Abstract
Es crucial para identificar la infección por citomegalovirus (CMV) en el tracto gastrointestinal (GI) de los pacientes inmunodeprimidos, dado su mayor riesgo de desarrollar una infección grave. Muchos métodos de laboratorio para la detección de la infección por CMV se han desarrollado, incluyendo serología, el cultivo viral y métodos moleculares. A menudo, estos métodos reflejan afectación sistémica por CMV y no identifican específicamente la participación del tejido local. Por lo tanto, la detección de la infección por CMV en el tracto gastrointestinal se realiza con frecuencia por la histología tradicional de tejido de la biopsia. La tinción con hematoxilina y eosina (H & E) en conjunción con técnicas de inmunohistoquímica (IHC) se han mantenido los pilares de examinar estas biopsias. H & E e IHC veces resultan en (dudosos) patrones de tinción atípicos, lo que hace difícil la interpretación. Se demostró que la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para CMV con éxito se puede realizar en fijado en formol, tejido de biopsia incrustado en parafina (FFPE) de muyalta sensibilidad y especificidad. El objetivo de este protocolo es demostrar cómo llevar a cabo las pruebas de qPCR para la detección de CMV en tejido de biopsia FFPE en un laboratorio clínico. Este método es probable que sea de gran beneficio para los pacientes en los casos de la aparición de manchas por CMV en biopsias GI.
Introduction
Interpretación de la infección por citomegalovirus (CMV) en muestras clínicas es críticamente importante. CMV es un miembro de la subfamilia Betaherpesvirinae de herpesvirus. Al igual que otros virus de herpes, CMV tiene la capacidad de establecer una infección persistente o latente que se caracteriza por una falta de replicación viral activa 1. La reactivación del virus puede producirse en momentos de estrés o de otro tipo de inmunosupresión, lo que lleva a la replicación viral activa caracterizada por la liberación de viriones, que puede estar acompañado de manifestaciones de la enfermedad 2-4. Gastrointestinal (GI) los síntomas de la enfermedad por CMV con frecuencia incluyen dolor abdominal y / o heces con sangre 1.
El diagnóstico de CMV gastroenteritis por histología utiliza hematoxilina y eosina (H & E) para identificar inclusiones virales de CMV. En los casos en que es alto pero no se observan inclusiones obvias sospecha clínica, inmunohistoquímica (IHC) se utiliza con frecuencia como un método de prueba adjunto. Sin embargo, IHCtambién puede verse obstaculizada por los patrones raros no aparecen clásicos de tinción celular (ambiguas), lo que hace difícil la interpretación (Figura 2) 5. Se trató de utilizar ADN extraído de fijado con formalina, embebido en parafina (FFPE) tejido de la biopsia GI y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para detectar CMV en biopsias GI. Esta técnica ha demostrado ser valiosa en la detección de CMV en biopsias GI, y es particularmente útil en los casos de tinción IHC equívocos 5,6. También, qPCR también se ha demostrado que se correlaciona bien con los datos de prueba de CMV clínico adicional cuando está disponible 6. El uso de qPCR para detectar CMV puede llevar a un diagnóstico precoz y el tratamiento en los casos en que la sospecha clínica para el CMV es alta, pero H & E y CMV IHC son negativos.
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Protocol
Con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional, se realizó una búsqueda en la base de datos de laboratorio electrónico para identificar fijado en formol e incluido en parafina (FFPE) bloques que representan los casos de infección por citomegalovirus (CMV) en gastrointestinal (GI) biopsias diagnosticadas por histopatología (hematoxilina y eosina (H & E) y / o inmunohistoquímica (IHC)).
1. Procesamiento de tejido de FFPE GI biopsia de tejido
- Recoger FFPE GI bloques de tejido de biopsia para el citomegalovirus (CMV) reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Estos bloques se almacenan a temperatura ambiente.
- Tubos Pre-label 1,7 ml de microcentrífuga con número de identificación único de la cuadra.
- Bloquee el volante microtomo.
- Asiente el bloque de tejido en la abrazadera de cassette.
- Utilizando una cuchilla nueva sin usar, alinee el bloque al ángulo cuchillo en el microtomo.
- Ajuste el micrótomo para cortar 10 micras de espesor secciones.
