारा अनुमोदित किसी अन्य विधि द्वारा चूहों euthanize.
- छवि अधिग्रहण
- एक डेस्कटॉप microCT स्कैनर का उपयोग कर छवि अधिग्रहण प्रदर्शन करते हैं. 114 μA के एक मौजूदा और 70 केवी के एक वोल्टेज के लिए एक्स रे स्रोत सेट. इमेजिंग पोत में व्यक्तिगत Hemi-maxillae लोड और सभी तीन स्थानिक आयामों में 12 माइक्रोन के प्रस्ताव पर स्कैन.
नोट: इमेजिंग पोत के भीतर एक साथ कई Hemi-maxillae लोड करें. - उपयोगकर्ता प्रणाली का उपयोग कर छवि अधिग्रहण के लिए सीमाओं को चित्रित करना और ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र के लिए स्कैनिंग को प्रतिबंधित करने की अनुमति देता है कि एक प्रारंभिक कम संकल्प स्कैन प्रदर्शन.
नोट: तामचीनी की तीव्रता दाढ़ की दाढ़ का ताज आसानी से अलग पहचाना बनाता है. तीन दाढ़ और आसपास वायुकोशीय बॉन धरना के लिए एक गाइड के रूप में इमेजिंग सीमाओं दाढ़ शिथिल सेट का उपयोगई. इस समारोह में भी एक ही पोत के भीतर कई नमूने स्कैनिंग जब व्यक्ति Hemi-maxillae के बीच विभेद करने के लिए प्रयोग किया जाता है. - स्कैनिंग के पूरा होने पर, कच्चे छवि फ़ाइलें उच्च गुणवत्ता dicoms में (.ISQ) (.DCM) परिवर्तित.
- एक डेस्कटॉप microCT स्कैनर का उपयोग कर छवि अधिग्रहण प्रदर्शन करते हैं. 114 μA के एक मौजूदा और 70 केवी के एक वोल्टेज के लिए एक्स रे स्रोत सेट. इमेजिंग पोत में व्यक्तिगत Hemi-maxillae लोड और सभी तीन स्थानिक आयामों में 12 माइक्रोन के प्रस्ताव पर स्कैन.
- छवि विश्लेषण
इस प्रोटोकॉल में, छवि विश्लेषण एक डेटा दृश्य, प्रसंस्करण, और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाता है. सबसे पहले, cementoenamel जंक्शन (CEJ) के लिए सबसे अच्छा फिट का एक विमान बनाने के लिए रूपात्मक स्थलों का उपयोग करें. फिर वायुकोशीय हड्डी मात्रा के बाद माप के लिए एक मानक उन्मुखीकरण में Hemi-मैक्सिला को बदलने के लिए उपयोग करें.- सॉफ्टवेयर खोलें और पूल के ऊपर बाएं कोने में स्थित "ओपन डाटा" आइकन पर क्लिक करें. वैकल्पिक रूप से,> ओपन डाटा फ़ाइल का उपयोग करें.
- DICOM छवि ढेर चुने और लोड क्लिक करें. DICOM लोडर विंडो प्रकट होता है. ठीक क्लिक करें.
- पूल में एक हरे रंग आइकन के रूप में सेट डेटा का निरीक्षण. डेटा वस्तु पर क्लिक अतिरिक्त कारण बनता सूचना है कि लेकिनटन पूल के शीर्ष पर बटन क्षेत्र में प्रदर्शित किया जा सके. आइकन का चयन भी गुण एरिया में प्रदर्शित करने के लिए डेटा रिकॉर्ड के बारे में कुछ जानकारी का कारण बनता है.
- पूल में प्रत्येक चिह्न अलग मॉड्यूल का चयन किया जा सकता है, जिसमें से एक पॉपअप मेनू प्रदान करता है. डेटा आइकन के दाहिने हाथ कोने में सफेद तीर पर क्लिक करके पॉपअप मेनू को सक्रिय करें. प्रदर्शन मॉड्यूल के तहत, Isosurface (प्रदर्शन> Isosurface) का चयन करें. Isosurface चिह्न पूल क्षेत्र में दिखाई देगा. चयनित होने पर, अतिरिक्त सेटिंग्स गुण क्षेत्र में दिखाई देते हैं.
- पारदर्शी करने के लिए आकर्षित शैली और 2,000 सीमा निर्धारित. यकीन compactify बनाओ और downsample बटन विकल्प के तहत चयनित हैं. औसत के तहत, एक्स, वाई, जेड और सभी isosurface उत्पन्न करने के लिए लागू करें 2 क्लिक करने के लिए सेट कर रहे हैं.
नोट: 3D व्यूअर में Hemi-मैक्सिला की एक पारदर्शी 3 डी पुनर्निर्माण का निरीक्षण करें. छवि पुनर्निर्माण के लिए एक पारदर्शी ड्रॉ शैली का उपयोग करने का लाभ यह है कि दाढ़ की जड़ों सकते हैंआसानी से पहचाना जा. मानक उन्मुखीकरण में नमूना डाल जब यह महत्वपूर्ण होगा. - हरी डेटा आइकन का चयन करें और गुण क्षेत्र में फसल आइकन का चयन करें. आयामों और डेटा की निर्देशांक प्रदर्शित एक खिड़की को ध्यान से देखें. अब के लिए अलग सेट. एक bounding बॉक्स प्रत्येक कोने में हरे टैब के साथ 3D व्यूअर में प्रकट होता है कि नोटिस.
- दर्शक उपकरण पट्टी में बातचीत बटन का चयन करें. क्लिक करके और हरे रंग के कोनों पर खींचकर bounding बॉक्स के आकार को संशोधित करें. बॉक्स ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र शामिल हैं और जितना संभव हो उतना मृत अंतरिक्ष और मलबे को समाप्त सुनिश्चित करें. इस कंप्यूटर पर कम्प्यूटेशनल मांग कम हो जाएगा.
- पूरी तरह से bounding बॉक्स में शामिल होता है आरओआई सुनिश्चित करने 3D व्यूअर के भीतर वस्तु को घुमाने के लिए दर्शक उपकरण पट्टी में ट्रैकबॉल बटन का प्रयोग करें. संतुष्ट होने पर, चरण 8 में अलग सेट फसल खिड़की में ठीक क्लिक करें.
- (ओबी डेटा आइकन का चयन करें और प्रदर्शन मॉड्यूल के तहत तिर्यक स्लाइस चयनएस). (प्रदर्शन> OBS)
- OBS चुनें. गुण क्षेत्र में बेहतरीन मानचित्रण रैखिक प्रकार, -200 से 10,000 डेटा खिड़की सीमा, और नमूने निर्धारित किया है. अब विकल्प चुनें के तहत घुमाएगी. OBS के केंद्र में एक घुमाएँ टॉगल निरीक्षण.
