局所および全身所における病原体により誘導される慢性炎症のためのマウスモデル

Summary

動物モデルは、慢性炎症の発展に貢献宿主および病原体特異的なメカニズムを定義する上で非常に貴重なツールであることが分かっている。ここでは、ローカルおよび全身の部位での炎症の進行を評価するために、ヒト病原体ポルフィロモナス·ジンジバリスとディテールの方法論で経口感染のマウスモデルを記述する。

Abstract

慢性炎症は、病理学的な組織の損傷及び腫瘍性、自己免疫および慢性炎症性疾患を含むヒトにおける多くの慢性疾患の統一特性の主要なドライバです。新たな証拠は、臨床症状の多種多様な慢性疾患の発症および進行中の病原体により誘導される慢性炎症を暗示。慢性疾患の複雑で多因子病因に、因果関係の証明および機構のリンクの確立のための実験を​​設計するヒトではほぼ不可能です。動物モデルを使用する利点は、特定の疾患の経過に影響を与える可能性の両方の遺伝的要因と環境要因を制御することができるということである。したがって、感染症の関連する動物モデルを設計する慢性炎症に寄与し、ホストおよび病原体特異的なメカニズムを特定するのに重要なステップである。

ここでは、病原体によって誘発される慢性inflaのマウスモデルを記述する口腔病原体ポルフィロモナス·ジンジバリス 、密接に人間の歯周病に関連する細菌による感染後の局所及び全身の部位でmmation。特定病原体フリーのマウスの経口感染が歯槽骨、歯周疾患の特徴を支える歯の破壊をもたらす局所的炎症応答を誘導する。アテローム性動脈硬化症の確立されたマウスモデル、P.による感染でジンジバリスは、血管内皮の活性化、増加した免疫細胞浸潤、および病変内の炎症性メディエータの発現の上昇を伴う大動脈洞および腕頭動脈内の炎症性プラーク沈着を加速させます。私たちは、局所および全身の部位での炎症の評価のための詳細な方法論。トランスジェニックマウスおよび定義された細菌の突然変異体の使用は、宿主および疾患の開始、進行および予後に関与する微生物因子の両方を識別するためのこのモデルは特に適している。 Additionallyは、モデルは、ワクチン接種および薬理学的介入を含む新規治療戦略のためにスクリーニングすることができる。

Introduction

慢性炎症は、病理学的な組織の損傷およびヒトにおける多くの慢性疾患の統一特性の主要なドライバです。これらの疾患は、腫瘍性、自己免疫および慢性炎症性疾患^1が含まれ^ています。多くの慢性疾患の病因は依然として不明であるが、遺伝的素因および環境因子の導入の両方を含む、複雑で多因子性であると理解される。炎症のperpetuatorsはとらえどころのない残っていますが、免疫活性化の細胞および分子プロファイルは、病原体²に対する宿主応答において観察されるもののパターンとかなり重複する。

証拠が慢性炎症とその多様な臨床症状^2,3の発症および進行中の微生物病原体の感染を暗示。病原体は、宿主の免疫系を破壊し、持続感染を確立することにより、直接、慢性炎症を誘導および維持することができます3における臨床症状および疾患転帰の広いスペクトルを有する慢性炎症を誘発するために異なるメカニズムを使用することを示唆している。したがって、特定の病原体が慢性炎症を誘導するメカニズムの詳細な理解は、主要な公衆衛生への影響だけでなく、多くの慢性疾患の治療および予防であってもよい。

慢性炎症の誘導および維持に貢献ホストと病原体の特定のメカニズムがありますがあまり理解されていない、病原体によって誘発される慢性炎症のモデル化における進歩は、これらのプロセスの理解を促進するために始めている。 P.歯周経口感染モデルは、ホストと病原ローカル（口頭骨の損失）で慢性炎症に貢献する具体的な仕組みや全身の部位（アテローム性動脈硬化症^）5,6の分析、病原体によって誘発される慢性炎症のユニークな、十分に特徴付けられたマウスモデルである。

P.ジンジバリスは、人間の歯周病、組織^7を支持歯の破壊を特徴とする感染主導の慢性炎症性疾患に関与するグラム陰性、嫌気性口腔病原体である。感染の初期部位における病理学に加えて、証拠が蓄積P.を暗示ジンジバリスは 、アテローム性動脈硬化症⁵を含む全身性疾患の発症および進行中の慢性inflammatioを特徴とする疾患を慢性炎症誘発動脈血管壁のnである。 Pと特定病原体フリーのマウスの経口感染ジンジバリスは、歯の破壊の結果は、歯槽骨^8を支持することが局所的な炎症応答を誘導する。P.ジンジバリスは、病原体特異的血清抗体力価⁹の高レベルを開発するまでの42日感染後⁸およびマウス感染マウスの口から回収することができる。 ^{- / -}マウス（アポE ^{- / - ）、P.}経口感染アポリポタンパク質-Eを使用して、アテローム性動脈硬化症の確立されたマウスモデルにおいてジンジバリスは大動脈洞¹⁰と腕頭動脈¹¹内炎症性プラーク沈着を駆動慢性炎症を誘導する。 Pの腕頭動脈内のプログレッシブ炎症歯周マウスは、生体内 MRI で使用して生きた動物でモニターすることができる感染した。組織学的には、Pから動脈病変歯周マウスは脂質accompa蓄積の増加を示し、感染した血管内皮の活性化、増加した免疫細胞浸潤、および炎症性メディエーター¹²の発現の上昇によって、防災科学技術研究所。ノックアウトマウスでのこのモデルの使用は、宿主シグナル伝達成分および炎症性メディエーターの役割、ならびに細胞P.を駆動特異的相互作用を解明している^{14 -} 歯周は免疫病理^12誘発 。また、定義された細菌の変異株を用いた実験では、重要なPを同定している歯周は、ローカルおよび全身の部位¹⁵で慢性炎症に貢献する要因を病原性。