- Desbloquear ªe volante y avanzar el bloque hacia la hoja.
- Cortar 5 secciones del bloque a intervalos de espesor 10 micras, permitiendo que cada corte a rodar en un rollo de tejido. Asegúrese de que cada rollo contiene una representación adecuada de los tejidos de biopsia deseados.
- Bloquee el volante microtomo.
- Con unas pinzas, colocar todos los 5 rollos de tejido en el tubo de centrífuga de pre-marcado, teniendo cuidado de sólo manipular el desplazamiento por la parafina con el fin de reducir el potencial de contaminación cruzada. Coloque la tapa en el tubo y colocarlo de nuevo en el estante.
- Retire el bloque de tejido del microtomo.
- Retire y deseche la hoja.
- Descontaminar las superficies o utensilios que puedan haber estado en contacto con el tejido anterior.
- Coloque una hoja nueva sin usar en el soporte de la cuchilla.
- Repetir los pasos 1.4 a 1.14 para cada bloque adicional para ser procesado. Los tubos de microcentrífuga que contenían los rollos de tejido se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta que el time de la extracción de ADN.
2. Extracción de ADN de Rollos de FFPE GI biopsia de tejido
NOTA: Este protocolo es una adaptación del prospecto del kit FFPE tejido de ADN de extracción (PRECAUCIÓN: consulte la Hoja de Seguridad (MSDS)).
- Añadir 1 ml de xileno (PRECAUCIÓN: Consulte la MSDS) para cada tubo de microcentrífuga muestra. Cierre la tapa y agitar vigorosamente durante 10 segundos.
- Proceder a la extracción de ADN específicamente indicado en el prospecto del producto del fabricante con las siguientes modificaciones.
- En primer lugar añadir 6 l de la de control interno (IC) a cada tubo de microcentrífuga.
- Después de la ATL / proteinasa K de incubación de lisis a 56 º C durante 1 h, se incuba a 99 ° C durante 30 min, en lugar de 90 ° C durante 1 hora.
- Durante el paso final de elución de ADN, abrir con cuidado la tapa de la columna de purificación de ADN y aplicar 50 l de DNasa / RNasa libre de agua destilada en el centro de la membrana, en lugar de Buffer ATE.
NOTA: Consulte el prospecto del envase para el almacenamiento y preparación de reactivos apropiada. ADN debe ser extraído de los 5 rollos FFPE. Realizar todos los pasos de centrifugación a temperatura ambiente (15-25 ° C).
3. QPCR para CMV
- Reacción en Cadena de la Polimerasa Procedimiento (PCR)
- Generar una hoja de cálculo Excel de PCR para el ensayo de ejecución CMV. Esta hoja de cálculo Excel calcula la cantidad total de cada reactivo necesario para constituir la mezcla principal con Mg. Se multiplica la cantidad de cada reactivo necesario por muestra (enumerados a continuación) veces el número de muestras y controles más uno (para compensar la pérdida debido a la pipeteo).
- Incluir los siguientes reactivos en cada reacción de PCR en la cantidad que se indican:
Reactivo0; Cantidad por la muestra
Mix master LC CMV viales 12,5 l
Mg solución amarillo vial 2,5 l
Volumen total 15,0 l
- Incluir los siguientes reactivos en cada reacción de PCR en la cantidad que se indican:
- Incluir en cada ensayo, ejecute un agua o ningún control de destino (NTC), control negativo, control positivo bajo, un alto control positivo, y, o bien QS3 o QS4, y todas las muestras de pacientes. Los capilares deben establecerse en este orden.
- Obtener el bloque de enfriamiento específica para el instrumento de PCR en tiempo real que se almacena a 4 ° C. Colocar los tubos capilares apropiados en el bloque de refrigeración. No toque la superficie de los tubos capilares. Siempre use guantes al manipular los capilares.
- Configure todas las reacciones en cadena de la polimerasa en una campana limpia no contaminada con la producción de amplificaciónts.
- Retire el número correcto de los viales principales del kit de PCR para probar todas las muestras de los pacientes, además de 5 controles. Deje los viales principales, solución de Mg y PCR grado descongelamiento en agua en el bloque de refrigeración. Cada vial principal contiene suficientes reactivos para 12 pruebas.