- दर्शक उपकरण पट्टी में बातचीत बटन का चयन करें और टुकड़ा के काटने के विमान को समायोजित करने के लिए टॉगल के हैंडल का उपयोग करें. दांत की occlusal सतह को दांतों की जड़ों को और सीधा समानांतर चलता है कि एक बाण के समान विमान बनाएँ. चित्रा 2 में सचित्र के रूप में विमान, तीन दाढ़ (एम 1 एम 3) दोटूक करना चाहिए.
- बारी बारी से बंद करें और OBS (वस्तु> नकली वस्तु) डुप्लिकेट. एक नए OBS OBS 2 के लिए OBS घुमाएँ पर पर 2 मुड़ें नामित प्रकट होता है.
- यह OBS 1 के साथ सीधा है कि इतनी OBS 2 को नई दिशा घुमाएँ संभाल प्रयोग (चित्रा 2 देखें).
- बारी OBS 2 के लिए बंद बारी बारी से और 3 डुप्लिकेट स्लाइस बनाने. ये OBS 3, 4, और 5 नाम दिया जाएगा.
- सबसे अच्छा फिट की उड़ान के लिए अंक उठा
नोट: CEJ सबसे अच्छा फिट का एक विमान बनाता है साथ कदम 8 अंक के स्थान का वर्णन 3.4.1-3.4.5. बाण के समान स्लाइस और राज्याभिषेक स्लाइस से अन्य चार से अंक की चार चुनें (चित्रा 3 देखें). 3.4.6 में बाण के समान स्लाइस पर स्थित अंक उठा है, यह OBS 1 समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है.- बाण के समान विमान में एम 1 के सबसे बीच का रूट के केंद्र के साथ OBS 1 संरेखित करें. राज्याभिषेक विमान में एम 1 के सबसे बीच का रूट के केंद्र के साथ OBS 2 संरेखित करें.
- राज्याभिषेक विमान में एम 1 के Bucco-बाहर का रूट के केंद्र के साथ OBS 3 संरेखित करें. यदि आवश्यक हो, चरण 20 में अंक का चयन करते समय यह लगभग saggital विमान में एम 1 के Bucco-बाहर का रूट के साथ केंद्रित है ताकि OBS 1 समायोजित.
- M2 के मुख जड़ों की विशाखन साथ OBS 4 संरेखित करें. OBS 4 M2 के Bucco-बीच का और Bucco-बाहर जड़ों के बीच केंद्रित किया जाना चाहिए. यदि आवश्यक हो, OBS 1 यह लगभग केंद्रित है ताकि बुद्धि को समायोजितबाण के समान विमान में M2 के घंटे Bucco-बाहर का रूट चरण 20 में अंक का चयन करते समय
- यह राज्याभिषेक विमान में एम 3 के केन्द्र नीचे चलता है कि इतनी OBS 5 समायोजित करें. यदि आवश्यक हो, चरण 20 में अंक का चयन करते समय यह लगभग बाण के समान विमान में एम 3 की सबसे बाहर का रूट के साथ केंद्रित है ताकि OBS 1 समायोजित.
- OBSs (OBS 6) में से किसी एक नकली और गुण विंडो में अंक के लिए फिट का चयन करें. अंक को चालू करने के लिए फिट 2 डी या 3 डी पर 3 या अधिक अंक लेने के लिए शोधकर्ता दर्शक के भीतर वस्तुओं और फिर सबसे अच्छा फिट का एक विमान की गणना करता है. इस मामले में, पिछले चरणों में वर्णित 2 डी OBSs CEJ साथ 8 अंक का चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- डेटा आइकन के दाहिने हाथ कोने में नारंगी बॉक्स पर क्लिक करके 3D व्यूअर से OBS 6 छुपाएं. सभी 2 डी स्लाइस पर CEJ दृश्यमान बनाने के लिए 3D व्यूअर से isosurface छुपाएं. पारी क्लिक करें और ऊपर वर्णित के रूप में CEJ साथ 8 अंक का चयन करें.
नोट: जब चयन शिफ्ट कुंजी नीचे आयोजित नहीं कर रहा हैअंक, एक विमान स्वतः पहले तीन अंक के बाद की गणना की जाएगी. - सभी 8 अंक चयन करने के बाद, OBS 6 दिखाई दे रही है. यह लगभग occlusal विमान के समानांतर चलता है कि एक अक्षीय टुकड़ा है कि ध्यान दें.
- परिवर्तन और पुनरभिविन्यास नोट: सबसे अच्छा फिट का विमान बाद में बड़ा माप के लिए एक मानक उन्मुखीकरण में डेटा को बदलने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- डाटा आइकन> कंप्यूट> ApplyTransform क्लिक करें. ApplyTransform आइकन पूल क्षेत्र में दिखाई देता है. ApplyTransform आइकन, का चयन संदर्भ के कोने में सफेद वर्ग क्लिक करें, और OBS 6 पर क्लिक करें.
- गुण क्षेत्र में, का चयन करें प्रक्षेप विधि के लिए मानक और मोड के लिए बढ़ा दिया. परिवर्तन लागू करें.
- एक isosurface और नई डेटा फ़ाइल के लिए एक राज्याभिषेक OBS बनाएँ. यह (चित्रा 2 में दिखाया गया है) एम 1 के साथ लगभग सीधा है कि इस तरह के अक्षीय दिशा में OBS घुमाएँ. दाढ़ की cusps और occlusal सी का उपयोगएक गाइड के रूप में urvatures.
- कदम 3.5.1 और 3.5.2 के रूप में डेटा को बदलने के लिए इस विमान का उपयोग करें. तब्दील डेटा फ़ाइल सहेजें.
- विभाजन और अस्थि मात्रा माप
नोट: नीचे दिए गए चरणों वायुकोशीय हड्डी के विभाजन और माप का वर्णन. CEJ के लिए सबसे अच्छा फिट के विमान को इसी टुकड़ा की पहचान की है और एक संदर्भ विमान को चुना है. CEJ और molars के मुख चेहरे पर संदर्भ विमान के बीच वायुकोशीय हड्डी खंडों और मापा जाता है. एम 1 के सबसे बीच का रूट और एम 3 की सबसे बाहर का रूट के रूप में समापन बिंदु स्थलों की सेवा. 15-20 स्लाइस CEJ नीचे संदर्भ विमान स्थापना इष्टतम परिणाम पैदावार. अतिरिक्त स्लाइस का समावेश है कि मास्क उपचार समूहों के बीच अस्थि मात्रा में मतभेद परिवर्तनशीलता परिचय.- विभाजन संपादक खोलें और तब्दील डेटा के लिए एक नया लेबल बनाने.