この記事では、Pの評価のための方法論を詳述歯周は、ローカルおよび全身の部位での慢性炎症を誘発。私たちは、アミラソフトウェアを使用してマイクロCTによって歯槽骨喪失の分析のための詳細なプロトコルを提供する。さらに、当社は、プログレッシブでの評価のための生体内で生きている動物のMRI におけるシリアルの有用性を定義する腕頭動脈内のflammation。私たちは、動脈病変における炎症性プラークの可視化および定量化のための方法論が含まれ、それらの組織学的特徴づけを説明します。トランスジェニックマウスおよび定義された細菌の突然変異体の使用は、宿主および疾患の開始、進行および予後に関与する微生物因子の両方を識別するためのこのモデルは特に適している。さらに、モデルは、ワクチン接種および薬理学的介入を含む新規治療戦略のためにスクリーニングすることができる。

Protocol

細菌の1。成長と栽培

1. Pのストリーク凍結ストック嫌気性血液寒天プレート上にジンジバリス 381および3インキュベートする- 37℃で嫌気性チャンバー（10％H _{2/10％CO 2/80％N 2）}中で5日間。
2. 5ミリリットルのブレインハートインフュージョンブロス酵母エキス（0.5％）、ヘミン（10μg/ ml）を、およびメナジオン（1μg/ ml）を補充した（BHI）液体培養物に接種し、プレート成長した生物を使用する。 O / Nの成長に続いて、BHIの45ミリリットルに5ミリリットルの文化を移す。
3. additional18嫌気的に50ミリリットルの液体培養をインキュベート - 後期対数期半ばで24時間と収穫。文化の注記純度は、常に動物に細菌を導入する前に、グラム染色によって検証する必要があります。
4. 10分間7,000×gでの遠心分離によって細菌を収穫。上清を吸引し、徹底的に血清学的ピペットを用いて、5 mlのPBS中の細菌細胞ペレットを懸濁します。追加の追加10分間7,000×gで、PBSおよび遠心分離機の45ミリリットル。合計3回の洗浄のために二回、この手順を繰り返します。
5. 最後の洗浄後、培養物の1:10希釈を660 nmで1.0の光学密度を有するようにPBS中に細胞ペレットを（1 OD _660が 10 ⁹ CFU / mlと等価である）に再懸濁。 2％重量/ v溶液を達成するために十分なカルボキシメチルセルロース（媒体viscocity）を秤量し（ 例えば、5mlの培養物当たり0.1 g）を得た。凝集を回避するためにボルテックスしながらゆっくり細菌懸濁液にカルボキシメチルセルロースを加える。

2経口感染

NOTE：P.は 、適切なマウスモデルおよび経口感染レジメンを使用して、 図1に示すように歯周は （口腔）局所および全身の部位（動脈）で慢性炎症や免疫病理を誘発する。

1. 8週の - o 6員〜するスルファメトキサゾール（0.87 mg / ml）をし、トリメトプリム（0.17 mg / ml）を（Sulfatrim）を管理2週間の飲用水に自由に摂取 ldの雄マウスは、正常な細菌叢を減少させる。琥珀色のガラスボトル内抗生物質溶液を保持し、劣化を防ぐために、光から保護する。
2. 抗生物質溶液の沈降を避けるために、（ すなわち、午前中と夕方）、1日1回または2回ボトルを振る。 5日 - 3日毎新たに調製した溶液を用いて交換してください。
3. 2週間後、通常の飲料水と抗生物質溶液に置き換えてください。前経口感染に2日間の抗生物質の休止期間を許可します。
4. Pをロード添付の給餌針を有する1ミリリットルのツベルクリンシリンジにジンジバリス /車両のサスペンション。手動で自分の首の後ろに首筋をつかんにより、マウスを拘束する。グリップは、マウスの頭の移動を制限するのに十分しっかりしていることを確認します。
5. Pの局所適用によってマウスに感染上顎の頬側面でジンジバリス 。給餌針などの股関節の位置を決めtは右上顎臼歯の頬側面に整列し、細菌懸濁液50μlのを排出されている。給餌針のボールを使用して1分間の歯肉に沿って優しくソリューションを分散させる。
6. マウスは左上顎上の手順を繰り返す前に、1分30秒の間、休むことを許可。対照マウスには、抗生物質の前処理および強制経口投与車両単独（PBS中の2％カルボキシメチルセルロース）を受け取る。
7. 2日間隔でマウスを3回感染させることによって歯槽骨の損失を誘発したローカルサイトで病原体誘発性の慢性炎症を調べるため。マイクロCTによる骨量減少の評価のために6週間後にマウスを生け贄に捧げる。
8. 局所および全身の部位で病原体により誘導される慢性炎症を調べるために、アテローム性動脈硬化症を起こしやすいのApoEに感染^{- / -} 3週間のマウス週5回。
   NOTE：腕頭動脈における疾患の進行は、in vivoでの連続MRIによりモニターされる。画像マウスさまざまな時点での後半6-16週を犠牲R。屠殺時に、専用の顔分析によってグローバルアテローム性動脈硬化負荷を評価し、マイクロCTによる歯槽骨損失を決定する。組織学および免疫組織化学によってアテローム性動脈硬化病変を特徴づける。

3マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）

1. 試料作製
   1. 所望の時点感染後のマウスを生け贄に捧げる。 CO ₂ asphyxationによって、あるいは機関の動物施設で承認され、別の方法でマウスを安楽死させる。
      注：別の場所で⁹説明したように心臓穿刺、独立した血清および抗P.gingivalis IgGの分析のために-80℃で保存することにより血液を収集します。
   2. 頭蓋底深刻なマウスの頭部に断頭はさみ、大きなペアを使用してください。ピンセットで肉を取り出し、4％緩衝パラホルムアルデヒドの30ミリリットルを含有する50 mlコニカルチューブに頭蓋骨を置く。 4℃で48時間 - 24用試料を固定します。
   3. 続いて固定、rinsPBSで徹底的に試験片を電子。
   4. 上顎ブロック生検を作成します。
   5. マイクロCTによる評価まで4℃で組織学的グレードにおけるヘミ上顎70％エタノールに保管してください。
2. 画像収集
   1. デスクトップマイクロCTスキャナを用いて画像収集を実行します。 114μAの電流および70 kVの電圧に対するX線源を設定します。イメージング容器に個別のヘミ上顎をロードし、すべての3つの空間次元における12μmの解像度でスキャンします。
      注：イメージング容器内に同時に複数のヘミ上顎をロードします。
   2. ユーザがシステムを使用して画像取得のために境界線を引くと、関心領域（ROI）へのスキャニングを制限することができ、予備低解像度スキャンを実行する。
      注：エナメル質の強度は上顎臼歯のクラウンは容易に区別できます。ゆるく3大臼歯を包含するイメージング境界を設定ガイドと周囲の歯槽盆踊りとして臼歯の使い方メール。この機能は、同じ容器内で複数のサンプルをスキャンするときに個別のヘミ上顎とを区別するために使用される。
   3. スキャンが完了すると、RAW画像ファイル高品質dicomsに（.ISQ）（.DCM）に変換する。
3. 画像解析
   このプロトコルでは、画像解析は、データの視覚化、処理、および解析ソフトウェアを用いて行われる。まず、セ​​メントエナメルジャンクショ​​ン（CEJ）のための最適の平面を作成するために、形態学的なランドマークを使用しています。そして、歯槽骨量のその後の測定のための標準的な配向にヘミ上顎を変換するために使用します。
   1. ソフトウェアを開き、プールの左上隅にある「オープンデータ」アイコンをクリックします。あるいは、[ファイル]> [開く]データを使用しています。
   2. DICOM画像のスタックを選択し、[ロード]をクリックします。 DICOMローダウィンドウが表示されます。 [OK]をクリックします。
   3. プール内の緑のアイコンとして設定されたデータを観察してください。データ·オブジェクトをクリックすると、追加の原因となることに注意してくださいしかし、プールの上部にあるボタンの領域に表示するトン。アイコンを選択すると、プロパティエリアに表示されるデータレコードに関する情報をもたらす。
   4. プール内の各アイコンは、異なるモジュールを選択することが可能なポップアップメニューを提供しています。データアイコンの右上隅にある白い矢印をクリックしてポップアップメニューをアクティブにします。ディスプレイモジュールの下では、等値面（ディスプレイ>等値面）を選択します。等値面のアイコンは、プールエリアに表示されます。このオプションを選択すると、追加の設定が[プロパティ]エリアに表示されます。
   5. 2000透明に描画スタイルとしきい値を設定します。コンパクト化することを確認し、ボタンのダウンサンプリングは、オプションで選択されている。平均の下では、x、y、およびzはすべて2 [に設定されていることを確認は、等値面を生成するために適用します。
      注：3Dビューアに半上顎の透明3D再構成を観察します。画像再構成のための透明な描画スタイルを使用することの利点は、大臼歯の根缶容易に識別すること。標準配向に試料を入れたときに、これは重要になります。
   6. 緑色のデータアイコンを選択し、[プロパティ]エリアでは、作物のアイコンを選択します。ディメンションとデータの座標を表示するウィンドウを観察します。今の脇に設定します。バウンディングボックスは各コーナーでの緑のタブを持つ3Dビューアに表示されていることに注意してください。
   7. ビューアのツールバーのインターアクト·ボタンを選択します。クリックして緑のコーナーにドラッグしてバウンディングボックスのサイズを変更します。ボックスは関心領域（ROI）を包含し、できるだけ多くのデッドスペースや破片を排除することを確認してください。これは、コンピュータ上の計算の需要が減少します。
   8. 完全にバウンディングボックスに含まれるROIを確実に3Dビューア内でオブジェクトを回転させるために、ビューアのツールバーにあるトラックボールボタンを使用します。満足した場合には、ステップ8で取っておいクロップウィンドウで[OK]をクリックします。
   9. （OBのデータアイコンを選択して、ディスプレイモジュールの下に斜めのスライスを選択S）。 （表示> OBS）
   10. OBSを選択します。プロパティ領域では、データウインドウ-200〜10,000の範囲、そして最高級のサンプリング線形マッピングタイプを設定します。今のオプションの下に回転]を選択します。 OBSの中心に回転トグルを守ってください。
   11. ビューアツールバーで対話ボタンを選択し、スライスの切断面を調整するためにトグルのハンドルを使用しています。歯の根に平行と歯の咬合面に垂直に実行矢状面を作成します。 図2に示すような平面は3つの臼歯（M1-M3）を二等分するべきである。
   12. 回転をオフにして、OBS（オブジェクト>重複するオブジェクト）を複製します。新しいOBSはOBS 2のために上に回転させる上でのOBS 2ターンという名前が表示されます。