- Agite suavemente los viales principales y rápido hacerlos girar en la centrífuga a la máxima velocidad.
- Combine el contenido de cada vial principal en un vial y agite suavemente de nuevo.
- Combine la mezcla maestra y la solución de Mg en las cantidades indicadas en la hoja de PCR en un tubo de microcentrífuga estéril individual.
- Mezclar suavemente y alícuota de 15 l de mezcla maestra con Mg en cada tubo capilar, excepto el capilar en la posición 5, que es para el estándar de cuantificación (QS).
- Mueva el bloque de refrigeración que contienen los tubos capilares y maestro de la mezcla con Mg de la campana limpia a una campana de procesamiento.
- Añadir 2 l de control interno (CI) a los restantes 30 l de mastermezclar con Mg. Mezclar suavemente y alícuota de 15 l en el capilar en la posición 5 (posición para el QS).
- De pipeta 10 l de agua, control de ADN, o ADN de la muestra en el tubo capilar apropiado. Tape los tubos capilares utilizando la herramienta de nivelación.
- Tome de refrigeración de bloque / muestras al instrumento de PCR en tiempo real.
- Generar una hoja de cálculo Excel de PCR para el ensayo de ejecución CMV. Esta hoja de cálculo Excel calcula la cantidad total de cada reactivo necesario para constituir la mezcla principal con Mg. Se multiplica la cantidad de cada reactivo necesario por muestra (enumerados a continuación) veces el número de muestras y controles más uno (para compensar la pérdida debido a la pipeteo).
- Programar el tiempo real de instrumentos PCR (véase la Tabla 1)
- La amplificación y la detección realizada en el instrumento de PCR en tiempo real
- Inicie sesión en el ordenador
- Doble clic en el icono de instrumento e iniciar sesión en el software.
- Encienda el instrumento de PCR en tiempo real
- Haga clic en "CMV / EBV" en la pantalla frontal.
- Siga las instrucciones del asistente de macro.
- Seleccione la casilla para ejecutar una auto-prueba cuando lo solicite el software. Un auto-prueba debe realizarse una vez al día el instrumento está en uso.
- Nombre de la carrera.
- Ajuste el recuento de muestras ubicado en el lef superiort esquina de la página a la suma de los controles y los pacientes incluidos en el período previo e introduzca el número de identificación de cada muestra.
- Haga clic en la pestaña "Abs Quant".
- En "Tipo de muestra", asigne el tipo de muestra adecuado para el estándar.
- Escriba las concentraciones esperadas para el estándar de cuantificación (QS).
- Retire los tubos capilares del bloque refrigerador y colocarlos en la posición correspondiente en el carrusel (refrigeración del bloque de la muestra # 1 debe colocarse en la posición # 1 en el carrusel, etc.)
- Coloque el carrusel en centrifugar y pulse inicio del instrumento.
- Abra centrífuga y quitar el carrusel.
- Coloque el carrusel en el instrumento de PCR en tiempo real. Cierre la tapa.
- Pulse el botón "Ejecutar".
- El instrumento de PCR en tiempo real comprobará cada posición para una muestra. No te alejes del instrumento hasta que este control se ha completado, espetodo si uno de los capilares no es en el carrusel. El instrumento en cuenta esto y preguntar si la carrera se va a continuar. Conteste sí antes de salir.
- Una vez que el plazo se haya completado, cierre el informe que se ha generado.
- Haga clic en "Absolute cuantificación".
- Haga clic en la flecha situada junto a Color de Compensación.
- Haga clic en "Seleccionar color de Compensación" en el cuadro desplegable.
- Elija el archivo de compensación de color más actual para aplicar a la carrera.
- Haga clic en Aceptar cuando la caja se abre.
- Haga clic en la flecha de la curva estándar.
- Seleccione "uso externo" en el menú desplegable.
- Seleccione el archivo de curva estándar externa más reciente, haga clic en Aceptar.
- Mire cada curva en el menú absoluta cuantificación para garantizar que las curvas están presentes y no la línea plana, si se asigna una concentración. La cuantificación absoluta para el 705/Back 530 se analiza de forma automática.
- QuControl alidad
- Generar una nueva curva estándar cada vez que se recibe un nuevo número de lote de reactivos, o cada seis meses, lo que es más frecuente.