- एक नई सामग्री बनाने के लिए और यह वायुकोशीय हड्डी नाम है.
- ज़ूम और डाटा खिड़की के नीचे, डेटा fro सीमा निर्धारितएम 10,000 -200.
- प्रदर्शन और मास्किंग के तहत 2 डी crosshair, 3 डी MPR, और 3 डी मात्रा प्रतिपादन प्रतीक का चयन करें. 2500 से 8000 तक डेटा सीमा निर्धारित करें. डेटा मास्किंग सक्षम करें.
- दर्शक उपकरण पट्टी से सेटिंग चार दर्शकों ने प्रदर्शन का चयन करें. प्रदर्शन saggital, राज्याभिषेक, और अक्षीय छवि के ढेर के एक साथ परीक्षा है, साथ ही 3 डी गाया मात्रा की अनुमति चार quadrants में विभाजित है.
- तामचीनी एम 1 और एम 3 के मुख चेहरे पर दिख रहा है जहां पिछले टुकड़ा की पहचान करने के लिए सभी चार quadrants का प्रयोग करें. इस स्थान CEJ के लिए सबसे अच्छा फिट के विमान से मेल खाती है. अक्षीय टुकड़ा संख्या रिकार्ड.
- अक्षीय विमान में, वायुकोशीय हड्डी शिखा की ओर 15-20 स्लाइस जारी है. इस संदर्भ विमान का प्रतिनिधित्व करता है.
- CEJ और संदर्भ विमान के बीच दाढ़ के मुख चेहरे पर वायुकोशीय हड्डी का चयन करने के लिए विभाजन उपकरण के किसी भी संयोजन का उपयोग करें. एम 1 के सबसे बीच का रूट और समापन बिंदु स्थलों के रूप में एम 3 की सबसे बाहर का रूट का प्रयोग करें.
- वस्तु पूल पर लौटें. एक्सटेंशन ".Labels" के साथ एक नया प्रतीक छवि डेटा आइकन के साथ संलग्न किया जाना चाहिए. लेबल आइकन का चयन करें और ड्रॉप मेनू में> MaterialStatistics सामग्री का चयन.
- गुण क्षेत्र में, सामग्री का चयन करें और लागू मारा. एक मेज सामग्री सूची में प्रत्येक सामग्री के लिए कई मापदंडों प्रदर्शित दिखाई देता है. वायुकोशीय हड्डी की मात्रा रिकॉर्ड.
Atherosclerosis की 4 आकलन
- महाधमनी विच्छेदन
- वांछित समय बिंदु के बाद संक्रमण पर सीओ 2 asphyxiation द्वारा माउस बलिदान.
- नीचे पृष्ठीय पक्ष, टेप पर माउस प्लेस और 70% EtOH के साथ माउस पोंछे. करने के लिए सिर्फ xyphoid प्रक्रिया ऊपर पेट के बीच में से उदर पक्ष पर त्वचा में कटौती.
- Xyphoid प्रक्रिया दिखाई देता है जब तक पेट की त्वचा में कटौती. एक छोटे से देहात के साथ xyphoid प्रक्रिया लिफ्टसंदंश का आईआर, रिब पिंजरे के दोनों तरफ कटौती करने, और डायाफ्राम काटा. तो दिल को बेनकाब करने के लिए रिब पिंजरे के दोनों ओर नीचे दो कटौती कर.
- सही वेंट्रिकल के शीर्ष में रखा एक 27 जी इंसुलिन सिरिंज का उपयोग माउस रक्तहीन करना. रक्त संग्रह के दौरान समय समय पर निलय दीवार से खोलने के अवरुद्ध रोकने के लिए सुई बारी बारी से. आमतौर पर, 0.8 - रक्त के 1 मिलीलीटर इस विधि का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है.
- समर्थन> नोट: विरोधी P.gingivalis आईजीजी के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर अलग सीरम और दुकान 9 कहीं वर्णित के रूप में
- सही अलिंद को दूर करने के लिए कैंची का प्रयोग करें.
- दिल के पीछे तरफ बाएं वेंट्रिकल जानें. चैंबर के केंद्र का सामना करना पड़ सुई का उठाव साथ, बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष में एक 21 जी सुई का परिचय और धीरे से 3 के साथ संचार प्रणाली फ्लश - ऊतक लगानेवाला के 5 मिलीलीटर.
- दिल के आसपास ट्रिम वसा और थाइमस.
- लू निकालेंNGS.
- तीन शाखाओं के साथ महाधमनी चाप जानें और बेहतर प्रदर्शन के लिए आसपास के वसा परतों दूर स्पष्ट.
- डायाफ्राम के आधार पर चाप से महाधमनी की विच्छेदन जारी रखें.
- जिगर निकालें और अवरोही महाधमनी का पर्दाफाश करने के लिए आंतों ऊतक विस्थापित. गुर्दे की धमनी शाखाओं को नीचे बाहर का महाधमनी काटना.
- गुर्दे धमनियों कट और ileal विभाजन करने के लिए नीचे विच्छेदन जारी है.
- महाधमनी सबसे संयोजी ऊतक से मुक्त होने के बाद, महाधमनी के शीर्ष पर लौटें और दिल से ऊपर महाधमनी बंद तीन शाखाओं के बहुत शीर्ष भाग धज्जी.
- पील दिल उर्ध्व, शरीर से दिल को अलग करने के क्रम में अंतर्निहित वसा ऊतकों snipping.
- संदंश के साथ दिल पकड़ो और अभी भी संलग्न किया जा सकता है कि संयोजी ऊतक काटने, ऊपर की ओर खींच, और गुर्दे के लिए नीचे जारी है और पैरों के नीचे का पालन करें और संभव निम्नतम बिंदु पर कटाव.
- एक subse साथ 1 घंटे के लिए 10% formalin में महाधमनी फिक्सquent पीबीएस 1hr के लिए धो लो. वैकल्पिक रूप से, 10 formalin% ओ / एन में दुकान महाधमनी, अगले दिन पीबीएस में कुल्ला और विच्छेदन के साथ जारी है.
- पीबीएस युक्त एक 10 सेमी पेट्री डिश में जगह महाधमनी.
- एक विदारक गुंजाइश का उपयोग करना, ध्यान से महाधमनी से adventitial ऊतक को हटा दें.
- महाधमनी अतिरिक्त चर्बी और ऊतक से मुक्त है, जब दिल की गहराई दो तिहाई काट दिया. दूर महाधमनी चाप से दिल के सामने के अंत में हृदय की मांसपेशी छीलने शुरू करो. महाधमनी के बल्ब धीरे धीरे रंग में सफेद हो जाएगा, जो दिखाई देनी चाहिए.