   13. それはOBS 1（ 図2を参照）と垂直になるようにOBS 2の方向を変更するために回転ハンドルを使用してください。
   14. OBS 2オフ回転させ、3重複するスライスを作成回します。これらは、OBS 3,4、および5名になります。
4. ベストフィットの飛行機のためのピッキングポイント
   注：CEJは最適の平面を作成するに沿って手順8ポイントの位置を記述3.4.1-3.4.5。矢状スライスと冠状スライスから他の4つのポイントのうち4つを選択してください（ 図3を参照）。 3.4.6において矢状スライスに位置されるポイントを選択する際には、OBS 1を調整する必要があるかもしれない。
   1. 矢状面でのM1の最も近心ルートの中心とOBS 1を合わせます。前頭面でのM1の最も近心ルートの中心とOBS 2を合わせます。
   2. 前頭面でのM1の頬 - 遠位ルートの中心とOBS 3を合わせます。必要に応じて、ステップ20でポイントを選択するとき、それが約矢状面内でのM1の頬 - 遠位ルートで中心になるよう、OBS 1に調整します。
   3. M2の頬根の分岐部でOBS 4の位置を合わせます。 OBS 4は、M2の頬-近心と頬 - 遠心根の間の中心にする必要があります。必要であればそれは約ウィットを中心にされるように、OBS 1を調整hの矢状面におけるM2の頬 - 遠位ルートステップ20でポイントを選択する
   4. それは前頭面におけるM3の中央を下に実行されるようにOBS 5調整してください。必要に応じて、ステップ20でポイントを選択するとき、それが約矢状面におけるM3の最も遠位ルートで中心になるよう、OBS 1に調整します。
   5. 海底地震計（OBS 6）のいずれかを複製し、[プロパティ]ウィンドウ内のポイントにフィット]を選択します。ポイントへの適合は、研究者が、視聴者の中の2Dまたは3Dのオブジェクトに3つ以上の点を選択することができ、次に最適の平面を算出し、切り替えます。この場合、前の手順で説明した2D海底地震計は、CEJに沿って8点を選択するために使用されている。
   6. データアイコンの右上隅にあるオレンジ色のボックスをクリックして3DビューアからOBS 6を非表示にします。すべての2Dスライス上CEJが表示されるように3Dビューアから等値面を非表示にします。 Shiftキーを押しながらクリックして、上記のようにCEJに沿って8ポイントを選択します。
      注：選択する際にShiftキーが押されていない場合ポイント、平面は自動的に最初の三点の後に計算されます。
   7. すべての8点を選択した後、OBS 6が表示されるよう。これは約咬合平面と平行に走る軸方向のスライスであることに注意してください。
5. 変換と再配向注：ベストフィットの面は、その後の体積測定のための標準的な向きにデータを変換するために使用されている。
   1. データアイコン>計算> ApplyTransformをクリックします。 ApplyTransformアイコンがプール·エリアに表示されます。 ApplyTransformアイコンの隅に白い四角を選択し、参照をクリックし、OBS 6をクリックしてください。
   2. [プロパティ]エリアでは、補間方法を選択標準モード用に拡張。変換を適用します。
   3. 新しいデータファイルのための等値面と冠状OBSを作成します。それは、M1（ 図2に示す）とほぼ垂直になるように、軸方向にOBSを回します。臼歯のカスプと咬合cを使用してくださいガイドとしてurvatures。
   4. ステップ3.5.1と3.5.2のようにデータを変換するために、このプレーンを使用してください。変換されたデータファイルを保存します。
6. セグメンテーションと骨量測定
   注：以下の手順は、歯槽骨のセグメンテーションと測定について説明します。 CEJのための最適の平面に対応するスライスが識別され、基準面が選択される。 CEJと臼歯の頬面上の基準面との間の歯槽骨がセグメント化され、測定されます。 M1の最も近心根とM3の最先端ルートは、エンドポイントの目印として役立つ。 15-20スライスCEJ下の基準面を設定すると、最適な結果が得られます。追加のスライスを含めることは、そのマスク処理群間の骨体積の差の変動を導入しています。
   1. セグメンテーションエディタを開いて、変換されたデータのための新しいラベルを作成します。
   2. 新しいマテリアルを作成し、それを歯槽骨という名前を付けます。
   3. ズームとデータ·ウィンドウの下では、データがあちこちに及ぶセット〜10,000メートル-200。
   4. ディスプレイとマスキングの下で​​2Dクロスヘア、3D、MPR、および3Dボリュームレンダリングのアイコンを選択します。 2,500〜8,000データ範囲を設定します。データ·マスキングを有効にします。
   5. ビューアのツールバーからの設定四ビューアの表示を選択します。ディスプレイは、矢状、冠状、及び軸方向の画像スタックの同時検査、ならびに3Dボリュームレンダリングを可能にする4つの象限に分割される。
   6. エナメル質は、M1とM3の頬面に表示されている最後のスライスを識別するために、すべての4つの象限を使用してください。この場所は、CEJに最適の面に対応している。アキシャルスライス番号を記録します。
   7. 軸平面では、歯槽骨稜に向かって15〜20スライスを続ける。これは、基準面を表す。
   8. CEJと基準面との間に大臼歯の頬面上に歯槽骨を選択するためにセグメンテーションツールの任意の組み合わせを使用してください。エンドポイントのランドマークとしてM1の最も近心根とM3の最先端ルートを使用してください。
   9. オブジェクトプールに戻ります。拡張子 ".Labels」との新しいアイコンは、画像データのアイコンに付加されるべきである。ラベルのアイコンを選択し、ドロップメニューで材料> MaterialStatisticsを選択します。
   10. プロパティ領域では、材料を選択して適用するヒット。テーブルには、材料リストの各物質について、いくつかのパラメータが表示されます。歯槽骨の量を記録します。