- Añadir 10 l de cada norma a la mezcla principal con Mg. Tenga en cuenta las normas que se incluyen con el kit como el ADN extraído previamente.
- Añadir 1 l de control interno para cada estándar a la mezcla principal con Mg usado en la generación de la curva estándar con el fin de asegurar la cuantificación exacta. No agregue IC a la mezcla principal con Mg para el Control Template No (NTC).
- Preparar una NTC y tres repeticiones de cuantificación Normas QS 4, 3, 2, 1, y una dilución 1:10 de QS4 para la ejecución para generar la curva estándar, con un total de 16 puntos de datos.
- Seleccione "reproduce las directrices" en el menú desplegable para las normas repetidas
- Elija el canal ninguno 530/back y encienda la compensación de color cuando se analiza la carrera,
- En "Curva Estándar (En ejecución)", seleccione "guardar como exinterno "y el nombre de la curva. Introduzca el comentario "aplicado como curva estándar" al guardar.
- Representa gráficamente los resultados. El coeficiente de linealidad resultante debe ser ≥ 0,81.
- Para tiradas diarias, incluya una copia de QS3 o QS4 como control en la carrera. La curva de corriente estándar externo se puede importar a la carrera durante la fase de análisis.
- Ejecutar controles: sin control de ADN, control negativo, bajos, y controles positivos altos. Carga viral esperado se determina y se ajusta para cada proveedor y número de lote.
- Añadir un IC a cada muestra y control durante la extracción de ADN.
- Si cualquiera de los controles caen fuera de rango, registre los resultados inaceptables y referir el ensayo para la solución de problemas.
- Frecuencia de los controles
- Incluir en cada carrera: a NTC, positivo alto, y el nivel de control negativo, positivo bajo,.
NOTA: Los límites aceptables para los controles. Sin picos se deben observard para el sin plantilla (NTC) y controles negativos. Los picos deben estar presentes en el canal 530 y una carga viral esperados son determinados y ajustados para cada proveedor y el número de lote de los controles positivos bajos y altos.
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Representative Results
Un total de 228 bloques de tejido fueron probados por reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR), que se compone de 91 citomegalovirus (CMV) casos positivos sobre la base de la histología e inmunohistoquímica positiva (IHC), 18 con equívoca CMV IHC, y 79 controles negativos. Como se ilustra en la Figura 2, los casos de CMV positivos se han demostrado inclusiones típicas de CMV virales (A) y / o tinción IHC positivo (B). Casos dudosos se han demostrado patrones raros, no clásicas que aparecen tinción (C), mientras que los controles negativos hubieran mostrado ninguna histología sospechosa o IHC tinción 5.
De 91 biopsias positivas para el CMV por histopatología, 88 fueron positivos por PCR cuantitativa (Tabla 2). Con una verdadera definición positiva basada en la histología tradicional, es decir, las inclusiones virales típicas de CMV y / o típico CMV IHC, estos datos resultaron en una sensibilidad del 96,7%.
Catorce de 18 (78%) biopsias con tinción IHC CMV equívoca dieron positivo para CMV por qPCR 5. Entre estos 18 casos dudosos, once tenían biopsias adicionales tomadas el mismo día en que fueron positivos para CMV por histopatología. Entre estas 14 muestras qPCR positivas, 10 tenían biopsias tomadas el mismo día en que fueron positivos para CMV en la histopatología. De las 18 biopsias equívocos ensayadas, 11 tenían información clínica adicional con respecto a las pruebas de CMV en otras muestras presentadas en o dentro de 7 días del momento de la biopsia fue tomada. Entre estos 11 casos, 8 (73%) dieron positivo para CMV por qPCR. De estos 11 biopsias, 5 (45%) dieron positivo por qPCR con muestras CMV positivos adicionales; 3 (27%) resultaron positive por qPCR sin muestras CMV positivos; 3 (27%) resultaron negativos por qPCR con muestras CMV negativos adicionales.