- महाधमनी बल्ब दिल की मांसपेशियों के ऊतकों के लिए स्वतंत्र हैं, जब तक दो संदंश का उपयोग सावधान विच्छेदन जारी रखें.
- एक काले विदारक ट्रे में साफ महाधमनी प्लेस और पीबीएस के साथ कवर किया.
- महाधमनी के लगाए
- लगाए भर पीबीएस में शामिल महाधमनी रखें.
- छोड़ दिया पर महाधमनी के बल्ब के साथ शारीरिक स्थिति में महाधमनी निर्धारित करना.
- तीसरे नीचे 1 से शुरू 5 स्थानों) महाधमनी के ऊपर, 2) में अस्थायी minutien पिंस रखेंमेहराब की शाखा, ऊरु धमनी की शाखा से ऊपर महाधमनी 5) उतरते के निचले अंत निकट महाधमनी 4) उतरते 3) मिडवे.
- अतिरिक्त ठीक वसंत कैंची का प्रयोग, आरोही महाधमनी के नीचे निम्नतम शाखा को महाधमनी अप करने के लिए सभी तरह ऊरु धमनी के बाईं शाखा से शुरू, महाधमनी के बाईं ओर को काटा.
- दरार में सबसे कम महाधमनी बल्ब की बाई ओर की ओर से कट और महाधमनी के ऊर्ध्वाधर कटौती के साथ कटौती के चौराहे तक पहुंचने की कटौती जारी है.
- महाधमनी में कटौती क्षैतिज आरोही महाधमनी की सबसे कम शाखा के बिंदु तक पहुंचने के लिए
- महाधमनी के ऊपर उच्चतम शाखा की दाहिनी ओर ऊपर की तरफ कट.
- इसकी भीतरी सतह को बेनकाब करने के लिए प्रत्येक शाखा काटें.
- अस्थायी पिन के कुछ निकालें और, तह बिना शारीरिक स्थान में सभी महाधमनी नीचे लगाए महाधमनी की खींच के लक्ष्य के साथ स्थायी पिन के साथ बदलें. लक्ष्य महाधमनी की भीतरी सतह को बेनकाब करने के लिए है.
- महाधमनी के सभी भीतरी सतह दृश्य पूर्णांक से मुक्त अवगत कराया और ऊपर से स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है और जब तक लगाए जारी रखेंपिन से erference.
- लिपिड धुंधला और घाव मात्रा
- सूडान चतुर्थ धुंधला समाधान (5 मिलीग्राम / एमएल 70% isopropanol में) तैयार करें. अच्छी तरह मिक्स और कोई क्रिस्टल मौजूद हैं सुनिश्चित करने के लिए फिल्टर.
- 50 मिनट के लिए सूडान चतुर्थ समाधान में कवर टिकी महाधमनी.
- 5 मिनट - 1 के लिए 70% isopropanol के साथ धोएं. महाधमनी से आ रही पानी नहीं रह लाल है जब तक धीरे ddH20 साथ महाधमनी कुल्ला.
- पीबीएस के साथ महाधमनी कवर. एक विदारक माइक्रोस्कोप से जुड़ी एक उच्च संकल्प कैमरा के साथ महाधमनी की छवियों पर कब्जा करने और बचाने के रूप में डिजिटल छवि फ़ाइलों (.TIFF). अंशांकन में सहायता के लिए प्रत्येक छवि के बगल में एक शासक रखें.
- घावों की intima और क्षेत्र के क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए ImageJ सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें. मैन्युअल क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए intimal सतह का पता लगा. घाव क्षेत्र स्वचालित रंग thresholding उपयोग कर की गणना की जा सकती है. यह सामान्य क्षेत्रों से घावों भेदभाव कि एक रंग तीव्रता को परिभाषित करने के लिए एक सीमा स्थापित करने की आवश्यकता है.
- के प्रतिशत की गणनाatherosclerotic घावों द्वारा कवर intimal सतह.
Atherosclerotic घावों के 5 Histological आकलन
- हृदय के ऊतकों के साथ महाधमनी चाप फसल और एक डिस्पोजेबल आधार मोल्ड में अक्टूबर में विसर्जित कर दिया.
- 5 माइक्रोन धारावाहिक cryosections -17 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक cryostat का उपयोग महाधमनी साइनस और अनामी धमनी में हर 50 माइक्रोन लीजिए और खुर्दबीन स्लाइड पर ऊतक वर्गों माउंट. स्टोर आगे उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड.
- Hematoxylin और eosin उचित प्रक्रिया का उपयोग कर के साथ ऊतकीय मूल्यांकन, दाग के लिए.
Atherosclerotic घावों के 6 Immunohistochemical विशेषता.
एक सामान्य प्रतिरक्षी आधारित प्रोटोकॉल नियमित कार्यरत रूपरेखा नीचे चरणों पी में atherosclerotic घावों का आकलन करने के लिए gingivalis चूहों -infected. इस प्रोटोकॉल प्रत्येक एंटीबॉडी या अभिकर्मक के लिए अनुकूलन की आवश्यकता है.
- फ्रीजर से स्लाइड्स निकालें और तयठंडा लगानेवाला (एसीटोन या अन्य लगानेवाला) में 2 मिनट के लिए.
- स्लाइड आरटी के लिए आते हैं और एक विलायक प्रतिरोधी कलम के साथ लेबल करने की अनुमति दें.
- कुल्ला ऊतक ठंड मैट्रिक्स दूर करने के लिए पीबीएस में 3x स्लाइड
- 10 मिनट के लिए 0.3% एच में पीबीएस में 2 हे 2 समाधान स्लाइड incubating द्वारा अंतर्जात peroxidase गतिविधि ब्लॉक.
- कुल्ला 2 मिनट प्रत्येक समय के लिए पीबीएस में 3x स्लाइड.
- आरटी पर 30 मिनट के लिए बफर (पीबीएस में 10% खरगोश सीरम) अवरुद्ध में incubating द्वारा गैर विशिष्ट बंधनकारी ब्लॉक.
- 10% खरगोश सीरम में प्राथमिक एंटीबॉडी 01:50 पतला.
- स्लाइड पर ऊतक वर्गों को पतला एंटीबॉडी लागू करें.
- आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
- कुल्ला 2 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस में 3x स्लाइड.
- 100% 10 में खरगोश सीरम: माध्यमिक एंटीबॉडी 1 biotinylated विरोधी चूहे पतला.