アテローム性動脈硬化症の4。評価

1. 大動脈解離
   1. 所望の時点、感染後のCO ₂窒息によりマウスを生け贄に捧げる。
   2. 下に背側、テープ上にマウスを置き、70％EtOHでマウスを拭いてください。ちょうど剣状突起のプロセス上の腹部の中央から腹側の皮膚をカット。
   3. 剣状突起のプロセスが表示されるまで腹部の皮膚をカット。小さなPAで剣状突起のプロセスを持ち上げ鉗子のIRは、胸郭の両側にカットを行い、振動板をカット。その後、心臓を露出させ胸郭のどちらかの側を下に2カットを行う。
   4. 右心室の頂点に置か27 Gインスリン注射器を用いて、マウスを放血。採血中は、定期的に心室壁によって開口部の閉塞を防止するための針を回転させる。典型的に、0.8 - 血液1mlをこの方法を用いて得ることができる。
   5. SUP>注記：抗P.gingivalis IgGの分析のために-80℃でセパレート血清およびストアは⁹他に記載されているよう
   6. 右心房を除去するためにハサミを使用してください。
   7. 心臓の後側の左心室の位置を確認します。チャンバの中心に面した針のベベルで、左心室の頂点に21 G針を導入し、ゆっくりと3で循環器​​系をフラッシュする - 組織固定液を5ml。
   8. 心臓を取り囲む脂肪や胸腺トリム。
   9. LUを削除するNGS。
   10. 3支店を持つ大動脈弓の位置を確認し、より良い露光のため、周囲の脂肪層を離れてオフにします。
   11. 弓から横隔膜のベースに大動脈解離を続行します。
   12. 肝臓を取り出し、下行大動脈を露出するために腸組織を変位さ。腎動脈の分岐まで遠位大動脈を解剖。
   13. 腎動脈を切り、回腸分岐まで解剖を続ける。
   14. 大動脈は、ほとんどの結合組織から解放されると、大動脈の先頭に戻り、心臓の上の大動脈から3枝の非常に上部を切り取る。
   15. 上向きの剥離心、体から心臓を分離するために、基礎となる脂肪組織を切り取る。
   16. 鉗子で心を持ち、上方向に引っ張る、まだ取り付けてもよい結合組織を切断し、腎臓にまで続けると足まで続き、可能な最低点にチョキ。
   17. subseで1時間10％ホルマリンで大動脈を修正PBSで1時間のために洗うquent。代わりに、10％ホルマリン、O / Nが店の大動脈は、次の日にPBSに洗い、解剖を続行します。
   18. PBSを含む10cmのペトリ皿に置き、大動脈。
   19. 解剖スコープを使用して、慎重に大動脈から外膜組織を除去。
   20. 大動脈は、余分な脂肪組織の自由である場合には、心の底三分の二を遮断。大動脈弓の中心部とは反対側の端に離れて心臓の筋肉を剥離開始します。大動脈の電球がゆっくりと着色の白されるであろう、表示されます。
   21. 大動脈電球は心筋組織の自由になるまで2ピンセットを用いて慎重に解剖を続行します。
   22. 黒解剖トレイにきれいに大動脈を置き、PBSでカバーしています。
2. 大動脈のピン止め
   1. ピン止めを通してPBSに覆われた大動脈を保管してください。
   2. 左の大動脈の球根と解剖学的な位置に大動脈を置き。
   3. 第三の下の1から始まる5カ所）、大動脈のトップ、2）での一時的なminutienピンを配置します大腿動脈の枝の上に大動脈5）降順の下端近くで大動脈4降順のアーチ、3）中途）の支店。
   4. 極細春のはさみを使用して、大腿動脈の左枝で上行大動脈の下の最も低い枝に大動脈までのすべての方法を開始し、大動脈の左サイドをカット。
   5. 割れ目最低大動脈球の左方側からカットし、大動脈の垂直カットに沿ってカットの交差点に到達するためにカットし続ける。
   6. 上行大動脈の最も低い枝の点に到達する水平大動脈横断
   7. 大動脈の上記の最上位のブランチに右側に上向きにカット。
   8. その内面を露出させるために、各ブランチをカット。
   9. 一時的なピンのいくつかを削除し、大動脈の伸張、折り畳みなしで解剖学的位置にあるすべての大動脈を下にピン止めすることを目標に永久的なピンと交換してください。目標は、大動脈の内面を露出することである。
   10. 大動脈のすべての内部表面が露出し、はっきりと見え、上からと視覚int型の自由されるまでピン止め続行ピンからerference。
3. 脂質染色および病変の定量化
   1. スダンIV染色溶液（5 mg / mlの70％イソプロパノール中）を調製する。よく混ぜ、結晶が存在しないことを確認するためにフィルタリングする。
   2. 50分間のスーダンIV溶液中のピン止め大動脈をカバー。
   3. 5分 - 1 70％イソプロパノールで洗浄する。大動脈から出てくる水はもはや赤になるまでそっとのddH 2 Oで大動脈をすすぐん。
   4. PBSで大動脈をカバー。解剖顕微鏡に取り付けられた高解像度カメラで大動脈の画像をキャプチャして保存するなどのデジタル画像ファイル（。TIFF）。キャリブレーションを支援するために、各画像の横に定規を置きます。
   5. 病変の内膜との面積を決定するために、ImageJソフトウェアを使用してください。手動で領域を決定するために内膜表面をトレースする。病変領域は、自動カラー閾値を用いて計算することができる。これは、通常の領域から病変を判別する色の強さを定義するために閾値を設定することが必要である。
   6. の割合を計算する内膜表面は、アテローム性動脈硬化病変で覆われて。

アテローム性動脈硬化症の病変の5組織学的評価

1. 心臓組織で大動脈弓を収穫し、使い捨ての基本型の中で10月中に浸す。
2. 5μmの凍結切片シリアル-17℃に​​設定したクライオスタットを用いて、大動脈洞および腕頭動脈内のすべてが50μmを収集し、顕微鏡スライド上の組織切片をマウントします。ストアは、さらに使用するまで-20℃でスライドする。
3. 組織学的評価のために、適切な手順を使用して、ヘマトキシリン​​＆エオシンで染色する。

アテローム性動脈硬化症の病変の6免疫組織化学的キャラクタリゼーション。

アウトライン日常Pにアテローム性動脈硬化病変を評価するために使用される一般的な抗体ベースのプロトコルは、以下の手順ジンジバリスは、マウスを感染した。このプロトコルは、各抗体または試薬の最適化を必要とします。

1. 冷凍庫からスライドを削除し、修正する氷のように冷たい固定液（アセトンまたは他の固定剤）での2分間。
2. スライドをRTに​​来て、耐溶剤性ペンで標識することを許可します。
3. リンスは、組織凍結マトリックスを除去するためにPBS中で3回スライドさせる
4. 10分間PBS中の0.3％H ₂ O ₂溶液中でスライドをインキュベートすることにより内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックする。
5. すすぎを2分間PBSで毎回3回スライドさせる。
6. RTで30分間緩衝液（PBS中の10％ウサギ血清）でブロッキングインキュベートすることにより非特異的結合をブロックする。
7. 10％ウサギ血清で一次抗体1:50に希釈します。
8. スライド上の組織切片に希釈した抗体を適用します。
9. 室温で1時間インキュベートする。
10. リンスは2分間ずつPBS中で3回スライドさせる。
11. 10％ウサギ血清で100：抗ラットビオチン化二次抗体1に希釈する。
12. スライド上の組織切片に適用し、室温で30分間インキュベートする。
13. リンスは2分間ずつPBS中で3回スライドさせる。
14. 追加することによって、DAB基質溶液を準備すべての1ミリリットルのDABバッファへのDAB色素原の1滴。
15. スライドからPBSを排出し、DAB基質溶液を適用します。スライドを5分間または所望の色の強さに到達するまでインキュベートすることを可能にする。
16. 2分間ずつ水洗い3倍。
17. ヘマトキシリン​​で対比染色。
18. アルコールの4変化（95％1分、95％で1分間、100％で1分間および100％5分）を介して脱水。
19. キシレンの3変化をクリア。
20. マウントソリューションを使用してカバースリップし、顕微鏡観察により定性的に分析。定量分析のために、画像を取得し、自動しきい値を使用したImageJでの染色面積を計算。