Además de los estudios mencionados anteriormente, que era de interés para determinar si los niveles de obtención adicionales hematoxilina y eosina (H & E) sería beneficiosa en los casos en que no hay inclusiones virales se ven en H & E inicial y CMV IHC es equívoca. Por lo tanto, se realizaron H & E niveles veces 5 para cada uno de los 18 bloques con equívoca CMV IHC. Dos patólogos examinaron detenidamente estos casos y no pudieron identificar inclusiones virales perceptibles en cualquiera de las diapositivas adicionales (datos no presentados).
| Parámetros de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real sugeridos | ||||||
| Lecturas de instalación: | ||||||
| Canal por defecto | Busque Temperatura | Max Seek Pos Tipo de equipo | Capilar Tamaño | |||
| 530 | 30 ° C | 12 | 6 canales | 20 l | ||
| Nombre del programa: La activación de la enzima | ||||||
| Número de ciclos: 1 | ||||||
| Modo de análisis: Ninguno | ||||||
| Objetivo ° C | Mantenga hh: mm: ss | Velocidad de rampa | Sec Target | Tamaño de paso | Paso de retardo | Modo de adquisición |
| 95 | 0:10:00 | 20 | 0 | 0 | 0 | Ninguno |
| Nombre del programa: Aterrice paso | ||||||
| Número de ciclos: 10 | ||||||
| Modo de análisis: Ninguno | ||||||
| Objetivo ° C | Mantenga hh: mm: ss | RAMp Cambio | Sec Target | Tamaño de paso | Paso de retardo | Modo de adquisición |
| 95 | 0:00:05 | 20 | 0 | 0 | 0 | Ninguno |
| 65 | 0:00:20 | 20 | 55 | 1 | 1 | Ninguno |
| 72 | 0:00:15 | 20 | 0 | 0 | 0 | Ninguno |
| Nombre del programa: La amplificación del ADN | ||||||
| Número de ciclos: 40 | ||||||
| Modo de análisis: Cuantificación | ||||||
| Objetivo ° C | Mantenga hh: mm: ss | Velocidad de rampa | Sec Target | Tamaño de paso | Paso de retardo | Modo de adquisición |
| 95 | 0:00:05 | 20 | 0 | 0 | 0 | Ninguno |
| 55 | 0:00:20 | 20 | 0 | 0 | 0 | Solo |
| 72 | 0:00:15 | 10 | 0 | 0 | 0 | Ninguno |
| Nombre del programa: Refrigeración | ||||||
| Número de ciclos: 1 | ||||||
| Modo de análisis: Ninguno | ||||||
| Objetivo ° C | Mantenga hh: mm: ss | Velocidad de rampa | Sec Target | Tamaño de paso | Paso de retardo | Modo de adquisición |
| 40 | 0:00:30 | 20 | 0 | 0 | 0 | Ninguno |
Tabla 1. Los parámetros enumerados deben utilizarse como una guía para temperaturas objetivo, número de ciclos y la duración del ciclo en la puesta a punto de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para la detección de cytomegalovi rus en fijado en formol, biopsias gastrointestinales incluidos en parafina. Estos parámetros pueden requerir optimización, dependiendo del modelo y fabricante del instrumento.
| Histología casos positivos | Casos positivos de PCR | Sensibilidad | Histología casos negativos | PCR casos negativos | Specitivity |
| 91 | 88 | 96,7% | 79 | 78 | 98,7% |
Tabla 2. Sensibilidad (96,7%) y especificidad (98,7%) de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) en la detección de citomegalovirus en fijado en formol, biopsias gastrointestinales incluidos en parafina. Este cuadro ha sido modificado de McCoy et al 5.
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Figura 1. Un microtomo típico con el bloque de tejido sentado correctamente en el cassette de abrazadera A) Como se corta una sección de espesor 10 micras de tejido de la biopsia se le permite rodar en un rollo B), que se transfiere a un tubo de microcentrífuga C). Todos los cinco rollos de tejido de la biopsia se colocan en un solo tubo de microcentrífuga para la extracción de ADN.
Figura 2. A) Hematoxilina y eosina sección teñida de una biopsia de colon que muestra abundantes, inclusiones típicas de CMV como se indica por las flechas (magnificación original 400X). B) Una biopsia de colon teñidas con un anticuerpo monoclonal contra el CMV que muestra el patrón esperado tinción IHC (original un aumento de 400x).