- स्लाइड पर ऊतक वर्गों के लिए लागू करें और आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
- कुल्ला 2 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस में 3x स्लाइड.
- जोड़कर थपका सब्सट्रेट समाधान तैयारहर 1 मिलीलीटर थपका बफर को थपका वर्णकोत्पादक की 1 ड्रॉप.
- स्लाइड से पीबीएस नाली और थपका सब्सट्रेट समाधान लागू होते हैं. स्लाइड 5 मिनट के लिए या इच्छित रंग तीव्रता तक पहुँच जाता है जब तक सेते दें.
- 2 मिनट प्रत्येक के लिए पानी में धो 3x.
- Hematoxylin के साथ काउंटर दाग.
- शराब की 4 परिवर्तन (95% 1 मिनट, 95% 1 मिनट, 100% 1 मिनट और 100% 5 मिनट) के माध्यम से निर्जलीकरण.
- XYLENE के 3 परिवर्तन में साफ.
- बढ़ते समाधान का उपयोग coverslip और माइक्रोस्कोपी द्वारा गुणात्मक विश्लेषण. मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, छवियों के अधिग्रहण और एक स्वचालित सीमा का उपयोग कर ImageJ साथ धुंधला क्षेत्र की गणना.
7 एमआरआई
- एमआरआई के लिए पशु तैयारी
- एमआरआई प्रयोगों से पहले चूहों anesthetize. एक प्रेरण कक्ष में 2-3 मिनट के लिए 4% वाष्पीकृत isofluorane का उपयोग करके संज्ञाहरण की प्रारंभिक प्रेरण प्रदर्शन करना. 0.5 की एक सतत प्रवाह का उपयोग इमेजिंग अवधि के दौरान संज्ञाहरण बनाए रखें - 2% isofluorane delivere वाष्पीकृतएक नाक शंकु सेटअप या नकाब के माध्यम से डी.
- संज्ञाहरण (यानी, कोई पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया) की शल्य चिकित्सा विमान तक पहुँचने के बाद, एक नाक शंकु में डाला अपनी नाक के साथ एक जानवर धारक में माउस जगह है. इमेजिंग के दौरान संभावित आंदोलन को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पशु धारकों के कई प्रकार हैं. हम एक काटने पट्टी के साथ एक कस्टम डिजाइन धारक का उपयोग करें.
- श्वसन और हृदय चक्र की निगरानी और छवि अधिग्रहण एक छोटे पशु निगरानी और gating प्रणाली से सुसज्जित (माउस के पेट पर रखा) एक श्वसन तकिये का प्रयोग करने के साथ सिंक्रनाइज़.
- प्रयोगशाला फिल्म के साथ पशु धारक पर माउस और निगरानी प्रणाली सुरक्षित.
- एमआरआई डाटा अधिग्रहण
- एक 30 मिमी खड़ी जांच (माइक्रो 2.5) में एक लापरवाह स्थिति में पहले माउस के सिर के साथ पशु धारक जगह 23 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा और में 11.7 टी एमआरआई स्कैनर ऊर्ध्वाधर बोर.
- टी के केंद्र के साथ धारक संरेखितवह कुंडल आरएफ.
- एक एकल पल्स अनुक्रम का उपयोग कर एक shimming प्रक्रिया का संचालन.
- एक दुर्लभ दृश्य का उपयोग कर, अक्षीय राज्याभिषेक, और बाण के समान चित्र बनाने के लिए तीन orthogonal झुकाव साथ स्काउट छवियों को प्राप्त.
- एक कम संकल्प चुंबकीय अनुनाद एंजियोग्राफी (एमआरए) निम्नलिखित मानकों के साथ एक ungated 3 डी ढाल गूंज अनुक्रम का उपयोग कर प्रदर्शन करना: पटिया मोटाई = 1.5 सेमी; फ्लिप कोण = 45 °; पुनरावृत्ति समय = 20 एमएस; गूंज समय = 2.2 एमएस; देखने के क्षेत्र = 1.5 × 1.5 × 1.5 सेमी; मैट्रिक्स = 64 × 64 × 64; औसत = 1 कुल स्कैन समय की संख्या: 2~3 मिनट. इस स्कैन के उद्देश्य छवियों लक्ष्य क्षेत्र (अनामी धमनी) में प्राप्त कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए है.
- निम्नलिखित मानकों का उपयोग कर एक ungated 3 डी ढाल गूंज अनुक्रम साथ अनामी धमनी की एक उच्च संकल्प MRA प्रदर्शन करना: पटिया मोटाई = 1.5 सेमी; फ्लिप कोण = 45 °; पुनरावृत्ति समय = 20 एमएस; गूंज समय = 2.2 एमएस; देखने के क्षेत्र = 1.5 × 1.5 × 1.5 सेमी; मैट्रिक्स = 128 &# 215; 128 × 128; औसत = 4 कुल स्कैन समय की संख्या ~25 मिनट था.
- अवजत्रुकी द्विभाजन नीचे अनामी धमनी 0.5mm की निरंतर अक्षीय छवियों प्राप्त करते हैं.
- एमआरआई डेटा विश्लेषण
- स्कैनर के साथ जुड़े इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवि पुनर्निर्माण और विश्लेषण प्रदर्शन. अधिकतम तीव्रता प्रोजेक्शन द्वारा MRA छवियों की 3 डी पुनर्निर्माण पाना.
- विभिन्न चूहों या अलग अलग समय बिंदुओं पर एक ही माउस से प्राप्त डेटा के लिए पंक्ति में एक संरचनात्मक मार्कर के रूप में अवजत्रुकी विभाजन का प्रयोग करें. Subclavianbifurcation नीचे 0.5 मिमी दूरी के 0.3- पर अनामी धमनी का लक्ष्य पार अनुभाग चुनें.
- परिभाषित करें और ImageJ के साथ चुना क्रॉस सेक्शन की luminal क्षेत्र की गणना. माप दो स्वतंत्र पर्यवेक्षकों द्वारा एक अंधा फैशन में प्रदर्शन किया जाना चाहिए. Interclass सहसंबंध गुणांक की गणना के द्वारा माप reproducibility सत्यापित करें.
- धारावाहिक imag साथ अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिएआईएनजी, प्रत्येक माउस के लिए आधारभूत (अध्ययन में बहुत पहले कर सकते हैं) पर प्राप्त लुमेन के क्षेत्र को luminal क्षेत्र मानक के अनुसार. समय के साथ luminal क्षेत्र में परिवर्तन के रूप में परिणाम व्यक्त करें.
- उपयुक्त सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन (यानी, छात्र टी परीक्षण) प्रयोगात्मक समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर को निर्धारित करने के लिए.