7 MRI

1. MRI用動物の準備
   1. MRI実験の前にマウスを麻酔。誘導チャンバ内で2〜3分間、4％、気化イソフルランを用いて、麻酔の初期誘導を行います。 2％イソフルラン気化delivere - 0.5の連続流を用いた撮像期間中麻酔を維持ノーズコーンセットアップまたはマスクを介してD。
   2. 麻酔の外科的平面（ すなわち、つま先のピンチ応答）に達した後、ノーズコーンに挿入、その鼻動物ホルダーにマウスを置きます。画像形成中に潜在的な動きを最小限に抑えるために使用できる市販の動物所有者のいくつかの種類があります。私たちは、一口棒でカスタム設計されたホルダーを使用しています。
   3. 呼吸と心臓周期を監視し、小動物の監視およびゲーティングシステムを搭載した（マウスの腹部に置かれ）呼吸枕を使用して、画像取得と同期。
   4. 実験用フィルムを用いた動物ホルダーにマウスと監視システムを保護します。
2. MRIデータ収集
   1. 30ミリメートル垂直プローブ（マイクロ2.5）に仰臥位で最初のマウスの頭を持つ動物ホルダーを配置し、23℃に維持し、中に11.7 T MRIスキャナを垂直産んだ。
   2. Tの中心とホルダーの位置を合わせます彼はコイルからRF。
   3. 単一パルスシーケンスを用いてシミング処理を行う。
   4. RAREシーケンスを使用して、軸方向の冠状、矢状画像を作成するために3つの直交の向きに沿ってスカウト画像を取得する。
   5. 次のパラメータを使用してゲートなし3Dグラジエントエコーシーケンスを用いて低解像度磁気共鳴血管造影（MRA）を実行します。スラブ厚= 1.5センチメートル、フリップ角= 45°;繰り返し時間= 20秒;エコー時間= 2.2ミリ秒;視野= 1.5×1.5×1.5センチメートル;マトリックス= 64×64×64;平均= 1の合計スキャン時間の数：2〜3分。このスキャンの目的は、画像は、標的領域（腕頭動脈）で取得されることを保証することである。
   6. 次のパラメータを使用してゲートなしの3Dグラジエントエコーシーケンスと腕頭動脈の高分解能MRAを実行します。スラブ厚= 1.5センチ。フリップ角= 45°;繰り返し時間= 20秒;エコー時間= 2.2ミリ秒;視野= 1.5×1.5×1.5センチメートル;マトリックス= 128＆＃215; 128×128;普通= 4合計スキャン時間数は約25分であった。
   7. 鎖骨下の分岐腕頭動脈0.5ミリメートルの連続軸方向の画像を取得します。
3. MRIデータ分析
   1. スキャナに関連したイメージングソフトウェアを使用して画像再構成と分析を行います。最大強度投影によってMRA画像の3D再構成を実現します。
   2. 異なるマウスまたは異なる時点で同じマウスから取得したデータを整列させるために、解剖学的マーカーとして鎖骨分岐を使用してください。 subclavianbifurcation下の0.5mmの距離に0.3〜で腕頭動脈の目標断面を選択してください。
   3. ImageJので選ばれた断面の管腔面積を定義し、計算する。測定は、2つの独立した観察者により盲検様式で実施されるべきである。クラス間の相関係数を計算することにより、測定再現性を確認します。
   4. シリアル虚部と長手方向に研究のためにる、各マウスのベースライン（研究で非常に最初の缶）で得られた内腔の面積に管腔面積を正規化する。時間をかけて管腔面積の変化として結果を表す。
   5. 実験群間の有意差を決定し、適切な統計分析（ 例えば、スチューデントt検定）を行う。

Representative Results

適切なマウスモデルおよび経口感染レジメン、P.を使用して歯周は （口腔）局所および全身の部位（動脈）（ 図1）で、慢性炎症や免疫病理を誘発する。

Pとマウスでは、経口感染ジンジバリスは、歯槽骨^8を支持する歯の破壊を駆動する局所炎症応答を誘導する。P.歯周マウスは主にIgGアイソタイプ⁹のものであるこの生物に対する血清抗体応答を開発し感染した。 図4に示された結果は、C57BL / 6は2日間隔でP.gingivalisで3回感染させ、マイクロCTによる歯槽骨損失の評価のために6週間後に屠殺した実験の代表である。アミラソフトウェアを使用して容量分析は、P.を明らかにするジンジバリス感染したマウスは、（非感染対照と比較して、図4Aに著しい骨損失を示す）。対照（ 図4Bおよび図4C）と比較して、再構成されたヘミ上顎の目視検査は、感染したマウスにおけるモル根の露出表面積の増加を示している。