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Discussion
Muchos métodos de laboratorio están disponibles para el diagnóstico de la infección por citomegalovirus (CMV), incluyendo serología, el cultivo viral, los ensayos moleculares de viremia, la histología de las biopsias, y, como se ha demostrado recientemente, ensayos moleculares de fijado en formol (FFPE) biopsia incluido en parafina 5,6 tejido. Serología, una vez a la base del diagnóstico, sólo identifica fiablemente la exposición y no se correlaciona bien con la infección aguda por citomegalovirus 7. El cultivo viral, tanto convencional y principios de antígeno Shell Vial, se ve obstaculizada por largos tiempos de ensayo, en el mejor de 2-3 días en el caso de este último 8. Ensayos de viremia moleculares se han desarrollado, la mayoría tiene la ventaja de ser cuantitativa con el potencial de la eficacia del tratamiento de monitoreo 9-11. Por desgracia, cuando existe la preocupación clínica para la participación local del tracto gastrointestinal (GI), los ensayos de viremia reflejan afectación sistémica y no identifican específicamente la infección localizada. Por lo tanto, histology ha sido el estándar de oro para la identificación de la infección por CMV del tracto GI.
Es crucial identificar infecciones activas CMV del tracto GI en pacientes inmunodeprimidos, como las personas con VIH / SIDA, en la quimioterapia, o de órganos / trasplantes de células madre, dado su mayor riesgo de desarrollar una infección grave. Se informó de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) es un método altamente sensible y específico para detectar CMV en biopsias GI 5. Resultados similares han sido apoyados por otros estudios 6.
Aunque todas las medidas a lo largo del procedimiento son importantes, hay algunos pasos críticos principales que merecen una consideración especial. Durante el procesamiento de tejido en el micrótomo, es imperativo la cuchilla puede cambiar entre cada muestra para reducir la posibilidad de contaminación cruzada entre las muestras. Del mismo modo, la descontaminación de áreas en el microtomo el tejido puede haber entrado en contacto con el uso de un REC limpiador adecuadoapruebe o recomiende el fabricante del micrótomo también reducirá este riesgo.
Un paso clave adicional durante el protocolo es la adición del control interno IC (paso 2.3) a la muestra durante la extracción de ADN, que actúa como un control tanto para el proceso de extracción y amplificación. La amplificación y detección de la IC no interfieren con la amplificación del CMV, ya que la detección del virus de CMV se produce en el canal 530, mientras que la detección de la IC se produce en el canal 705. Cada laboratorio debe establecer un rango aceptable para el IC. Después de la extracción, no es necesario evaluar la calidad del ADN. En otras palabras, la determinación espectrofotométrica de la concentración de ADN no se realiza rutinariamente después del aislamiento de ADN. Si se añade antes de la extracción de ADN, la IC actúa como un control para el proceso de extracción. Alternativamente, 1 l de IC se pueden añadir a cada mezcla de reacción con Mg vial. Si se añade a la mezcla principal con Mg, el IC actúa sólo como una amplificación Control.
También es imprescindible que durante la puesta a punto de todas las reacciones de qPCR que una campana limpia (incluyendo pipetas y puntas) se utiliza para el reactivo configurado. Esta campana no debe tener cualquiera de los productos de amplificación, es decir, puesto a tiempo real o PCR convencional, manipulados dentro de ella. Estos productos de amplificación podrían convertirse en aerosol y contaminar reacciones posteriormente preparados qPCR que conducen a resultados positivos falsos. Muchos laboratorios incluso van tan lejos como capuchas y equipos que designan para pipetear los reactivos que no son ácidos nucleicos y una segunda campana y equipos para la adición de muestras y el control de ácido nucleico. Cada laboratorio debe decidir lo que funciona mejor dadas sus limitaciones de espacio individuales.
Solución de problemas de resultados inesperados, puede ser necesario durante el procedimiento. Si no hay pruebas de amplificación de la IC (es decir, la línea plana) de una muestra, se recomienda repetir primero la reacción de qPCR de la extracti ADN originalen para asegurar un error de pipeteado no ocurrió durante la preparación de la muestra de reacción. Si el CI se mantiene en una línea plana en la reacción de repetición y no hay suficiente tejido de la biopsia restante, una segunda extracción de ADN puede realizarse, siendo consciente para añadir el IC durante el proceso de extracción. Si este volvió a extraer la muestra también demuestra una línea plana IC, es probable que haya un inhibidor de la reacción presente en la muestra original. En este caso, el resultado de la prueba sería indeterminada para la detección de CMV desde el control de la reacción de qPCR no llevó a cabo apropiadamente.