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Representative Results
उपयुक्त माउस मॉडल और मौखिक संक्रमण आहार, पी का उपयोग gingivalis जीर्ण सूजन और इम्युनोपैथोलोजी स्थानीय (मौखिक गुहा) में और प्रणालीगत साइटों (धमनियों) (चित्रा 1) लाती है.
चूहे, पी के साथ मौखिक संक्रमण gingivalis वायुकोशीय हड्डी 8 समर्थन दांत के विनाश कि ड्राइव एक स्थानीय भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है. पी gingivalis चूहों मुख्य रूप आईजीजी निर्धारण 9 की हैं कि इस जीव को सीरम एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं विकसित -infected. चित्रा 4 में दिखाया परिणाम C57BL 6 / दो दिन के अंतराल पर P.gingivalis के साथ तीन बार संक्रमित और microCT से वायुकोशीय हड्डी नुकसान के आकलन के लिए 6 हफ्ते बाद बलिदान किया गया जिसमें एक प्रयोग के प्रतिनिधि हैं. अमीरा सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बड़ा विश्लेषण है कि पी का पता चलता है gingivalis -infected चूहों (असंक्रमित नियंत्रण के साथ तुलना चित्रा -4 ए महत्वपूर्ण हड्डी हानि प्रदर्शन). नियंत्रण (4B चित्रा और चित्रा 4C) की तुलना में खंगाला Hemi-maxillae का दृश्य निरीक्षण संक्रमित चूहों में दाढ़ जड़ों के उजागर सतह क्षेत्र में वृद्धि दिखाता है.
पी, चूहे - / - atherosclerosis की आशंका ApoE में gingivalis महाधमनी साइनस 15 और अनामी धमनी 11 के भीतर वायुकोशीय हड्डी हानि 12 और भड़काऊ पट्टिका बयान कि ड्राइव जीर्ण सूजन लाती है. पी gingivalis atherosclerosis के रूप में जल्दी के रूप में 24 बजे अंतिम संक्रमण के बाद और पूर्व संक्रमण 16 को टीकाकरण से रोका जा सकता होती है -induced. पी के अनामी धमनी में प्रगतिशील सूजन gingivalis बाद संक्रमण (चित्रा 5) अंक. सूडान चतुर्थ दाग aortas के एन अंकित माप यह दर्शाता है कि चूहों विभिन्न समय पर विवो एमआरआई में धारावाहिक से लाइव चूहों में नजर रखी जा सकती -infected पी gingivalisसंक्रमण काफी लिपिड बयान और intimal सतह पर lesional क्षेत्र (चित्रा 6) बढ़ जाती है. बलिदान, ऊतक विज्ञान और immunohistochemistry के समय गुणात्मक या मात्रात्मक सेलुलर संरचना, विभिन्न एंटीजन की अभिव्यक्ति, और लिपिड सामग्री के संदर्भ में atherosclerotic घावों को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. महाधमनी साइनस घावों के immunohistochemical विश्लेषण पी में वृद्धि बृहतभक्षककोशिका घुसपैठ और सहज प्रतिरक्षा रिसेप्टर टोल की तरह रिसेप्टर 2 (TLR2) का ऊंचा अभिव्यक्ति का पता चलता है gingivalis -infected चूहों (चित्रा 7).
चित्रा 1 पी gingivalis स्थानीय और प्रणालीगत स्थलों पर जीर्ण सूजन -induced. पहले पी के साथ संक्रमण के लिए gingivalis चूहों administe हैं एक दो दिन एंटीबायोटिक बाकी अवधि के बाद 10-14 दिनों के लिए उनके पीने के पानी में लाल एंटीबायोटिक दवाओं यथेच्छ. एंटीबायोटिक उपचार स्वदेशी मौखिक वनस्पति दबा और उपनिवेशवाद की सुविधा. वायुकोशीय नुकसान की प्रेरण के लिए, चूहों दो दिन के अंतराल पर तीन बार संक्रमित हैं और वायुकोशीय हड्डी मात्रा 6 सप्ताह के बाद संक्रमण मापा जाता है. Atherosclerosis, आकलन जब atherosclerosis की आशंका ApoE - / - चूहों आमतौर पर 3 सप्ताह के लिए 5 बार एक हफ्ते संक्रमित और 16-24 सप्ताह के बाद संक्रमण बलिदान कर रहे हैं. लाइव चूहों की अनामी धमनी के भीतर प्रगतिशील सूजन विभिन्न समय पर विवो एमआरआई में धारावाहिक से मापा जा सकता है के बाद संक्रमण अंक. प्रोटोकॉल और immunohistochemistry इमेजिंग डेटा को मान्य करने के लिए प्रयोग की समाप्ति पर लिपिड और भड़काऊ कोशिकाओं के लिए दाग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बलिदान के समय, वायुकोशीय हड्डी हानि microCT से मापा जाता है और वैश्विक atherosclerotic बोझ पूरे aortas का चेहरा धुंधला एन द्वारा मूल्यांकन किया है. https://www.jove.com/files/ftp_upload/51556/51556fig1highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
OBS 1 और OBS तीन दाढ़ (एम 1 एम 3) चिह्नित कर रहे हैं और प्रासंगिक anatomically शब्दावली संकेत दिया है 2 की स्थिति illustrating चित्रा 2 माउस Hemi-मैक्सिला. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
5 के माध्यम से OBS 1 की स्थिति illustrating चित्रा 3 माउस Hemi-मैक्सिला.1556 / 51556fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
MicroCT द्वारा मापा के रूप में चित्रा 4 वायुकोशीय हड्डी हानि. पुरुष C57BL 6 / मौखिक रूप से पी से संक्रमित थे gingivalis या वाहन अकेले (असंक्रमित) और वायुकोशीय हड्डी मात्रा. microCT 6 हफ्ते बाद अमीरा का उपयोग द्वारा मूल्यांकन (ए) वायुकोशीय हड्डी मात्रा असंक्रमित और पी से Hemi-maxillae में किया गया था gingivalis C57BL 6 / -infected. परिणाम संदर्भ विमान ऊपर की हड्डी मात्रा (CEJ से 120 माइक्रोन) का प्रतिनिधित्व करते हैं. डाटा समूह प्रति N = 8 चूहों से हड्डी मात्रा एसडी के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. *** पी <0.001, असंक्रमित नियंत्रण की तुलना में. (बी) और (सी) असंक्रमित (बी) से Hemi-maxillae के प्रतिनिधि 3D पुनर्निर्माणऔर पी gingivalis (सी) चूहों -infected. वायुकोशीय हड्डी मात्रा में एक महत्वपूर्ण कमी पी में देखा जा सकता है असंक्रमित नियंत्रण की तुलना में जब gingivalis चूहों -infected. दिखाई हड्डी हानि पी में होता है जहां arrowheads क्षेत्रों का संकेत gingivalis -infected चूहों (दाढ़ जड़ों के उजागर सतह क्षेत्र में वृद्धि पर ध्यान दें). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