^{- / -}マウス、P.アテローム性動脈硬化を起こしやすいのApoEでジンジバリスは大動脈洞¹⁵と腕頭動脈¹¹内の歯槽骨喪失¹²および炎症プラーク沈着を駆動慢性炎症を誘導する。P.ジンジバリスは、アテローム性動脈硬化症は、早ければ、最後の感染後24時間として発生し、感染前¹⁶に免疫することによって防ぐことができる誘発。 Pの腕頭動脈の進行性炎症歯周炎は 、感染後（ 図5）を指す。スーダンIV染色された大動脈のエン面測定することを実証したマウスは、さまざまな時点で生体内 MRI シリアルによって生きたマウスでモニターすることができる感染したP.歯周感染はかなり脂質沈着および内膜表面上の病変領域（ 図6）を増加させる。犠牲、組織学および免疫組織化学の時点で定性的または定量的に細胞組成物、各種の抗原の発現、および脂質含量の文脈においてアテローム性動脈硬化病変を特徴付けるために使用することができる。大動脈洞病変の免疫組織化学的分析は、増加したマクロファージの浸潤とP.自然免疫受容体Toll様受容体2（TLR2）の発現の上昇が明らかに歯周感染したマウス（ 図7）。

図1：P.歯周は、ローカルおよび全身の部位に慢性の炎症を誘発。前にPに感染ジンジバリスマウスはadministeです 2日間の抗生物質の休止期間が続く10〜14日間、飲料水の赤い抗生物質を自由に摂取 。抗生物質治療は、先住民族の口腔細菌叢を抑制し、定着を促進します。歯槽損失の誘導のために、マウスを二日間の間隔で3回感染していると歯槽骨体積は、感染後6週間で測定される。アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症を起こしやすいのApoEを評価する場合^{- / -}マウスは、典型的には3週間週5回を感染させ、16〜24週目に、感染後に犠牲にされている。生きたマウスの腕頭動脈内のプログレッシブ炎症は、さまざまな時点で、生体内 MRI における連続で測定することができる感染後ポイント。組織学および免疫組織化学は、撮像データを検証するための実験の終了時に脂質および炎症性細胞を染色するために使用することができる。屠殺時に、歯槽骨損失がマイクロCTによって測定され、グローバルアテローム性動脈硬化は、大動脈全体の顔染色エンによって評価される。 https://www.jove.com/files/ftp_upload/51556/51556fig1highres.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

OBS 1とOBS 3大臼歯が（M1〜M3）標識され、関連する解剖学用語が指示されている2の位置を示す図2マウスヘミ上顎。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

5を通してOBS 1の位置決めを示す図3マウスヘミ上顎。1556 / 51556fig3highres.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

マイクロCTによって測定された前記歯槽骨損失図 。雄のC57BL / 6は、経口P.で感染させたジンジバリスまたはビヒクル単独（非感染）および歯槽骨のボリュームが感染していないし、Pから半上顎におけるアミラ。（A）歯槽骨のボリュームを使用して6週間後にマイクロCTにより評価したジンジバリスは 、C57BL / 6を感染した。結果は、基準面（CEJから120ミクロン）上の骨量を表している。データは群あたりn = 8でマウスからの骨体積のSDとして表される。 ***はp <0.001、非感染対照と比較して、（B）および（C）非感染（B）から半上顎の代表的な三次元再構成とP.ジンジバリスは 、（C）マウスを感染した。歯槽骨体積の有意な減少がP.で見ることができる感染していない対照と比較した場合、 歯周炎は、マウスを感染した。矢じりは、目に見える骨量の減少はPに発生した領域を示す歯周感染したマウス（モル根の露出表面積の増加に注意してください）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Pを以下の腕頭動脈内の図5。プログレッシブの炎症ジンジバリス感染MRIによって測定されるように大動脈弓およびApoEの主要な血管の（A）代表磁気共鳴（MR）血管造影。 ^-/ - 。その分岐下のマウス、0.3ミリメートルの腕頭動脈の中に黄色の線からのマウス（B）軸MR画像。腕頭動脈は、ベースライン時MRAにより結像され、12及び16週後の感染。（C）管腔面積の時間変化（mm ^2）とで個別のマウス（n = 10-12 /群）を計算した。非感染のApoE ^{- / - （}青）; P. ^{- / -} ジンジバリスはアポ感染した。（赤） 、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図全体の大動脈における病変面積の6 エン顔決定。（A）大動脈のスダンIV染色<em>のPと16週の感染後の顔病変エンジンジバリス 。（B）感染していない（白記号）の合計大動脈内脂質含量の定量およびP.歯周感染したマウス（黒シンボル）（N = 10-13 /群）。脂質によって占有された大動脈の割合は、ImageJのを使用して計算した。 * P <0.05。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

大動脈洞病変の図7。免疫組織化学的分析の男性のApoE ^{- / -}マウスは、通常の固形飼料を給餌は、Pに感染していたジンジバリスまたは非感染および感染後16週に屠殺。大動脈洞から得られた凍結切片は、抗 - で染色したマウスF4 / 80とTLR2。スケールバー、100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

P.歯周経口感染モデルは、局所および全身の部位で病原体により誘導される慢性炎症の研究のための貴重なツールを提供します。このユニークなモデルは、慢性炎症や免疫病理に寄与し、ホストと病原体の両方の特定のメカニズムの特徴付けを可能にする。さらに、モデルは、免疫化および薬理学的介入を含む新規治療戦略のためにスクリーニングすることができる。このプロトコルで説明する手順は、Pの開始、進行、および転帰を評価するために、このモデルおよび詳細な方法論の成功した使用を記載しているジンジバリスは、慢性炎症を誘発。

炎症性骨喪失を調べるためにこのプロトコルを使用する際に心に留めておくべきいくつかの重要な側面があります。まず、P.による感染の結果ことに留意すべきである感染2）病原体に対する宿主の1）遺伝的感受性： ジンジバリスは、3つの主要な要因によって決定されます病原性（病原体の遺伝学）と3）を得られた宿主 - 病原体相互作用（2つのゲノムの相互作用）。 P.に対する感受性遺伝的研究の¹⁷匹のマウスの株を選択する際にこのように注意が必要、マウスにおいて測定された歯周炎は歯槽骨の損失を誘発。マウスの近交系間の差分宿主応答は、前方遺伝子スクリーニングを実施し、病原体により誘導される慢性炎症に感受性および耐性に関与する遺伝子を特徴づけるための利点を取ることができる。また、かなりの異質性が異なるPの能力に存在するジンジバリスは、マウス¹⁸における歯槽骨の損失を誘導するために株。このプロトコルは、原因遺伝子導入マウスの可用性とアテローム性動脈硬化症に対する感受性のC57BL / 6バックグラウンド上でマウスを使用しています。P.ジンジバリス株 381は、C57BL / 6バックグラウンド上のマウスでの歯槽骨喪失およびアテローム性動脈硬化症を誘発し、そしていくつかの細菌の変異体は、Th1を使用して操作されているsの株。