Si el agua, no hay control de destino (NTC) demuestra la amplificación de la diana, se recomienda primero analizar la tasa de positividad de la carrera. Si la carrera tiene una tasa superior a la positividad de lo normal, se recomienda realizar pruebas de frotis de las zonas donde se realiza cualquier manipulación de reactivos para identificar cualquier tipo de contaminación ambiental potencial. Si la contaminación ambiental se descarta, utilice uncontrol de agua recién inaugurado junto con los controles positivos habituales. Si el control del agua de reciente apertura no muestra un producto de amplificación, es probable que el control del agua anterior estaba contaminada con secuencia diana. Sin embargo, si este nuevo control de agua está contaminado de nuevo, se plantea la posibilidad de que alguno o todos los reactivos o capuchas están contaminados con secuencia diana. En este caso, sería mejor para descontaminar todas las campanas de extracción durante el proceso y después utilizar todos los nuevos reactivos en el funcionamiento de un nuevo conjunto de controles (positivo y el agua). Si el problema persiste, una reevaluación del flujo de trabajo en las áreas de procesamiento y capuchas, así como ponerse en contacto con los fabricantes de productos se debe hacer.
Si los estándares de calidad (QS) incluidos en el plazo no demuestran el número de copias apropiado durante la amplificación, se recomienda ejecutar primero todo el QS (4, 3, 2, 1, y una dilución 1:10 de QS4). Si estas normas se encuentran dentro de los rangos adecuados, a continuación, repitalas muestras como anteriormente especificados con los controles apropiados. Si los QS no caen dentro de los rangos adecuados, a continuación, generar una nueva curva estándar como se describe en la sección de control de calidad del protocolo (3.4). Si el problema persiste, la generación de una nueva curva estándar con QS reciente apertura de la corriente o un número de lote nuevo se puede intentar. Si estos pasos no tienen éxito, ponerse en contacto con el fabricante estaría justificado.
Aunque la sensibilidad y especificidad de qPCR para la detección de CMV en las biopsias GI basado en cálculos realizados utilizando métodos convencionales (H & E e IHC) como el patrón oro no demuestran de inmediato una ventaja de diagnóstico, utilizando el método de qPCR analíticamente más sensibles como el patrón oro mejora en gran medida estos cálculos 5. Además, 14 (78%) de las 18 biopsias equívocos dio positivo por CMV por qPCR en este estudio. Se considera estos puntos apoyan la noción de que la qPCR es mucho más sensible que cualquiera de H &E sola, o en combinación con IHC en la detección de CMV en material de biopsia GI. Además, en los casos con patrones de tinción IHC equívocos, es poco probable que sea de cualquier beneficio adicional la obtención de niveles adicionales en comparación con los métodos estándar actuales.
Tomados en conjunto, qPCR es altamente sensible y específico para detectar la infección por CMV en tejido de biopsia de FFPE GI. Particularmente útil es la actuación de qPCR en biopsias gastrointestinales con patrones equívocos tinción IHC CMV o clínicamente muy sospechoso para el CMV. En comparación con la histología tradicional, las pruebas de qPCR de material de biopsia de GI puede facilitar un diagnóstico preciso en un corto período de tiempo, lo que conduce a una gestión más eficaz del paciente antes y.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Reconocemos Amy Thomasson por su ayuda en la preparación de este manuscrito, y Fredrik Skarstedt y Ryan Christy por sus esfuerzos en la preparación de las figuras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml Microfuge tubes | Costar | 3620 | |
| Serrated forceps | Electron Microscopy Services | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Tabletop centrifuges (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| Microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation Kit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μl Capillaries | Roche | 1 909 339 | |
| Blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
References
- Hodinka, R. L. Manual of Clnical Microbiology. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers. The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).
- Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers. JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).
- Pass, R. F., et al. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).
- McCoy, M. H., et al. qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies. Human Pathology. 45, 48-53 (2014).
- Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).
- Krech, U. Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world. Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).
- Chou, S. Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection. Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).
- Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections. Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).
- Revello, M. G., et al. Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy. The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).
- Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease. The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).