पी निम्नलिखित अनामी धमनी के भीतर 5 चित्रा प्रगतिशील सूजन gingivalis संक्रमण एमआरआई द्वारा मापा के रूप में महाधमनी चाप और एक ApoE के प्रमुख वाहिकाओं (ए) प्रतिनिधि चुंबकीय अनुनाद (एमआर) एंजियोग्राम. -/ -. अपने विभाजन के नीचे एक माउस, 0.3mm की अनामी धमनी की एक में पीले रंग की लाइन से माउस (बी) अक्षीय एमआर छवि. अनामी धमनियों आधारभूत MRA ने उतारी गई और 12 और 16 सप्ताह के बाद संक्रमण. (सी) luminal क्षेत्र में अस्थायी परिवर्तन (2 मिमी) में व्यक्तिगत चूहों (एन = 10-12 / समूह) के लिए गणना की गई. असंक्रमित ApoE - / - (नीला), पी - / - gingivalis ApoE -infected. (लाल) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
पूरे महाधमनी में lesional क्षेत्र की 6 चित्रा एन चेहरा दृढ़ संकल्प. (ए) महाधमनी <की सूडान चतुर्थ धुंधलाचेहरा घावों पी के साथ 16 सप्ताह के बाद संक्रमण एन उन्हें> gingivalis. (बी) असंक्रमित (सफेद चिह्न) की कुल महाधमनी के भीतर लिपिड सामग्री की मात्रा और पी gingivalis -infected चूहों (काला चिह्न) (एन = 10-13 / समूह). लिपिड के कब्जे में महाधमनी का प्रतिशत ImageJ का उपयोग गणना की गई. * पी <0.05. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
महाधमनी साइनस घावों की 7 चित्रा Immunohistochemical विश्लेषण नर ApoE -. / - चूहों एक सामान्य चाउ आहार खिलाया पी से संक्रमित थे gingivalis या और असंक्रमित 16 सप्ताह के बाद संक्रमण का बलिदान. महाधमनी साइनस से प्राप्त cryosections विरोधी के साथ दाग रहे थेमाउस F4 / 80 और TLR2. स्केल बार, 100 माइक्रोन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
पी gingivalis मौखिक संक्रमण मॉडल स्थानीय और प्रणालीगत स्थलों पर रोगज़नक़ प्रेरित जीर्ण सूजन के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है. यह अनूठा मॉडल जीर्ण सूजन और इम्युनोपैथोलोजी के लिए योगदान दोनों मेजबान और रोगज़नक़ विशिष्ट तंत्र के लक्षण वर्णन अनुमति देता है. इसके अलावा, मॉडल टीकाकरण और औषधीय हस्तक्षेप सहित उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों, के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित चरणों पी की दीक्षा, प्रगति, और परिणाम का आकलन करने के लिए इस मॉडल को और विस्तार के तरीके के सफल प्रयोग का वर्णन gingivalis जीर्ण सूजन -induced.
भड़काऊ हड्डी नुकसान की जांच करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय मन में रखने के लिए कई महत्वपूर्ण पहलू हैं. सबसे पहले, यह पी के साथ संक्रमण का परिणाम है कि ध्यान दिया जाना चाहिए संक्रमण 2) रोगज़नक़ के लिए मेजबान का 1) आनुवंशिक संवेदनशीलता: gingivalis तीन प्रमुख कारकों द्वारा निर्धारित किया जाता हैडाह (रोगाणु की आनुवंशिकी) और 3) जिसके परिणामस्वरूप मेजबान रोगज़नक़ बातचीत (दो जीनोम की बातचीत). पी के लिए खतरा gingivalis वायुकोशीय हड्डी हानि अध्ययन 17 चूहों के तनाव का चयन करते समय इस प्रकार रखा जाना चाहिए देखभाल, चूहों में आनुवंशिक रूप से निर्धारित किया जाता है -induced. आगे आनुवंशिक स्क्रीन आचरण और रोगाणु प्रेरित जीर्ण सूजन के लिए अतिसंवेदनशील और प्रतिरोध में शामिल जीन चिह्नित करने के चूहों की जन्मजात उपभेदों के बीच अंतर मेजबान प्रतिक्रियाओं लाभ लिया जा सकता है. इसके अलावा, पर्याप्त विविधता विभिन्न पी की क्षमता में मौजूद gingivalis चूहों 18 में वायुकोशीय हड्डी हानि के लिए प्रेरित करने के लिए उपभेदों. इस प्रोटोकॉल क्योंकि ट्रांसजेनिक चूहों की उपलब्धता और atherosclerosis के लिए अपनी संवेदनशीलता का C57BL 6 / पृष्ठभूमि पर चूहों का उपयोग करता है. पी gingivalis तनाव 381 C57BL 6 / पृष्ठभूमि पर चूहों में वायुकोशीय हड्डी हानि और atherosclerosis लाती है, और कई बैक्टीरियल म्यूटेंट थी उपयोग कर इंजीनियर किया गया हैएस तनाव.
चूहे atherosclerosis करने के लिए विशेष रूप से प्रतिरोधी रहे हैं और प्रकट धमनी घावों के विकास atherosclerosis के आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल के उपयोग की आवश्यकता है. यह atherosclerosis की अच्छी तरह से स्थापित माउस मॉडल है क्योंकि घाव गठन के लिए उच्च वसा आहार के भोजन की आवश्यकता नहीं है, माउस मॉडल, और मानव रोग 19 के कई पहलुओं को स्मरण दिलाता है - / - हम ApoE का उपयोग करें. प्रयोग के दौरान जानवरों को खिलाने के लिए भोजन के प्रकार एक महत्वपूर्ण चर रहा है. हमारे काम के बहुमत के लिए, हम हमारे परिणामों की व्याख्या में बहिर्जात लिपिड के योगदान से बचने के लिए चूहों एक सामान्य चाउ आहार खिलाने. प्रारंभिक अध्ययन में हमने पाया कि चूहों असंक्रमित और पी के बीच अंकित घाव क्षेत्र एन में एक उच्च वसा आहार मास्क मतभेद खिला gingivalis महाधमनी साइनस के भीतर चूहों -infected. हालांकि, उच्च वसा आहार और पी gingivalis संक्रमण काम synergistically जब inflam की प्रगतिसूचना एमआरआई या ऊतक विज्ञान 11 से अनामी में नजर रखी है. चूहों में, अनामी धमनी घाव प्रगति की एक उच्च डिग्री है, और इस धमनी एक्सप्रेस में घावों पोत संकुचन, atrophic मीडिया, परिवाहकीय सूजन, और पट्टिका व्यवधान सहित मानव में नैदानिक रोग की विशेषता विशेषताएं. घावों के सेलुलर संरचना में भेद विभिन्न संरचनात्मक स्थलों पर स्पष्ट कर रहे हैं. अनामी धमनी घावों मैक्रोफेज और टी कोशिकाओं दोनों से बना रहे हैं, जबकि मैक्रोफेज, महाधमनी साइनस घावों घुसपैठ प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं रहे हैं.