マウスは、アテローム性動脈硬化症、特に抵抗性であり、明白な動脈病変の発生は、アテローム性動脈硬化症の遺伝的に改変されたマウスモデルの使用を必要とする。それはアテローム性動脈硬化症の十分に確立されたマウスモデルであるため、病変形成のための高脂肪食の供給を必要としない、マウスモデル、およびヒト疾患¹⁹の多くの側面を再現^{- / -}私たちは、アポEを使用しています。実験中の動物を養うために食事療法のタイプは重要な変数である。私たちの仕事の大部分のために、私たちは、結果の解釈における外因性脂質の寄与を回避するために、マウスに通常の固形飼料を食べます。予備研究では、感染していないとPとの間の専用顔病変領域におけるマウスの供給高脂肪食をマスクの違いを発見したジンジバリスは大動脈洞内のマウスを感染した。しかし、高脂肪食とP.ジンジバリス感染作業は相乗的に時inflamの進行を報は、MRIまたは組織学¹¹による腕頭で監視されている。マウスでは、腕頭動脈は、病変の進行度が高く、かつ、この動脈Expressの病変は血管狭窄、萎縮メディア、血管周囲の炎症、およびプラークの中断を含む、ヒトでの臨床疾患の特徴を備えています。病変の細胞組成における区別は、異なる解剖学的部位で明らかである。腕頭動脈病変はマクロファージおよびT細胞の両方で構成されている間、マクロファージは、大動脈洞の病変に浸潤する一次免疫細胞である。

実験の持続時間および炎症のエンドポイントが評価される時点は、Pの開始、進行および結果を評価する際に考慮すべき追加要因であるジンジバリスは、アテローム性動脈硬化症を誘発。私たちは、以前にあることを実証したP.ジンジバリスはアポEを感染した^{- / -}マウスマクロファージ浸潤、先天性免疫のマーカーの発現の上昇を示し、ndは大動脈洞内の最後の感染後早ければ24時間のような炎症性プラークの沈着を増加させ、これは、免疫化¹⁶によって防止することができる。前進年齢とともに私たちの手、炎症や免疫病理の増加では、感染後24週間まで明白である。しかし、研究の期間に関する決定は、最終的には研究されている基本的な仮説、特定の環境条件下で、アテローム性動脈硬化症の程度を分析し、事前知識のモードに依存している。

腕頭動脈の進行性の炎症をモニターするための非侵襲的イメージング技術の使用は、実験期間を案内するために使用することができる。シリアルMRIは、動脈内腔および小血管壁領域²⁰の狭小化を描写することができ、同じ動物におけるアテローム性動脈硬化症の進行の詳細な研究を可能にする。そのような解剖血管の脂質染色など従来の方法とは対照的に、MRイメージングは​​、安楽死を必要としないおよびアテローム性動脈硬化症の開始および進行を評価するための長期的な研究が可能になります。トランスジェニックマウスは、細菌の変異体、または実験的治療と併用して、MRIにより提供される時間情報は、ホスト遺伝学、病原体の病原性因子、および治療的介入の効果を評価するために用いることができる。追加の利点として、組織学および免疫組織化学は、撮像データを検証するための実験の終了時に脂質および炎症性細胞を染色するために使用することができる。私たちは最近、Pとその経口感染を証明するために、これらのメソッドを使用その免疫がプラーク進行からの保護を提供し、マウス、および脂質および炎症性細胞¹¹の蓄積の減少と相関する^{- / -} ジンジバリスは腕頭ApoEのartertiesにおけるアテローム性動脈硬化を加速させる。

要約すると、このプロトコルは、同様に、病原体によって誘発される慢性炎症の堅牢なモデルを生成するために必要な手順を説明します局所および全身の部位での炎症を評価するために使用する方法を提供する。別に炎症性骨喪失およびアテローム性動脈硬化症に関与する宿主および病原体特異的なメカニズムを調べるために、このモデルを使用することから、それは追加の疾患モデルの病原体により誘導される慢性炎症の寄与を研究するために適合させることができる。これは、関節リウマチ、糖尿病、および癌を含む疾患のトランスジェニックマウスモデルを使用することによって達成することができる。新たな証拠は、原因不明の慢性疾患の数は、感染性起源を有し得ることを示している。これらの疾患は、新生物、自己免疫および炎症性疾患が含まれ、一緒に世界中で罹患率および死亡率の主要な原因を損なう。したがって、慢性炎症によって駆動疾患における病原体の役割を調べるために動物モデルの使用は、広範な治療および改善された衝撃の診断の可能性を有している。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amira analysis software	Visualization Sciences Group
Anaerobic chamber DW Scientific Model MG500	Microbiology International
BHI	Becton-Dickinson	211059
Hemin	Sigma-Aldrich	51280-5G
Menadione (Vitamin K)	Sigma-Aldrich	M5625-25G
Yeast Extract	Becton-Dickinson	212750
Carboxymethyl cellulose (medium viscocity)	Sigma-Aldrich	C-4888
Sulfamethoxazole and trimethoprim oral suspension 200 mg/40 mg per 5 ml	Hi-Tech Pharmacal	NDC 50383-823-16
μCT 40	Scanco
HistoChoice Tissue Fixative	Sigma-Aldrich	H2904
Sudan IV	Sigma-Aldrich	S4261-25G
Vertical-bore 11.7T Avance spectrometer	Bruker
Paravision	Paravision
ImageJ	NIH
Rat anti-mouse F4/80	Serotec	MCA497R
Rat anti-mouse TLR2	eBioscience	13-9021-80
Leica S4 dissecting scope	Leica
Microm HM 550 cryostat	Microm