प्रायोगिक अवधि और मूल्यांकन कर रहे हैं भड़काऊ समापन दीक्षा, प्रगति का आकलन करने पर विचार जब अतिरिक्त कारक हैं, जिस पर समय बिंदु, और पी के परिणाम gingivalis atherosclerosis -induced. हम पहले दिखा दिया कि पी gingivalis ApoE -infected - / - चूहों बृहतभक्षककोशिका घुसपैठ, सहज प्रतिरक्षा मार्कर का ऊंचा अभिव्यक्ति, एक प्रदर्शनएन डी महाधमनी साइनस के भीतर पिछले संक्रमण के बाद के रूप में जल्दी 24 के रूप में भड़काऊ पट्टिका के बयान की वृद्धि हुई और यह टीकाकरण 16 से रोका जा सकता है. और आगे बढ़ उम्र के साथ हमारे हाथ, सूजन और इम्युनोपैथोलोजी वृद्धि के बाद संक्रमण 24 सप्ताह तक स्पष्ट कर रहे हैं. हालांकि, अध्ययन की अवधि के बारे में निर्णय अंतत: अध्ययन किया जा रहा अंतर्निहित परिकल्पना पर भरोसा करते हैं, विश्लेषण की विधा और विशिष्ट पर्यावरणीय परिस्थितियों में atherosclerosis की हद के पूर्व ज्ञान.
अनामी धमनी में प्रगतिशील सूजन की निगरानी के लिए गैर इनवेसिव इमेजिंग तकनीक का उपयोग प्रयोगात्मक अवधि मार्गदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सीरियल एमआरआई धमनी लुमेन और छोटे पोत दीवार क्षेत्रों में 20 के कम शब्दों में वर्णन कर सकते हैं कि एक ही पशु में atherosclerosis प्रगति का विस्तृत अध्ययन के लिए अनुमति देता है. ऐसे विच्छेदित वाहिकाओं के लिपिड धुंधला के रूप में पारंपरिक तरीकों के विपरीत, एमआर इमेजिंग इच्छामृत्यु की आवश्यकता नहीं हैऔर atherosclerosis की दीक्षा और प्रगति का आकलन करने के लिए अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए अनुमति देता है. ट्रांसजेनिक चूहों, बैक्टीरियल म्यूटेंट, या प्रयोगात्मक उपचार के साथ संयोजन के रूप में, एमआरआई द्वारा प्रदान की अस्थायी जानकारी मेजबान जेनेटिक्स, रोगज़नक़ डाह कारकों, और चिकित्सकीय हस्तक्षेप के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक अतिरिक्त लाभ, ऊतक विज्ञान और immunohistochemistry के रूप में इमेजिंग डेटा को मान्य करने के लिए प्रयोग की समाप्ति पर लिपिड और भड़काऊ कोशिकाओं के लिए दाग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हमने हाल ही में पी के साथ कि मौखिक संक्रमण का प्रदर्शन करने के लिए इन तरीकों का इस्तेमाल किया कि टीकाकरण पट्टिका प्रगति से सुरक्षा प्रदान करता है, चूहों, और लिपिड और भड़काऊ कोशिकाओं 11 के संचय में घटने के साथ संबद्ध - / - gingivalis अनामी ApoE की arterties में atherosclerosis accelerates.
संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से, रोगज़नक़ प्रेरित जीर्ण सूजन की एक मजबूत मॉडल का उत्पादन करने के लिए आवश्यक कदम की रूपरेखास्थानीय और प्रणालीगत स्थलों पर सूजन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों के रूप में. एक तरफ भड़काऊ हड्डी हानि और atherosclerosis में शामिल मेजबान और रोगज़नक़ विशिष्ट तंत्र की जांच करने के लिए इस मॉडल का उपयोग करने से, यह अतिरिक्त रोग मॉडल को रोगज़नक़ प्रेरित जीर्ण सूजन के योगदान का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इस रुमेटी गठिया, मधुमेह, और कैंसर सहित रोग के ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है. सबूत उभरते अज्ञात एटियलजि के पुराने रोगों के एक नंबर संक्रामक मूल हो सकता है कि इंगित करता है. इन रोगों नियोप्लास्टिक, autoimmune, और सूजन की बीमारी शामिल हैं, और एक साथ दुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु दर के प्रमुख कारणों में समझौता. इस प्रकार, जीर्ण सूजन से प्रेरित रोगों में रोगाणुओं की भूमिका की जांच के लिए पशु मॉडल का उपयोग व्यापक चिकित्सकीय प्रभाव और बेहतर निदान के लिए क्षमता है.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.
Acknowledgments
इस काम P01 A1078894 कैग को अनुदान राष्ट्रीय एलर्जी के संस्थानों और संक्रामक रोगों के द्वारा समर्थित किया गया था
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira analysis software | Visualization Sciences Group | ||
| Anaerobic chamber DW Scientific Model MG500 | Microbiology International | ||
| BHI | Becton-Dickinson | 211059 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | 51280-5G | |
| Menadione (Vitamin K) | Sigma-Aldrich | M5625-25G | |
| Yeast Extract | Becton-Dickinson | 212750 | |
| Carboxymethyl cellulose (medium viscocity) | Sigma-Aldrich | C-4888 | |
| Sulfamethoxazole and trimethoprim oral suspension 200 mg/40 mg per 5 ml | Hi-Tech Pharmacal | NDC 50383-823-16 | |
| μCT 40 | Scanco | ||
| HistoChoice Tissue Fixative | Sigma-Aldrich | H2904 | |
| Sudan IV | Sigma-Aldrich | S4261-25G | |
| Vertical-bore 11.7T Avance spectrometer | Bruker | ||
| Paravision | Paravision | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Rat anti-mouse F4/80 | Serotec | MCA497R | |
| Rat anti-mouse TLR2 | eBioscience | 13-9021-80 | |
| Leica S4 dissecting scope | Leica | ||
| Microm HM 550 cryostat | Microm |
References
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